Name: בדיקת יעילות In Vitro ו-In Vivo של ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: למד לנסח חלקיקי ננו-ליפידים המכילים mRNA לבדיקת יעילות in vitro בתאי HepG2 ובהזרקה בעכברי C57BL/6. פרוטוקול זה מאפשר השוואה עקבית של תכונות החלקיקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.J.M. מודה על תמיכתו של מנהל המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (NIH) פרס החדשן החדש (DP2 TR002776), פרס הקריירה של קרן Burroughs Wellcome בממשק המדעי (CASI), פרס CAREER של הקרן הלאומית למדע של ארה"ב (CBET-2145491), ומימון נוסף מהמכונים הלאומיים לבריאות (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 ו- NIDDK R01 DK123049).

הערה: יש לשמור תמיד על תנאים נטולי RNase בעת גיבוש mRNA-LNPs על ידי ניגוב המשטחים והציוד עם מזהם פני השטח עבור RNases ו- DNA. השתמש רק טיפים וריאגנטים ללא RNase.
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת פנסילבניה ולפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת פנסילבניה.
1. הכנה מוקדמת לפורמולציה
<ol><li>מלאו נקייה בנפח 4 ליטר במי מלח טריים חוצצים בפוספט (PBS) בנפח 200-300 מ"ל.<ol><li>דללו את 10x PBS בכד פי 10 עם מים טהורים במיוחד כדי לקבל של 1x PBS. ודא שהנפח הסופי של PBS 1x הוא בין 2-3 ליטר.</li>
		<li>הניחו את קלטות הדיאליזה (חיתוך משקל מולקולרי של 20 kDa [MWCO]) בעלות הקיבולת המתאימה לפורמולציית LNP לתוך הכד הממולא כדי ללחלח אותן. הערה: קלטות דיאליזה דורשות מינימום של 2 דקות כדי להתייבש לפני השימוש.</li>
		<li>מניחים מוט ערבוב לתוך הכד, ומכסים את הכד ברדיד אלומיניום.</li>
		<li>הניחו את הכד המכוסה על צלחת ערבוב מגנטית. הפעל את צלחת הערבוב, והגדר אותו להסתובב ב 300-400 סל"ד.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לדלל מאגר של 100 mM חומצת לימון (pH 3) פי 10 במים טהורים במיוחד כדי ליצור את מאגר חומצת הלימון של 10 mM המשמש לדילול mRNA.</li>
	<li>הפוך C12-200 שומנים מיוננים, שומנים עוזרים, כולסטרול ושומנים מעוגני שומנים PEG (ליפידים-PEG) על ידי המסת כל ליפיד באתנול 100%. ריכוזי מרכיבי השומנים מפורטים בטבלה 1.<ol><li>חממו וערבבו את תמיסות המלאי בטמפרטורה של 37°C כדי להבטיח שהן מומסות במלואן.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת תערובות שומנים וחומצות גרעין
<ol><li>חשב את הנפחים הנדרשים של שומנים מיוננים, שומנים מסייעים, כולסטרול וליפיד-PEG בהתבסס על היחס המולרי הרצוי ויחס משקל השומנים המיוננים ל-mRNA (טבלה 1). הכינו 10% נפח נוסף של השלב האורגני כדי להתחשב בנפח מת במזרקים במהלך הפורמולה.<ol><li>שלב את הכרכים המחושבים של רכיבי השומנים השונים בצינור חרוט.</li>
		<li>לדלל את השומנים עם 100% אתנול עד נפח סופי, V, המייצג 25% מהנפח הסופי של LNP.</li>
	</ol></li>
	<li>חשב את כמות ה-mRNA הנדרשת לניסוח בהתבסס על יחס משקל השומנים המיוננים ל-mRNA והנפח הכולל של mRNA-LNP הדרוש (טבלה 1).<ol><li>הפשירו את ה-mRNA המקודד לוציפראז על קרח.</li>
		<li>מדללים את ה-mRNA לנפח סופי, 3וולט, פי שלושה מנפח הפאזה האורגנית, במאגר חומצה ציטרית של 10 מילימול. הערה: כל נפח שומנים, V, חייב להכיל מספיק שומנים מיוננים עבור mRNA מדולל ב 3V. זה מתאים ליחס השומנים המיוננים הרצוי למשקל mRNA.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניסוח מיקרופלואידי של mRNA-LNPs
<ol><li>רססו מגבון משימה עדין עם מזהם פני השטח עבור RNases ו- DNA, ונגבו היטב את פנים המכשיר המיקרופלואידי.<ol><li>פתח מחסנית מיקרופלואידית חדשה והכנס אותה כאשר תעלות הכניסה פונות כלפי מטה והחוצה.</li>
		<li>ודא שזרוע הצינור החרוטי מחזיקה שני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל ונמצאת במיקום הרחוק ביותר מימין.</li>
		<li>הגדר שני צינורות חרוטיים סטריליים של 15 מ"ל על המחזיק כשהמכסים כבויים.</li>
	</ol></li>
	<li>מלאו מזרק 5 מ"ל בתמיסת mRNA המכילה mRNA מדולל במאגר חומצת לימון 10 mM.<ol><li>ממלאים מזרק 3 מ"ל בתמיסת השומנים המכילה את השומנים המדוללים באתנול טהור 100%.</li>
		<li>הפוך את מחזיק המחסנית במכשיר המיקרופלואידי.</li>
		<li>הכנס את מזרק 5 מ"ל, ללא המחט, המכיל mRNA לתוך הכניסה השמאלית של המחסנית.</li>
		<li>הכנס את מזרק 3 מ"ל, ללא המחט, המכיל שומנים לתוך הכניסה הימנית של המחסנית.</li>
		<li>הפוך את מחזיק המחסנית בחזרה כלפי מטה, וסגור את מכסה המכשיר המיקרופלואידי.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעל את המכשיר המיקרופלואידי באמצעות המתג הממוקם בגב המכשיר.<ol><li>בחר הפעלה מהירה.</li>
		<li>בחר את סוגי המזרקים הנכונים עבור מזרקים 5 מ"ל ו -3 מ"ל שהוכנסו.</li>
		<li>הזן את הפרמטרים עבור ניסוח mRNA-LNP ביחס קצב זרימה מימי לאורגני של 3:1 כמתואר בטבלה 2.</li>
		<li>לחץ על הלחצן הבא כדי לעבור למסך הבא.</li>
		<li>ודא שהפרמטרים הנכונים הוזנו.</li>
		<li>לחץ על לחצן התחל כדי לנסח את mRNA-LNPs.</li>
	</ol></li>
</ol>4. עיבוד ואפיון לאחר ניסוח של mRNA-LNPs
<ol><li>טען את mRNA-LNPs שנאספו בצינור החרוטי הימני לתוך קלטות דיאליזה hydrated בעבר. הערה: אין לנקב או לפגוע בקרום הקלטת בעת טעינת mRNA-LNPs. אם הממברנה ניזוקה, mRNA-LNPs יאבדו בעת הטעינה.<ol><li>הניחו את קלטות הדיאליזה המכילות את ה-mRNA-LNPs בחזרה לתוך הכד המכיל PBS 1x, והניחו אותן לדיאליזה למשך שעתיים לפחות.</li>
		<li>לאחר הדיאליזה, הביאו את קלטות הדיאליזה המכילות את ה-mRNA-LNPs לארון בטיחות ביולוגי סטרילי, והוציאו את ה-mRNA-LNPs באמצעות מזרק עם מחט.</li>
		<li>מסננים סטריליים את ה-mRNA-LNPs באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר, ואוספים אותם בצינור חרוטי סטרילי.</li>
		<li>מניחים 65 μL של תמיסת mRNA-LNP לתוך מיקרו-צינור 1.5 מ"ל למטרות אפיון.</li>
	</ol></li>
	<li>לדלל 10 μL של mRNA-LNPs 1:100 ב 990 μL של 1x PBS בקובט למדידת גודל הידרודינמי ואינדקס polydispersity באמצעות פיזור אור דינמי.</li>
	<li>להעריך את יעילות הריכוז והאנקפסולציה של mRNA-LNPs באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות (כלומר, RiboGreen).<ol><li>הכינו תמיסת מלאי של 1x TE buffer על ידי דילול חיץ TE 20x עם מים ביולוגיים מולקולריים.</li>
		<li>הכן תמיסת מלאי של 1% מאגר Triton X-100 על ידי דילול Triton X-100 עם מאגר TE אחד.</li>
		<li>הכן את מגיב פלואורסצנטי על ידי דילול מלאי מגיב 1:200 עם 1x TE buffer.</li>
		<li>לדלל את mRNA-LNPs 1:100 ב 1x TE חיץ 1% 1% Triton X-100 בלוח שחור דופן 96 באר ב 100 μL.</li>
		<li>הכינו עקומת תקן לטווח נמוך על ידי דילול תקן הרנ"א בהתאם להוראות היצרן, ולוחמו את העקומה הסטנדרטית בלוח 96 הקידוחים.</li>
		<li>הוסף 100 μL של מגיב פלואורסצנטי מדולל לכל באר המכילה mRNA-LNP מדולל או תקן מדולל.</li>
		<li>מניחים את הצלחת בת 96 הבארות בתוך קורא צלחות, ומנערים במשך דקה, ולאחר מכן 4 דקות המתנה.</li>
		<li>מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל באר בהתאם לפרוטוקול היצרן בעירור/פליטה של 480 ננומטר/520 ננומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי להמיר את ערכי הפלואורסצנטיות לריכוזים.<ol><li>חישוב יעילות האנקפסולציה על ידי הפחתת הערך המתקבל מדילול LNPs במאגר TE (mRNA unencapsulated) מהערך המתקבל מדילול LNPs ב-1% Triton X-100 (סה"כ mRNA) וחלוקה בערך המתקבל מדילול LNPs ב-1% Triton X-100, על פי משוואה 4.4.</li>
		<li>חשב את ריכוז mRNA-LNP המשמש למחקרים בתאים ובבעלי חיים על ידי הפחתת הערך המתקבל מדילול LNPs במאגר TE (mRNA unencapsulated) מהערך המתקבל מדילול LNPs ב- 1% Triton X-100 (סך mRNA).</li>
	</ol></li>
	<li>למדוד את pKa של mRNA-LNPs על ידי ביצוע 6-(p-toluidino)-2-naphthalenesulfonyl כלוריד (TNS) בדיקה.<ol><li>הכן את מגיב TNS על ידי יצירת תמיסה של 0.16 מילימטר של TNS במים טהורים במיוחד. הערה: בעת השימוש בריאגנטים, הקפד לשמור אותו על קרח והרחק מאור כדי למנוע התפרקות.</li>
		<li>הכינו תמיסות חוצצות של 150 מ"מ נתרן כלורי, 20 מ"מ נתרן פוספט, 25 מ"מ אמוניום ציטראט ו-20 מ"מ אמוניום אצטט המותאמות לערכי pH שונים הנעים בין 2 ל-12 במרווחים של 0.5.</li>
		<li>הוסף 2.5 μL של LNP לכל תמיסת חיץ מותאמת pH בלוח שחור עם תחתית של 96 בארות.</li>
		<li>הוסף מגיב TNS לכל באר כך שהריכוז הסופי של TNS הוא 6 מיקרומטר.</li>
		<li>דוגרים על הצלחת בת 96 הבארות במקום חשוך למשך 5 דקות.</li>
		<li>מדוד את הפלואורסצנטיות בעירור/פליטה של 322 ננומטר/431 ננומטר באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים.</li>
		<li>התאימו את הנתונים לעקומה סיגמואידית, וחשבו את pKa באמצעות המשוואה המותאמת כדי למצוא את ה- pH שבו נצפתה 50% מהעוצמה המקסימלית.</li>
	</ol></li>
	<li>תוצאות מייצגות עבור גודל הידרודינמי mRNA-LNP, PDI, יעילות אנקפסולציה ו-pKa מוצגות בטבלה 3.</li>
</ol>5. טרנספקציה חוץ גופית של תאי HepG2
הערה: קווי תאים שונים אחרים, כגון תאי HeLa או תאי HEK-293T, עשויים לשמש להערכת יעילות הטרנספקציה של LNPs במבחנה. כל התאים צריכים לבדוק שלילי עבור mycoplasma לפני מחקרי טרנספקציה LNP.
<ol><li>צלחת 5,000 תאי HepG2 בכל באר של צלחת בעלת דופן לבנה בעלת תחתית שקופה של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים שלם (DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין)<ol><li>השאירו את התאים להיצמד למשך הלילה באינקובטור CO 2 מבוקר בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>לדלל את mRNA-LNPs בתווך תרבית תאים מלאה, כך המינון הכולל מועבר ב 100 μL.<ol><li>הסר את המדיום המלא מהבארות.</li>
		<li>טפל בתאים עם mRNA-LNPs מדוללים בתווך תרבית תאים מלאה במינונים הרצויים או בתווך מלא (בקרה).</li>
		<li>הניחו את צלחת 96 הקידוחים המכילה את התאים המטופלים בחזרה לאינקובטור CO2 המבוקר למשך 24 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>להעריך את יעילות transfection על ידי ביצוע בדיקת luciferase.<ol><li>הכן את מגיב luciferase ואת 1x תא lysis buffer בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>הוציאו את צלחת 96 הקידוחים המכילה את התאים מהאינקובטור, והכניסו אותה לארון בטיחות ביולוגית.</li>
		<li>הסר את מדיום תרבית התאים מכל באר של צלחת 96 בארות.</li>
		<li>הוסף 20 μL של חיץ ליזיס 1x לכל באר, ואחריו 100 μL של מגיב הבדיקה luciferase שהוכן בעבר.</li>
		<li>הגן על הצלחת מפני אור, והנח את הצלחת בקורא לוחות כדי למדוד את האות הביו-לומינסנטי של כל באר. הערה: תוצאות מייצגות המדגימות את הטיפול בתאי HepG2 עם C12-200 mRNA-LNPs שנוסחו בעבר מוצגות באיור 1.</li>
	</ol></li>
</ol>6. הערכה In vivo של mRNA-LNPs בעכברים לאחר הזרקת וריד הזנב
<ol><li>לדלל את תמיסת mRNA-LNP עם PBS סטרילי 1x כך 2 מיקרוגרם של mRNA הכולל נמצא בנפח הזרקת 100 μL ורידי זנב, אשר מתאים למינון משקל גוף של כ 0.1 מ"ג / ק"ג עבור עכבר 20 גרם.</li>
	<li>יש לרסן כל עכבר בשיטה מאושרת, ולנגב את הזנב עם פד טבול ב-70% אלכוהול.<ol><li>מלא מזרק אינסולין 29 גרם עם 100 μL של mRNA-LNP (2 מיקרוגרם) או 100 μL של 1x PBS. הסר את כל הבועות מהמזרק.</li>
		<li>הכנס את המחט עם השיפוע הפונה כלפי מעלה לתוך וריד הזנב הצידי של העכבר, והזריק לאט את 100 μL של mRNA-LNP או 1x PBS.</li>
		<li>הסר את המחט ולהפעיל לחץ עד hemostasis מושגת.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו תמיסת ציר של 15 מ"ג/מ"ל מלח אשלגן d-luciferin ב-PBS סטרילי 1x 6 שעות לאחר ההזרקה.<ol><li>הפעל את מערכת ההדמיה in vivo (IVIS) ופתח את תוכנת ההדמיה.</li>
		<li>הקש Initialize כדי להכין את המכשיר לרכישת נתונים.</li>
		<li>סמן את התיבה לצד עוצמת האור והגדר את זמן החשיפה לאוטומטי. ודא שנבחר שדה הראייה הנכון למספר העכברים המצולמים.</li>
		<li>מתן 200 μL של d-luciferin intraperitoneally (150 מ"ג של luciferin לכל ק"ג משקל גוף) לעכברים שטופלו בעבר.</li>
		<li>הכניסו את העכברים לתא הרדמה המוגדר ל-2.5% איזופלורן וקצב זרימת חמצן של 2.0 ליטר/דקה.</li>
		<li>המתינו 10 דקות עד שאות הלוציפראז יתייצב לפני הדמיה של עכברים שטופלו ב-mRNA-LNP.</li>
		<li>ודא שהעכברים מורדמים לחלוטין, והפנה את קו ההרדמה למתן איזופלורן דרך חרוטי אף בתוך תא ההדמיה.</li>
		<li>העבירו את העכברים לקונוסים באף, וודאו שהם על הגב כשהבטן חשופה.</li>
		<li>סגור את דלת התא ולחץ על הלחצן Purchase בתוכנה כדי לקבל תמונות bioluminescence. הערה: תוצאות מייצגות עבור הדמיית כל הגוף של עכבר לאחר טיפול mRNA-LNP או 1X PBS מוצגות באיור 2.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+organ+targeting+%28SORT%29+nanoparticles+for+tissue-specific+mRNA+delivery+and+CRISPR-Cas+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li>
<li>Wood, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+approves+patisiran+to+treat+hereditary+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509(2018).</li>
<li>Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+of+patisiran%2C+the+first+approved+RNA+interference+therapy+in+patients+With+hereditary+transthyretin-mediated+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis.</a> Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).</li>
<li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li>
<li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li>
<li>Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery%3A+Applications+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).</li>
<li>Akhtar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+siRNA+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides.</a> Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).</li>
<li>Guimaraes, P. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizable+lipid+nanoparticles+encapsulating+barcoded+mRNA+for+accelerated+in+vivo+delivery+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening.</a> Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).</li>
<li>Qiu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle-mediated+codelivery+of+Cas9+mRNA+and+single-guide+RNA+achieves+liver-specific+in+vivo+genome+editing+of+Angptl3%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118(2021).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper+lipid+structure+influences+protein+adsorption+and+delivery+of+lipid+nanoparticles+to+spleen+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver.</a> Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).</li>
<li>El-Mayta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanoparticle+platform+for+accelerated+in+vivo+oral+delivery+screening+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids.</a> Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111(2021).</li>
<li>Patel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally-occurring+cholesterol+analogues+in+lipid+nanoparticles+induce+polymorphic+shape+and+enhance+intracellular+delivery+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.</a> Nature Communications. 11, 983(2020).</li>
<li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+lipid+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+delivery+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).</li>
<li>Cheng, X., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticles+%28LNPs%29+designed+for+oligonucleotide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).</li>
<li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).</li>
<li>Granot, Y., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+the+right+message%3A+Challenges+and+opportunities+in+lipid+nanoparticles-mediated+modified+mRNA+therapeutics-An+innate+immune+system+standpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint.</a> Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+containing+constrained+phospholipids+deliver+mRNA+to+liver+immune+cells+in+vivo+without+targeting+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161(2020).</li>
<li>Patel, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxycholesterol+substitution+in+ionizable+lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery+to+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells.</a> Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).</li>
<li>Robinson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle-delivered+chemically+modified+mRNA+restores+chloride+secretion+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis.</a> Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).</li>
<li>Love, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-like+materials+for+low-dose%2C+in+vivo+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li>
<li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+mRNA+delivery+for+human+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering.</a> Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).</li>
<li>Ramaswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+factor+IX+messenger+RNA+for+protein+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).</li>
<li>Leung, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+containing+siRNA+synthesized+by+microfluidic+mixing+exhibit+an+electron-dense+nanostructured+core%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core.</a> Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).</li>
<li>Billingsley, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+design+of+experiments+for+optimization+of+lipid+nanoparticles+for+mRNA+engineering+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells.</a> Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).</li>
<li>Khalil, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+D-luciferin+is+an+effective+alternative+to+intraperitoneal+injection+in+bioluminescence+imaging+of+xenograft+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice.</a> ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279(2013).</li>
<li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+peptide-based+lipids+for+targeted+mRNA+delivery+and+gene+editing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications.</a> RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).</li>
<li>Pardi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+kinetics+of+nucleoside-modified+mRNA+delivered+in+lipid+nanoparticles+to+mice+by+various+routes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes.</a> Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).</li>
<li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+administration+of+CRISPR%2FCas9+lipid+nanoparticles+achieves+robust+and+persistent+in+vivo+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li>
<li>Truong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle-targeted+mRNA+therapy+as+a+treatment+for+the+inherited+metabolic+liver+disorder+arginase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).</li>
<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-based+lipid+nanoparticles+deliver+therapeutic+FAH+mRNA+to+normalize+liver+function+and+extend+survival+in+a+mouse+model+of+hepatorenal+tyrosinemia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I.</a> Advanced Materials. 30 (52), 1805308(2018).</li>
<li>Sedic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+of+lipid+nanoparticle-formulated+modified+mRNA+in+the+Sprague-Dawley+rat+and+cynomolgus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey.</a> Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).</li>
<li>Veiga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+delivery+of+modified+mRNA+expressing+therapeutic+proteins+to+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 4493(2018).</li>
<li>Pattipeiluhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anionic+lipid+nanoparticles+preferentially+deliver+mRNA+to+the+hepatic+reticuloendothelial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system.</a> Advanced Materials. 34 (16), 2201095(2022).</li>
<li>Rosenblum, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+using+targeted+lipid+nanoparticles+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy.</a> Science Advances. 6 (47), (2020).</li>
<li>Fenton, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+alkenyl+amino+alcohol+ionizable+lipid+materials+for+highly+potent+in+vivo+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery.</a> Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).</li>
<li>Tombácz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CD4%2B+T+cell+targeting+and+genetic+recombination+using+engineered+CD4%2B+cell-homing+mRNA-LNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano%22%5BJournal%5D)">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li>
<li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li>
</ol>

אין ניגודי עניינים להצהיר.

באמצעות תהליך עבודה זה, ניתן לגבש ולבדוק מגוון של mRNA-LNPs עבור יעילות in vitro ו- in vivo שלהם. ניתן להחליף ולשלב ליפידים וחומרים פעילים מיוננים ביחסים מולאריים שונים וביחסי משקל שונים בין ליפידים מיוננים ל-mRNA כדי לייצר mRNA-LNPs בעלי תכונות פיסיקוכימיות שונות22. כאן, יצרנו C12-200 mRNA-LNPs עם יחס מולארי של 35/16/46.5/2.5 (ליפיד מיונן:עוזר שומנים:כולסטרול:שומנים-PEG) ביחס משקל של 10:1 ליפיד ל-mRNA. LNPs אלה נבדקו על יעילות הטרנספקציה שלהם במבחנה בתאי HepG2 ו-in ...

ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) הוכיחו הבטחה גדולה בשנים האחרונות בתחום הטיפול הגנטי שאינו ויראלי. בשנת 2018, מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר את הטיפול הראשון אי פעם בהפרעות RNA (RNAi), Onpattro by Alnylam, לטיפול בעמילואידוזיס טרנסתירטין תורשתי 1,2,3,4. זה היה צעד חשוב קדימה עבור ננו-חלקיקי שומנים וטיפולים מבוססי RNA. לאחרונה, מודרנה ופייזר/ביונטק קיבלו אישורי FDA לחיסוני mRNA-LNP שלהם נגד SARS-CoV-2 4,5. בכל אחד מטיפולי חומצות הגרעין מבוססי LNP, LNP משמש להגנה על המטען שלו מפני פירוק על ידי נוקלאזות ולהקל על משלוח תוך-תאי חזק 6,7. בעוד LNPs ראו הצלחה בטיפולי RNAi ויישומי חיסונים, mRNA-LNPs נחקרו גם לשימוש בטיפולים תחליפי חלבונים8, כמו גם להעברה משותפת של Cas9 mRNA ומנחה RNA להעברת מערכת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים9. עם זאת, אין נוסחה ספציפית אחת המתאימה היטב לכל היישומים, ושינויים עדינים בפרמטרים של נוסחת LNP יכולים להשפיע מאוד על העוצמה וההפצה הביולוגית in vivo 8,10,11. לפיכך, יש לפתח ולהעריך mRNA-LNPs בודדים כדי לקבוע את הנוסחה האופטימלית עבור כל טיפול מבוסס LNP.
LNPs מנוסחים בדרך כלל עם ארבעה רכיבי שומנים: ליפיד מיונן, פוספוליפיד, כולסטרול ופוליאתילן-גליקול מעוגן שומנים (PEG) מצומד (ליפיד PEG)11,12,13. ההעברה התוך-תאית רבת העוצמה המתאפשרת על ידי LNPs מסתמכת, בחלקה, על רכיב השומנים המיוננים12. מרכיב זה הוא נייטרלי ב- pH פיזיולוגי אך הופך להיות טעון חיובי בסביבה החומצית של אנדוזום11. שינוי זה במטען היוני נחשב כתורם מרכזי לבריחה אנדוזומלית12,14,15. בנוסף לשומנים המיוננים, מרכיב הפוספוליפידים (ליפיד עוזר) משפר את האנקפסולציה של המטען ומסייע בבריחה אנדוזומלית, הכולסטרול מציע יציבות ומשפר את איחוי הממברנה, והליפידים-PEG ממזער צבירה ואופסוניזציה של LNP במחזורהדם 10,11,14,16. כדי לגבש את LNP, רכיבי שומנים אלה משולבים בפאזה אורגנית, בדרך כלל אתנול, ומעורבבים עם פאזה מימית המכילה את מטען חומצת הגרעין. תהליך ניסוח LNP הוא מאוד תכליתי בכך שהוא מאפשר להחליף בקלות רכיבים שונים ולשלב אותם ביחסים מולאריים שונים על מנת לגבש נוסחאות LNP רבות עם שפע של תכונות פיסיקוכימיות10,17. עם זאת, כאשר בוחנים מגוון עצום זה של LNPs, חיוני שכל ניסוח יוערך באמצעות הליך סטנדרטי כדי למדוד במדויק את ההבדלים באפיון ובביצועים.
כאן, זרימת העבודה המלאה עבור ניסוח של mRNA-LNPs ואת הערכת הביצועים שלהם בתאים ובבעלי חיים מתואר.

<table><tbody><tr><td>0.1 מ' חומצה הידרוכלורית</td><td>סיגמא</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m מסנני מזרק</td><td>Genesee</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל BD קצה החלקה מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום) (C14-PEG2000)</td> <td>Avanti Polar Lipids</td><td>880150P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725P</td><td></td></tr><tr><td>1.5 צינורות מ"ל אפנדורף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>200 הוכחה אתנול</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>23G מחטים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-826-6C</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל BD מזרקים חד פעמיים עם טיפים לואר-לוק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל דיאליזה קלטות</td><td>Thermo Scientific</td><td>A52976</td><td></td></tr><tr><td>96 באר קיר שחור צלחת תחתונה שחורה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-000-135</td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחת תחתונה לבנה/שקופה, TC משטח</td><td>Thermo Scientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט, 1 קילוגרם</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>&nbsp; 631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ציטראט דו-בסיסי</td><td>SIgma</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>BD מזרק Luer-Lok סטרילי, לשימוש חד פעמי, 5 מ"ל</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>C12-200 ליפיד מיינן</td><td>קיימן כימי</td><td>36699</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברי</td><td>מעבדה ג'קסון</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>סיגמא</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap FLuc mRNA (5moU)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>L-7202</td><td></td></tr><tr><td>קובטות חד פעמיות</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955129</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, מלח אשלגן</td><td>Thermo Scientific</td><td>L2916</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Exel מזרקי אינסולין - 0.5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>1484132</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר</td><td>עוברי קורנינג</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hep G2 [HEPG2]</td> <td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyPure ביולוגיה מולקולרית כיתה מים</td><td>Cytiva</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>אינסופי 200 PRO קורא צלחות</td><td>Tecan</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>IVIS SPECTRUM IN VIVO מערכת הדמיה</td><td>Perkin Elmer</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>גדול Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-11D</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת לוציפראז</td><td>Promega</td><td>E4550</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Ignite מחסניות - קלאסי - 100 חבילות</td><td>ננו-מערכות דיוק</td><td>NIN0065</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Ignite Instrument</td><td>ננו-מערכות מדויקות</td><td>NIN0001 PBS</td><td></td></tr><tr><td>- מי מלח עם חוצץ פוספט (10x) pH 7.4, ללא RNase</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>QB ציטראט מאגר, (ציטראט 100 מ"מ) pH 3.0</td><td>Teknova</td><td>Q2442</td><td></td></tr><tr><td>Quant-it RiboGreen ערכת בדיקת RNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>Reporter Lysis 5x Buffer</td><td>Promega</td><td>E3971</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away Surface Decontaminant</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific 7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט</td><td>סיגמא</td><td>7601-54-9</td><td></td></tr><tr><td>מגיב TNS (6-(p-טולואידינו)-2-חומצה נפתלנסולפונית מלח נתרן)</td><td>Sigma</td><td>T9792</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoZS</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת יעילות in vitro ו-in vivo של ננו-חלקיקי mrna-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) משכו תשומת לב נרחבת לאחרונה עם הפיתוח המוצלח של חיסוני mRNA לקורונה על ידי מודרנה ופייזר/ביונטק. חיסונים אלה הוכיחו את יעילותם של טיפולי mRNA-LNP ופתחו את הדלת ליישומים קליניים עתידיים. במערכות mRNA-LNP, ה-LNPs משמשים כפלטפורמות שיגור המגנות על מטען ה-mRNA מפני התפרקות על ידי נוקלאזות ומתווכות את האספקה התוך-תאית שלהם. LNPs מורכבים בדרך כלל מארבעה מרכיבים: ליפיד מיונן, פוספוליפיד, כולסטרול, ופוליאתילן גליקול מעוגן שומנים (PEG) מצומד (ליפיד PEG). כאן, LNPs העוטפים mRNA המקודד לוציפראז גחלילית מנוסחים על ידי ערבוב מיקרופלואיד של השלב האורגני המכיל רכיבי שומנים LNP והפאזה המימית המכילה mRNA. mRNA-LNPs אלה נבדקים לאחר מכן במבחנה כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה שלהם בתאי HepG2 באמצעות בדיקה מבוססת לוחות ביולומינסנטיים. בנוסף, mRNA-LNPs מוערכים in vivo בעכברי C57BL/6 לאחר הזרקה תוך ורידית דרך וריד הזנב הצידי. דימות ביולומינסנציה של כל הגוף מתבצע באמצעות מערכת הדמיה in vivo . תוצאות מייצגות מוצגות עבור מאפייני mRNA-LNP, יעילות הטרנספקציה שלהם בתאי HepG2 ושטף האור הכולל בעכברי C57BL/6.

mRNA-LNPs נוסחו באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל קוטר הידרודינמי ממוצע של 76.16 ננומטר ומדד פיזור של 0.098. pKa של mRNA-LNPs נמצא 5.75 על ידי ביצוע בדיקת TNS18. יעילות האנקפסולציה עבור mRNA-LNPs אלה חושבה להיות 92.3% באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות שונה ומשוואה 4.4. ריכוז הרנ"א הכולל ששימש לטיפול בתאים ולמינון בבעלי חיים היה 40.24 ננוגרם/מיקרוליטר. ערך זה התקבל מבדיקת הפלואורסצנטיות המתוקנת 19, במיוחד מהמרת הפלואורסצנטיות המתקבלת על ידי דילול ה- LNPs עם 1% Triton X-1...

כאן מוצג פרוטוקול לניסוח ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) המכילים mRNA המקודד לוציפראז גחלילית. LNPs אלה נבדקו על עוצמתם במבחנה בתאי HepG2 ו-in vivo בעכברי C57BL/6.

בדיקת יעילות In Vitro ו-In Vivo של ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

פרוטוקול זה יכול לשמש לניסוח ננו-חלקיקי שומנים עקביים העוטפים MRA. ניתן לכוונן את פרמטרי הפורמולציה ולהעריך את חלקיקי השומנים השונים על עוצמתם ופיזורם הביולוגי. פרוטוקול סטנדרטי לניסוח ננו-חלקיקי שומנים ובדיקות in vitro ו-in vivo יכול לשמש לניסוח ננו-חלקיקי שומנים עקביים שניתן להשוות זה לזה.יש הרבה פרטים קטנים שיש לזכור בעת ניסוח והערכה של עוצמת ננו-חלקיקים, אך אילו פרטים נלקחו בחשבון? הכנת הניסוח לא צריכה להיות קשה. התחילו במילוי נקייה בנפח ארבעה ליטרים ב-200 עד 300 מיליליטר של PBS טרי פי 10, ודללו ל-1X במים טהורים במיוחד.ודא שהנפח הסופי של PBS הוא בין שניים לשלושה ליטרים. הניחו קלטות דיאליזה בעלות קיבולת מתאימה לננו-חלקיק השומנים, או פורמולציית LNP, לתוך כד השדה. בצע דילול פי עשרה של מאגר חומצת לימון של 100 מילימולרית באמצעות מים טהורים במיוחד כדי ליצור מאגר חומצת לימון של 10 מילימולרית לדילול mRNA.לאחר מכן, הפוך C 12 200 שומנים מיוננים, שומנים עוזרים, כולסטרול ושומנים מעוגנים PEG או שומנים PEG מניות על ידי המסת כל שומנים ב 100% אתנול. ודא שתמיסות המלאי מומסות במלואן על ידי חימום וערבוב שלהן ב -37 מעלות צלזיוס. שלב את הכרכים המחושבים של רכיבי השומנים השונים בצינור חרוט.לדלל את השומנים עם 100% אתנול לנפח הסופי של V, המייצג 25% מהנפח הסופי של LNP. חישוב כמות ה-mRNA הנדרשת לניסוח בהתבסס על יחס משקל השומנים המיוננים ל-mRNA והנפח הכולל של mRNA-LNP. לאחר מכן, הפשיר את הגחלילית luciferase קידוד mRNA על קרח.לאחר מכן לדלל את ה-mRNA לנפח סופי פי שלושה מהשלב האורגני באמצעות מאגר חומצת לימון 10 מילימולרי. רססו מגבון משימה עדין עם משטח טיהור עבור RNA ו- DNA, ונגבו היטב את פנים המכשיר המיקרופלואידי. לאחר מכן, פתח מחסנית מיקרופלואידית חדשה והכנס אותה כאשר תעלות הכניסה פונות כלפי מטה והחוצה.סדרו שני צינורות חרוטיים סטריליים של 15 מיליליטר על המחזיק כשהמכסים כבויים. לאחר שתסיים, מלא מזרק של חמישה מיליליטר בתמיסת mRNA המכילה mRNA מדולל במאגר חומצת לימון 10 מילימולרי. לאחר מכן ממלאים מזרק של שלושה מיליליטר בתמיסת השומנים המכילה את השומנים המדוללים באתנול 100%.הקפד להסיר את האוויר מהמזרקים. לאחר מכן, ללא המחט, הכנס את מזרק החמישה מיליליטר המכיל את תמיסת ה- mRNA לכניסה השמאלית של המחסנית, והכנס את מזרק שלושת המיליליטר המכיל את תמיסת השומנים לכניסה הימנית של המחסנית. הפעל את המכשיר המיקרופלואידי ובחר הפעלה מהירה.לאחר בחירת סוגי המזרקים הנכונים עבור מזרקים של חמישה ושלושה מיליליטר שהוכנסו, הזן את הפרמטרים עבור ניסוח LNP ביחס קצב זרימה מימי לאורגני של שלושה לאחד, לפני לחיצה על כפתור ההתחלה כדי לנסח את mRNA-LNPs. טען את קלטות ה- mRNA-LNPs שנאספו בצינור החרוטי הימני לתוך קלטות הדיאליזה המיובשות בעבר באמצעות מזרק מבלי לנקב או לגעת בקרום הקלטת, הנח את קלטות הדיאליזה המכילות את ה- mRNA-LNPs בחזרה לתוך הכד המכיל PBS ותן להם לצלול במשך שעתיים לפחות. לאחר הדיאליזה, הביאו את קלטות הדיאליזה המכילות את ה-mRNA-LNPs לארון בטיחות ביולוגי סטרילי והוציאו את קלטות ה-mRNA-LNPs באמצעות מזרק עם מחט.מסננים סטריליים את mRNA-LNPs באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר ואוספים אותם בצינור חרוטי סטרילי. לאחר מכן מניחים 65 מיקרוליטר של תמיסת mRNA-LNP לתוך מיקרו-צינור 1.5 מיליליטר לאפיון. צלחת 5, 000 תאי HepG2 בקיר לבן, תחתית שקופה, צלחת 96 בארות ב 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים שלמה ולדגור את התאים לילה באינקובטור מבוקר ב 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% פחמן דו חמצני.לפני הטיפול בתאים עם mRNA-LNPs, להסיר את המדיום המלא מן הבארות. לאחר מכן, טפלו בתאים עם 100 מיקרוליטר של mRNA-LNPs מדוללים בתווך תרבית תאים מלאה במינונים הרצויים, או 100 מיקרוליטר של תווך מלא לפני דגירה של 24 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום תרבית התא מן צלחת 96 באר, להוסיף 20 מיקרוליטר של חיץ ליזה לכל באר ואחריו 100 מיקרוליטר של ריאגנטים הבדיקה luciferase.הגן על הצלחת מפני אור והנח את הצלחת בקורא לוחות כדי למדוד את האות הביו-לומינסנטי. לדלל את תמיסת mRNA-LNP באמצעות PBS סטרילי כך ששני מיקרוגרם של mRNA כולל נמצאים ב -100 מיקרוליטר מנפח הזרקת וריד הזנב. מלא מזרק אינסולין 29 מד עם 100 מיקרוליטר של mRNA-LNP או 100 מיקרוליטר של PBS והסר את כל הבועות מהמזרק.הכנס את המחט עם השיפוע הפונה כלפי מעלה לתוך וריד הזנב הצידי של העכבר והזריק לאט את 100 מיקרוליטר של mRNA-LNP או PBS. שש שעות לאחר ההזרקה, להכין 15 מיליגרם למיליליטר תמיסת ציר של מלח אשלגן D-Luciferin ב PBS סטרילי. בתוכנת ההדמיה של מערכת ההדמיה in vivo, או IVIS, בחר את התיבה לצד luminescence לפני לחיצה על initialize כדי להכין את המכשיר לאיסוף נתונים.לאחר מכן, לתת 200 מיקרוליטר של D-Luciferin intraperitonealy לעכברים שטופלו בעבר ולחכות 10 דקות בעוד אות luciferase מתייצב לפני מרדים את העכברים. העבירו את העכברים המורדמים לקונוסים באף בתוך מערכת ההדמיה in vivo, וודאו שהם על גבם עם בטן חשופה, לפני סגירת דלת החדר. בתוכנת ההדמיה, ודא שנבחר שדה הראייה הנכון והגדר את זמן החשיפה לאוטומטי, לחץ על לחצן הרכישה בתוכנה כדי לקבל תמונות ביולומינסנציה.יעילות האנקפסולציה של mRNA-LNPs נקבעה כ-92.3% באמצעות בדיקת הפלואורסצנטיות המתוקנת והמשוואה המוצגת כאן. הגדלת bioluminescence נצפתה על טיפול של 5, 000 תאי HepG2 עם מינונים הולכים וגדלים של mRNA-LNP. ביטוי לוציפראז זוהה בקלות במינון הנמוך ביותר של מחקר זה של חמישה ננוגרם לבאר.אות ביולומינסנציה חזק נצפה בבטן העליונה של העכברים שטופלו ב-LNPs מנוסחים. אזורי עניין נמשכו סביב אותות הכבד כדי לחשב את שטף האור הכולל. שטף האור הכולל היה בערך פי חמישה 10 עד 9.שמור תמיד על יחס משקל השומנים המייננים לחומצת הגרעין בעת ניסוח LNPs. כל נפח של הפאזה האורגנית צריך להכיל שומנים מיוננים המתאימים ל-mRNA בשלושה נפחים של הפאזה המימית.

testing-vitro-vivo-efficiency-mrna-lipid-nanoparticles-formulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן נתאר פרוטוקול לדור של cationic nanoliposomes, אשר מבוססת על שיטת יבש-סרט והוא יכול לשמש עבור הכספת, אספקה יעילה של במבחנה עיבד RNA שליח.

דור של Cationic Nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד RNA שליח

כאן, פרוטוקול כמותי בזמן אמת מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז מוצגת לצורך קביעת התוכן המקורי מיקרו-RNA (מוחלט/יחסי) של חלקיקים ליפופרוטאין. בנוסף, שיטה להגברת רמת מיקרו RNA, כמו גם שיטה לקביעת שיעור ספיגת הסלולר של חלקיקים ליפופרוטאין, מומחש.

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

הפרוטוקול מציג את הפרמטרים אופטימיזציה עבור הכנת ליפוזומים תרמיים באמצעות המכשיר מיקרו מיקרופלולה המתלא. זה גם מאפשר משותף של דוקסורוביצין ו indocyanine ירוק ליפוזומים ושחרור פוטותרמי המופעל של דוקסורוביצין עבור שליטה מבוקרת/תרופה שהופעלה.

הפקת מיקרופלואידים של Lysolipid המכילים טמפרטורה רגישה ליפוזומים

חלקיקי שומנים מפותחים באמצעות גישה פלטפורמת ערבוב microfluidic עבור mRNA ו- DNA אנקפסולציה.

גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית

ננו-חלקיק פפטיד-פולוקסאמין בהרכבה עצמית (PP-sNp) פותח באמצעות מכשיר ערבוב מיקרופלואידי כדי לתמצת ולהעביר רנ"א שליח מתועתק במבחנה . ה-mRNA/PP-sNp המתואר יכול להעביר ביעילות תאים בתרבית במבחנה.

טרנספקציה יעילה של mRNA מתועתק במבחנה בתאים בתרבית באמצעות ננו-חלקיקים פפטיד-פולוקסאמין

הפרוטוקול הנוכחי מכין ומעריך את התכונות הפיזיקליות, התגובה החיסונית וההשפעה המגנה in vivo של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב חדשני.

הערכת התגובה החיסונית של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב נגד זיהום סטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA)

פרוטוקול זה מספק גישה לאופטימיזציה של ניסוח על פני גורמי מחקר מתערובת, רציפים וקטגוריים הממזערת בחירות סובייקטיביות במבנה התכנון הניסויי. בשלב הניתוח נעשה שימוש בהליך התאמת מידול יעיל וקל לשימוש.

תהליך עבודה לאופטימיזציה של נוסחת ננו-חלקיקי שומנים (LNP) באמצעות ניסויים מתוכננים בתהליך תערובות ומודלים של אנסמבל מאומת עצמי (SVEM)

במאמר זה אנו מתארים שיטת הומוגניזציה מהירה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) החולקים את אותו מקור ביולוגי ומבנה, מורפולוגיה והרכב חלבונים דומים של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות (EV).

שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של שלפוחיות שמקורן באנדוזום

הודגם פרוטוקול מפורט לסינתזה של ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) באמצעות טכנולוגיות מיקסר סילון פוגע כלוא (CIJ), כולל CIJ דו-סילוני ומערבל מערבולות רב-סילוני בעל ארבעה סילונים (μMIVM). מערבלי CIJ יוצרים סביבות מיקרו-ערבוב טורבולנטיות הניתנות לשחזור, וכתוצאה מכך מייצרים LNPs חד-מפוזרים.

סינתזה של ננו-חלקיקי שומנים על ידי זרימה טורבולנטית במערבלי סילון פוגעים מוגבלים

פרוטוקול זה מציג את פירוק ריילי כתהליך קל לאירוסול וקטורי mRNA שאינם ויראליים. השקיעה אזורית עבור וקטורי mRNA אירוסוליים מוערכת על ידי מודל כניסת האף האידיאלית של אלברטה (AINI). ביטוי חלבון פלואורסצנציה ירוק (GFP) בתאי ריאה אנושיים מייצג שמירה על תפקודים פיזיקוכימיים וביולוגיים של וקטורי mRNA לאחר אירוסול.

העברה תוך-אפית של פוליפלקסי mRNA באמצעות אירוסולים של פריקת ריילי: שיטה במבחנה לשקיעת אף ובדיקות פונקציונליות

למד לנסח חלקיקי ננו-ליפידים המכילים mRNA לבדיקת יעילות in vitro בתאי HepG2 ובהזרקה בעכברי C57BL/6. פרוטוקול זה מאפשר השוואה עקבית של תכונות החלקיקים.

בדיקת יעילות In Vitro ו-In Vivo של ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי

גלה סרטונים נוספים