בדיקת יעילות In Vitro ו-In Vivo של ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי

פרוטוקול זה יכול לשמש לניסוח ננו-חלקיקי שומנים עקביים העוטפים MRA. ניתן לכוונן את פרמטרי הפורמולציה ולהעריך את חלקיקי השומנים השונים על עוצמתם ופיזורם הביולוגי. פרוטוקול סטנדרטי לניסוח ננו-חלקיקי שומנים ובדיקות in vitro ו-in vivo יכול לשמש לניסוח ננו-חלקיקי שומנים עקביים שניתן להשוות זה לזה.

יש הרבה פרטים קטנים שיש לזכור בעת ניסוח והערכה של עוצמת ננו-חלקיקים, אך אילו פרטים נלקחו בחשבון? הכנת הניסוח לא צריכה להיות קשה. התחילו במילוי נקייה בנפח ארבעה ליטרים ב-200 עד 300 מיליליטר של PBS טרי פי 10, ודללו ל-1X במים טהורים במיוחד.

ודא שהנפח הסופי של PBS הוא בין שניים לשלושה ליטרים. הניחו קלטות דיאליזה בעלות קיבולת מתאימה לננו-חלקיק השומנים, או פורמולציית LNP, לתוך כד השדה. בצע דילול פי עשרה של מאגר חומצת לימון של 100 מילימולרית באמצעות מים טהורים במיוחד כדי ליצור מאגר חומצת לימון של 10 מילימולרית לדילול mRNA.

לאחר מכן, הפוך C 12 200 שומנים מיוננים, שומנים עוזרים, כולסטרול ושומנים מעוגנים PEG או שומנים PEG מניות על ידי המסת כל שומנים ב 100% אתנול. ודא שתמיסות המלאי מומסות במלואן על ידי חימום וערבוב שלהן ב -37 מעלות צלזיוס. שלב את הכרכים המחושבים של רכיבי השומנים השונים בצינור חרוט.

לדלל את השומנים עם 100% אתנול לנפח הסופי של V, המייצג 25% מהנפח הסופי של LNP. חישוב כמות ה-mRNA הנדרשת לניסוח בהתבסס על יחס משקל השומנים המיוננים ל-mRNA והנפח הכולל של mRNA-LNP. לאחר מכן, הפשיר את הגחלילית luciferase קידוד mRNA על קרח.

לאחר מכן לדלל את ה-mRNA לנפח סופי פי שלושה מהשלב האורגני באמצעות מאגר חומצת לימון 10 מילימולרי. רססו מגבון משימה עדין עם משטח טיהור עבור RNA ו- DNA, ונגבו היטב את פנים המכשיר המיקרופלואידי. לאחר מכן, פתח מחסנית מיקרופלואידית חדשה והכנס אותה כאשר תעלות הכניסה פונות כלפי מטה והחוצה.

סדרו שני צינורות חרוטיים סטריליים של 15 מיליליטר על המחזיק כשהמכסים כבויים. לאחר שתסיים, מלא מזרק של חמישה מיליליטר בתמיסת mRNA המכילה mRNA מדולל במאגר חומצת לימון 10 מילימולרי. לאחר מכן ממלאים מזרק של שלושה מיליליטר בתמיסת השומנים המכילה את השומנים המדוללים באתנול 100%.

הקפד להסיר את האוויר מהמזרקים. לאחר מכן, ללא המחט, הכנס את מזרק החמישה מיליליטר המכיל את תמיסת ה- mRNA לכניסה השמאלית של המחסנית, והכנס את מזרק שלושת המיליליטר המכיל את תמיסת השומנים לכניסה הימנית של המחסנית. הפעל את המכשיר המיקרופלואידי ובחר הפעלה מהירה.

לאחר בחירת סוגי המזרקים הנכונים עבור מזרקים של חמישה ושלושה מיליליטר שהוכנסו, הזן את הפרמטרים עבור ניסוח LNP ביחס קצב זרימה מימי לאורגני של שלושה לאחד, לפני לחיצה על כפתור ההתחלה כדי לנסח את mRNA-LNPs. טען את קלטות ה- mRNA-LNPs שנאספו בצינור החרוטי הימני לתוך קלטות הדיאליזה המיובשות בעבר באמצעות מזרק מבלי לנקב או לגעת בקרום הקלטת, הנח את קלטות הדיאליזה המכילות את ה- mRNA-LNPs בחזרה לתוך הכד המכיל PBS ותן להם לצלול במשך שעתיים לפחות. לאחר הדיאליזה, הביאו את קלטות הדיאליזה המכילות את ה-mRNA-LNPs לארון בטיחות ביולוגי סטרילי והוציאו את קלטות ה-mRNA-LNPs באמצעות מזרק עם מחט.

מסננים סטריליים את mRNA-LNPs באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר ואוספים אותם בצינור חרוטי סטרילי. לאחר מכן מניחים 65 מיקרוליטר של תמיסת mRNA-LNP לתוך מיקרו-צינור 1.5 מיליליטר לאפיון. צלחת 5, 000 תאי HepG2 בקיר לבן, תחתית שקופה, צלחת 96 בארות ב 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים שלמה ולדגור את התאים לילה באינקובטור מבוקר ב 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% פחמן דו חמצני.

לפני הטיפול בתאים עם mRNA-LNPs, להסיר את המדיום המלא מן הבארות. לאחר מכן, טפלו בתאים עם 100 מיקרוליטר של mRNA-LNPs מדוללים בתווך תרבית תאים מלאה במינונים הרצויים, או 100 מיקרוליטר של תווך מלא לפני דגירה של 24 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום תרבית התא מן צלחת 96 באר, להוסיף 20 מיקרוליטר של חיץ ליזה לכל באר ואחריו 100 מיקרוליטר של ריאגנטים הבדיקה luciferase.

הגן על הצלחת מפני אור והנח את הצלחת בקורא לוחות כדי למדוד את האות הביו-לומינסנטי. לדלל את תמיסת mRNA-LNP באמצעות PBS סטרילי כך ששני מיקרוגרם של mRNA כולל נמצאים ב -100 מיקרוליטר מנפח הזרקת וריד הזנב. מלא מזרק אינסולין 29 מד עם 100 מיקרוליטר של mRNA-LNP או 100 מיקרוליטר של PBS והסר את כל הבועות מהמזרק.

הכנס את המחט עם השיפוע הפונה כלפי מעלה לתוך וריד הזנב הצידי של העכבר והזריק לאט את 100 מיקרוליטר של mRNA-LNP או PBS. שש שעות לאחר ההזרקה, להכין 15 מיליגרם למיליליטר תמיסת ציר של מלח אשלגן D-Luciferin ב PBS סטרילי. בתוכנת ההדמיה של מערכת ההדמיה in vivo, או IVIS, בחר את התיבה לצד luminescence לפני לחיצה על initialize כדי להכין את המכשיר לאיסוף נתונים.

לאחר מכן, לתת 200 מיקרוליטר של D-Luciferin intraperitonealy לעכברים שטופלו בעבר ולחכות 10 דקות בעוד אות luciferase מתייצב לפני מרדים את העכברים. העבירו את העכברים המורדמים לקונוסים באף בתוך מערכת ההדמיה in vivo, וודאו שהם על גבם עם בטן חשופה, לפני סגירת דלת החדר. בתוכנת ההדמיה, ודא שנבחר שדה הראייה הנכון והגדר את זמן החשיפה לאוטומטי, לחץ על לחצן הרכישה בתוכנה כדי לקבל תמונות ביולומינסנציה.

יעילות האנקפסולציה של mRNA-LNPs נקבעה כ-92.3% באמצעות בדיקת הפלואורסצנטיות המתוקנת והמשוואה המוצגת כאן. הגדלת bioluminescence נצפתה על טיפול של 5, 000 תאי HepG2 עם מינונים הולכים וגדלים של mRNA-LNP. ביטוי לוציפראז זוהה בקלות במינון הנמוך ביותר של מחקר זה של חמישה ננוגרם לבאר.

אות ביולומינסנציה חזק נצפה בבטן העליונה של העכברים שטופלו ב-LNPs מנוסחים. אזורי עניין נמשכו סביב אותות הכבד כדי לחשב את שטף האור הכולל. שטף האור הכולל היה בערך פי חמישה 10 עד 9.

שמור תמיד על יחס משקל השומנים המייננים לחומצת הגרעין בעת ניסוח LNPs. כל נפח של הפאזה האורגנית צריך להכיל שומנים מיוננים המתאימים ל-mRNA בשלושה נפחים של הפאזה המימית.