Name: חקירת ההשפעות המגינות של Platycodin D על מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית במודל מבחנה המושרה על ידי חומצה פלמיטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: חקור את ההשפעות המגינות של Platycodin D על מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית במודל תאי AML-12 המושרה בחומצה פלמיטית. שיטה זו מציעה חלופה יעילה וחסכונית למודלים בעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהוועדה למדע וטכנולוגיה של צ'ונגצ'ינג (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 ו- jbky20210029) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (מס '2021MD703919).

תאי AML-12 (קו תאי הפטוציטים רגיל של עכבר) משמשים למחקרים מבוססי תאים. התאים מתקבלים ממקור מסחרי (ראה טבלת חומרים).
1. טיפול מקדים בתאי AML-12 כדי למדל NAFLD במבחנה
<ol><li>שמור על התאים במדיה רגילה של תרבית תאים (DMEM בתוספת Ham's F12 [1:1] המכילים 0.005 מ"ג/מ"ל אינסולין, 5 נ"ג/מ"ל סלניום, 0.005 מ"ג/מ"ל טרנספרין, 40 נ"ג/מ"ל דקסמתזון ו-10% נסיוב בקר עוברי [FBS], ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה עם 5% CO2.</li>
	<li>זרעו את התאים בצלחות 12 בארות (1 מ"ל / באר) עם צפיפות של 2.8 x 105 תאים / באר. הערה: כל פעולות עיכול התאים וההחלפה הבינונית מבוצעות בארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום התאים.</li>
	<li>הסר את מדיום התרבית של התאים לאחר הדגירה לילה (~ 10 שעות), ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של מדיה ללא סרום (לכל באר).</li>
	<li>חלק את צלחת התא בת 12 הקידוחים לארבע קבוצות טיפול שונות משמאל לימין, כולל (1) קבוצת הביקורת, (2) הקבוצה שטופלה ב- PD, (3) הקבוצה שטופלה ב- PA, ו- (4) הקבוצה שטופלה ב- PA + PD. הערה: שלושה עותקים משוכפלים של כל קבוצת טיפול ניסיונית מסודרים מלמעלה למטה על אותה צלחת תא בת 12 בארות.</li>
	<li>הוסף את מדיית תרבית התאים הרגילה (1 מ"ל/באר) לקבוצת הביקורת ולקבוצה שטופלה בפרקינסון, והוסף את מדיית תרבית התאים הרגילה (1 מ"ל/באר) בתוספת 300 מיקרומטר של PA לקבוצה שטופלה ב-PA ו-PA + PD.</li>
	<li>הסר את מדיום התרבית של התאים לאחר 24 שעות של הדגירה, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מדיה ללא סרום (לכל באר) פעמיים.</li>
	<li>הוסף מדיה רגילה של תרבית תאים (1 מ"ל / באר) בתוספת רכב (דימתיל סולפוקסיד, DMSO, 0.1% v/v) לקבוצת הביקורת; להוסיף מדיה רגילה של תרביות תאים (1 מ"ל/באר) בתוספת 1 מיקרומטר PD לקבוצה שטופלה ב-PD; להוסיף מדיה רגילה של תרביות תאים (1 מ"ל/באר) בתוספת PA של 300 מיקרומטר לקבוצה שטופלה ברשות הפלסטינית; הוסף מדיה רגילה של תרבית תאים (1 מ"ל/באר) בתוספת 300 מיקרומטר PA ו-1 מיקרומטר PD לקבוצה שטופלה ב-PA + PD.</li>
	<li>לאחר הדגירה במשך 24 שעות נוספות, חקרו את ההשפעות המגינות של מחלת פרקינסון על תאים באמצעות צביעה של 2′,7′-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) (שלב 2), צביעת JC-1 (שלב 3) וכתמים מערביים (שלב 4). הערה: כל פעולות הדגירה נעשות ב 37 ° C באטמוספירה לחה עם 5% CO2.</li>
</ol>2. מדידת השינוי בייצור ROS
הערה: רמות ה-ROS התוך-תאיות בתאים מוערכות בהתבסס על בדיקת הצביעה DCFH-DA.
<ol><li>בסוף תקופת הטיפול (שלב 1.8), לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט לכל באר (1x PBS, pH 7.4) שלוש פעמים, ולאחר מכן להכתים את התאים עם 100 μL של 10 μM DCFH-DA לכל באר (ראה טבלה של חומרים). לדגור על התאים בחושך במשך 30 דקות. הערה: אם לא נצפתה פלואורסצנטיות ירוקה ברורה לאחר 30 דקות של דגירה, זמן הדגירה של הבדיקה והתאים יכול להיות מוגבר כראוי (30-60 דקות). אם חשיפת יתר של ערך הפלואורסצנטיות הירוק נצפתה לאחר 30 דקות של דגירה, זמן הדגירה של הבדיקה והתאים יכול להיות מופחת כראוי (15-30 דקות).</li>
	<li>שטפו את התאים עם 1x PBS (1 מ"ל/באר) שלוש פעמים. הוסף 1 מ"ל של 1x PBS לכל באר.</li>
	<li>הניחו את לוח 12 הבארות על במת המיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן השתמשו במטרה של פי 20 כדי לצפות במורפולוגיה של התאים (הגדלה: 200x).</li>
	<li>צלם שלוש תמונות פלואורסצנטיות מייצגות (הגדלה: 200x) עבור כל באר במיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות ערוץ פלואורסצנטי ירוק עם אורך גל עירור של 480 ננומטר ואורך גל פליטה של 530 ננומטר. הערה: התעלה הפלואורסצנטית הירוקה עם אורך גל עירור של 480 ננומטר ואורך גל פליטה של 530 ננומטר מומלצת כדי לזהות את DCFH-DA. בנוסף, DCFH-DA ניתן לזהות עם הגדרות הפרמטרים עבור GFP ו- FITC במיקרוסקופ פלואורסצנטי35,36.</li>
	<li>לבסוף, עבד את התמונות באמצעות תוכנה לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן השתמש בתוכנת ImageJ כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של כל קבוצה או את היחסים בין הקבוצות השונות. הערה: הפרטים הטכניים של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ותוכנת Image J ששימשו לעבודת ההדמיה תוארו בעבר37,38.</li>
</ol>3. מדידת השינוי בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית
הערה: השינויים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית מנוטרים על ידי בדיקת הצביעה JC-1.
<ol><li>בסוף תקופת הטיפול (שלב 1.8), לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של 1x PBS לכל באר שלוש פעמים, ולאחר מכן לצבוע את התאים עם 100 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל JC-1 פתרון עבודה (ראה טבלה של חומרים) במשך 30 דקות ב 37 ° C בחושך. הערה: אם לא נצפתה פלואורסצנטיות ירוקה ברורה לאחר 30 דקות של דגירה, זמן הדגירה של הבדיקה והתאים יכול להיות מוגבר כראוי (30-60 דקות). אם חשיפת יתר של ערך הפלואורסצנטיות הירוק נצפתה לאחר 30 דקות של דגירה, זמן הדגירה של הבדיקה והתאים יכול להיות מופחת כראוי (15-30 דקות).</li>
	<li>שטפו את התאים עם 1x PBS (1 מ"ל/באר) שלוש פעמים. הוסף 1 מ"ל של 1x PBS לכל באר.</li>
	<li>הניחו את לוח 12 הבארות על במת המיקרוסקופ, ולאחר מכן השתמשו במטרה של פי 20 כדי לבחון את המורפולוגיה של התאים (הגדלה: 200x).</li>
	<li>צלם שלוש תמונות פלואורסצנטיות מייצגות (הגדלה: 200x) עבור כל באר במיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות התעלה הפלואורסצנטית הירוקה עם אורכי גל עירור ופליטה של 485 ננומטר ו- 535 ננומטר, בהתאמה, והתעלה הפלואורסצנטית האדומה עם אורכי גל עירור ופליטה של 550 ננומטר ו- 600 ננומטר, בהתאמה. הערה: התעלה הפלואורסצנטית הירוקה עם אורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 535 ננומטר משמשת לגילוי מונומר JC-1, אשר מטופל כמיטוכונדריה דה-פולריזציה 39,40,41, והתעלה הפלואורסצנטית האדומה עם אורך גל עירור של 550 ננומטר ואורך גל פליטה של 600 ננומטר משמשת לגילוי דימר JC-1, אשר מטופל כמו מיטוכונדריה מקוטבת 39,40,41.</li>
	<li>לבסוף, עבד את התמונות באמצעות תוכנה לרכישת תמונות, ולאחר מכן השתמש בתוכנת Image J כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של כל קבוצה או את היחסים בין הקבוצות השונות. הערה: הפרטים הטכניים של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ותוכנת Image J ששימשו לעבודת ההדמיה תוארו בעבר37,38.</li>
</ol>4. מדידת רמות ביטוי החלבונים של LC3-II/LC3-I ו-p62/SQSTM1
<ol><li>לאחר הטיפול (שלב 1.8), לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1x PBS (1 מ"ל / באר) כי כבר precooled ב 4 ° C.</li>
	<li>הוסיפו לצלחת 12 הקידוחים RIPA lysis buffer (100 μL/well) בתוספת פרוטאז וקוקטייל מעכב פוספטאז (1x) (ראו טבלת חומרים) ולליז על קרח למשך 5 דקות.</li>
	<li>אסוף את התא ליזט לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. לקבוע את ריכוז החלבון של supernatants על ידי שיטת BCA בעקבות נהלים סטנדרטיים42.</li>
	<li>הוסף מאגר טעינה לדוגמה של SDS-PAGE (5x, ראה טבלת חומרים) לסופרנאטנטים של התא ליזט (יחס נפח = 1:4).</li>
	<li>מערבבים על ידי מערבולות (במהירות גבוהה עבור ~ 15 שניות), ומחממים את הדגימות המעורבות ב 100 ° C במשך 5 דקות כדי לנטרל את החלבון.</li>
	<li>הכנס את ג'ל 12% SDS-PAGE 12% מוכן היטב למיכל האלקטרופורזה, ולאחר מכן הוסף את מאגר הדגימה של SDS (1x) מהולל במים טהורים במיוחד למיקום מגבלת הגובה. הערה: ג'ל SDS-PAGE מוכן באמצעות ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>הוסף את סמן החלבון (5 מיקרוליטר / באר) ודגימות (20 מיקרוגרם / באר) לבארות שונות של ג'ל SDS-PAGE.</li>
	<li>הגדר את מצב המתח היציב על 100 V, ובצע את האלקטרופורזה במשך 80 דקות.</li>
	<li>לאחר אלקטרופורזה SDS-PAGE, בצע את האלקטרו-העברה של החלבונים לקרום פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) (0.45 מיקרומטר, ראה טבלת חומרים) בעקבות דוחות שפורסמו בעבר43,44.</li>
	<li>לאחר האלקטרוטרנספר של החלבונים, שטפו את קרום PVDF עם 10 מ"ל TBST (1x TBS, 0.1% Tween 20) פעמיים (5 דקות לזמן) בשייקר בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חסום את קרום PVDF עם 5 מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA, 5%) בשייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.</li>
	<li>שטפו את קרום PVDF עם 10 מ"ל TBST שלוש פעמים (10 דקות לזמן). לאחר מכן, יש לדגור על קרום PVDF ב-5 מ"ל של הנוגדנים הראשוניים הספציפיים המדוללים בחיץ חוסם עבור LC3 (mAb עכבר, 1:2,000), p62/SQSTM1 (להלן p62, mAb עכבר, 1:2,000) ו-β-actin (mAb עכבר, 1:2,000) (ראה טבלת חומרים) למשך הלילה ב-4°C.</li>
	<li>שטפו את קרום PVDF עם 10 מ"ל TBST שלוש פעמים (10 דקות לזמן) בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו על קרום PVDF עם נוגדן משני מסוג IgG נגד עכבר (HRP) המדולל במאגר חוסם (1:10,000) (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר ומוגן מאור למשך שעתיים.</li>
	<li>שטפו את קרום PVDF עם 10 מ"ל TBST שלוש פעמים (10 דקות לזמן) בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את קרום ה-PVDF על הניילון הנצמד, הוסיפו כמות מתאימה של תמיסת עבודה ECL (200 מיקרוליטר/ממברנה) (ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך 2 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, הסר את פתרון העבודה ECL, וחשף את קרום PVDF במערכת ההדמיה לפיתוח תמונה. לבסוף, השתמש בתוכנת Image J כדי לנתח את הערכים האפורים של כל להקה. הערה: הפרטים הטכניים של הכתם המערבי ותוכנת Image J ששימשו לעבודת ההדמיה תוארו בעבר45,46.</li>
</ol>5. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>הצג את הנתונים מהניסויים כממוצע ± סטיית תקן (SD).</li>
	<li>בצע את ניתוח המובהקות באמצעות כלי התוכנה הסטטיסטית שתואר קודם לכן47.</li>
	<li>חשב את ההבדלים הסטטיסטיים בין שתי הקבוצות באמצעות מבחן t. ערך P מתחת ל-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

מחקרים הדגישו את העובדה כי NAFLD היא תסמונת קליניתפתולוגית, החל כבד שומני NASH, שיכול להתקדם שחמת הכבד וסרטן הכבד51. תזונה עתירת שומן ואורח חיים לא פעיל הם גורמי סיכון אופייניים ל-NAFLD. הן טיפולים שאינם תרופתיים והן טיפולים תרופתיים לטיפול ב- NAFLD נחקרו51,52,53. עם זאת, הפתוגנזה של NAFLD לא הובהרה במלואה. השיטה המתוארת כאן כוללת מודל במבחנה של NAFLD שהוקם על ידי תאי AML-12 מעוררי PA. חקרנו את ה...

Platycodon grandiflorus (PG), שהוא השורש המיובש של Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., משמש ברפואה סינית מסורתית (TCM). הוא מיוצר בעיקר באזורים הצפון-מזרחיים, הצפוניים, המזרחיים, המרכזיים והדרום-מערביים של סין1. רכיבי PG כוללים ספונינים טריטרפנואידים, רב-סוכרים, פלבנואידים, פוליפנולים, פוליאתילן גליקול, שמנים נדיפים ומינרלים2. ל-PG יש היסטוריה ארוכה של שימוש כמזון וכצמחי מרפא באסיה. באופן מסורתי, צמח זה שימש לייצור תרופות נגד מחלות ריאה. פרמקולוגיה מודרנית מספקת גם ראיות ליעילות של PG לטיפול במחלות אחרות. מחקרים הראו כי ל-PG יש השפעה טיפולית על מגוון מודלים של פגיעה בכבד הנגרמת על ידי תרופות. תוספי תזונה של תמציות PG או platycodin יכולים להקל על השמנת יתר עתירת שומן הנגרמת על ידי דיאטה ומחלות מטבוליות הקשורות אליה 3,4,5. פוליסכרידים מ-PG יכולים לשמש לטיפול בפגיעה חריפה בכבד הנגרמת על ידי LPS/D-GalN בעכברים6. יתר על כן, ספונינים משורשי PG משפרים סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית הנגרמת על ידי דיאטה עתירת שומן (NASH)7. יתר על כן, platycodin D (PD), אחד המרכיבים הטיפוליים החשובים ביותר של PG, יכול לשפר ביטוי קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה וספיגת ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה בתאי קרצינומה הפטוצלולרית אנושית (HepG2)8. יתר על כן, פרקינסון יכול גם לגרום לאפופטוזיס ולעכב הידבקות, נדידה ופלישה בתאי HepG2 9,10. לפיכך, במחקר זה, תאי הפטומה AML-12 של עכברים משמשים לבניית מודל במבחנה וכדי להמשיך לחקור את ההשפעות הפרמקולוגיות ואת המנגנונים הבסיסיים של PD במודל זה.
המונח מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) מתייחס לקבוצה של מחלות כבד הכוללת סטאטוזיס פשוט, NASH, שחמת הכבד וקרצינומה הפטוצלולרית11. למרות שהפתוגנזה של NAFLD אינה מובנת לחלוטין, מהתיאוריה הקלאסית של "שתי מכות" ועד לתיאוריית "ריבוי המכות" הנוכחית, עמידות לאינסולין נחשבת מרכזית בפתוגנזה של NAFLD12,13,14. מחקרים הראו כי עמידות לאינסולין בהפטוציטים עלולה להוביל לעלייה בחומצות שומן חופשיות, היוצרות טריגליצרידים המופקדים בכבד וגורמים לכבד להיות שומני15,16. הצטברות שומן עלולה להוביל לרעילות ליפוטוקסית, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה כתוצאה מעקה חמצונית, עקה אנדופלסמית ברשתית ושחרור ציטוקינים דלקתיים, וכתוצאה מכך פתוגנזה והתקדמות של NAFLD17,18. בנוסף, אוטופגיה גם ממלאת תפקיד בפתוגנזה של NAFLD, שכן היא מעורבת בוויסות רגישות לאינסולין תאי, מטבוליזם שומנים בתאים, פגיעה בהפטוציטים וחסינות מולדת 19,20,21.
מגוון מודלים של בעלי חיים ומודלים תאיים הוקמו כדי לספק בסיס לחקר הפתוגנזה והמטרות הטיפוליות האפשריות של NAFLD22,23. עם זאת, מודלים של בעלי חיים בודדים אינם יכולים לחקות באופן מלא את כל התהליכים הפתולוגיים של NAFLD24. הבדלים אינדיבידואליים בין בעלי חיים מובילים לתכונות פתולוגיות שונות. שימוש בקווי תאי כבד או בהפטוציטים ראשוניים במחקרי מבחנה של NAFLD מבטיח עקביות מרבית בתנאי הניסוי. חוסר ויסות מטבוליזם של שומנים בכבד יכול להוביל לרמות גבוהות יותר של הצטברות טיפות שומנים בכבד ב- NAFLD25. חומצות שומן חופשיות כגון חומצה אולאית ושמן דקלים שימשו במודל in vitro כדי לחקות NAFLD הנגרמת על ידי דיאטה עתירת שומן26,27. קו תאי הפטובלסטומה האנושי HepG2 משמש לעתים קרובות לבניית מודלים של NAFLD במבחנה, אבל, בתור קו תאי גידול, חילוף החומרים של תאי HepG2 שונה באופן משמעותי מזה של תאי כבד בתנאים פיזיולוגיים רגילים28. לכן, שימוש בהפטוציטים ראשוניים או בהפטוציטים ראשוניים של עכברים לבניית מודל NAFLD במבחנה לבדיקת תרופות הוא יתרון גדול יותר מאשר שימוש בקווי תאים סרטניים. בהשוואה לבחינה סינרגטית של השפעות תרופתיות ומטרות טיפוליות הן במודלים של בעלי חיים והן במודלים של הפטוציטים במבחנה, נראה כי לשימוש בהפטוציטים של עכברים לבניית מודל NAFLD במבחנה יש פוטנציאל יישום טוב יותר.
חומצות שומן חופשיות הנכנסות לכבד מחומצנות כדי לייצר אנרגיה או מאוחסנות כטריגליצרידים. באופן משמעותי, חומצות שומן חופשיות יש lipotoxicity מסוים עלול לגרום תפקוד לקוי של התאים אפופטוזיס12. חומצה פלמיטית (PA) היא חומצת השומן הרוויה הנפוצה ביותר בפלזמה האנושית29. כאשר תאים ברקמה שאינה שומן נחשפים לריכוזים גבוהים של PA במשך זמן רב, הדבר ממריץ את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) וגורם לעקה חמצונית, הצטברות שומנים ואפילו אפופטוזיס30. לכן, חוקרים רבים משתמשים ב-PA כגורם מעורר תאי כבד לייצר ROS, ובכך בונים את מודל מחלת הכבד השומני במבחנה ומעריכים את ההשפעות המגינות של חומרים פעילים מסוימים על תאים31,32,33,34. מחקר זה מציג פרוטוקול לחקירת ההשפעות המגינות של פרקינסון על מודל תאי של NAFLD המושרה על ידי הרשות הפלסטינית.

<table><tbody><tr><td>5% BSA חוסם חוצץ</td><td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>SW3015</td><td></td></tr><tr><td>AML12 (כבד עכבר אלפא 12) קו תאים</td><td>Procell Life Science& טכנולוגיה ושות', בע"מ, סין</td><td>AML12</td><td></td></tr><tr><td>Beyo ECL&nbsp; Plus</td><td>Beyotime, שנחאי, סין</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Esco Micro Pte Ltd, סינגפור</td><td>AC2-5S1 A2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>אולימפוס, טוקיו, יפן</td><td>1.8</td><td></td></tr><tr><td>תרבות CO2 חממה</td><td>Esco Micro Pte Ltd, סינגפור</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Beyotime, שנחאי, סין</td><td>ST125</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hyclone, &nbsp; לוגן,&nbsp; יוטה,&nbsp; ארה"ב</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>היקלון סרום בקר עוברי</td><td>, טאורנגה, ניו זילנד</td><td>SH30406.05</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td><td>Graphpad GraphPad Software Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב</td><td>8.0</td><td></td></tr><tr><td>HRP עז נגד עכבר IgG (H+L)</td> <td>ABclonal, ווהאן, סין</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת העברת PVDF הידרופובית</td><td>Merck, דרמשטדט, גרמניה</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין, טרנספרין, תמיסת סלניום, 100 פעמים;</td><td>Beyotime, שנגחאי, סין</td><td>C0341</td><td></td></tr><tr><td>MAP LC3&beta; נוגדן</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td>SC-376404</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית עם JC-1</td><td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>M8650</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס מיקרוסקופ הפוך IX53</td><td>אולימפוס, טוקיו, יפן</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פלמיטית</td><td>סיגמא, גרמניה</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (100x)</td><td>היקלון,&nbsp; לוגן,&nbsp; יוטה,&nbsp; ארה"ב</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>פנילמתאן סולפוניל&nbsp; פלואוריד</td><td>Beyotime, שנחאי, סין</td><td>ST506</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ תמיסה</td><td>Hyclone, &nbsp; לוגן,&nbsp; יוטה,&nbsp; ארה"ב</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Platycodin D</td><td>צ'נגדו חובה ביו-טכנולוגיה ושות', בע"מ, סין</td><td>CSA: 58479-68-8</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז לשימוש כללי, 100x</td><td>Beyotime, שנחאי, סין</td><td>P1005</td><td></td></tr><tr><td>סמן חלבון</td><td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>PR1910</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת מיני חמצן תגובתיים</td><td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>CA1410</td><td></td></tr><tr><td>ריפה&nbsp; ליזה&nbsp; מאגר</td><td>Beyotime, שנחאי, סין</td><td>P0013E</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE ערכת הכנה מהירה ג'ל</td><td>Beyotime, שנחאי, סין</td><td>P0012AC</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE מאגר טעינה לדוגמא, 5x</td><td>Beyotime, שנחאי, סין</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Sigma צנטריפוגה</td><td>סיגמה, גרמניה</td><td>3K15</td><td></td></tr><tr><td>SQSTM1 / p62 נוגדן</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td>SC-28359</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecan Austria GmbH, אוסטריה</td><td>1510002987</td><td></td></tr><tr><td>מאגר העברת WB, 10x</td><td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>D1060</td><td></td></tr> <tr><td>&beta;-Actin Mouse mAb</td><td>ABclonal, ווהאן, סין</td><td>AC004</td><td></td></tr></tbody></table>

חקירת ההשפעות המגינות של platycodin d על מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית במודל מבחנה המושרה על ידי חומצה פלמיטית

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

ההופעה של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) עולה בקצב מדאיג ברחבי העולם. Platycodon grandiflorum נמצא בשימוש נרחב כתרופה אתנו-רפואית מסורתית לטיפול במחלות שונות והוא מזון פונקציונלי טיפוסי שניתן לשלב בתזונה היומיומית. מחקרים הראו כי platycodin D (PD), אחד המרכיבים הפעילים העיקריים של Platycodon grandiflorum, יש זמינות ביולוגית גבוהה וממתן באופן משמעותי את ההתקדמות של NAFLD, אבל המנגנון הבסיסי של זה עדיין לא ברור. מחקר זה נועד לחקור את ההשפעה הטיפולית של פרקינסון נגד NAFLD במבחנה. תאי AML-12 טופלו בחומצה פלמיטית (PA) של 300 מיקרומטר במשך 24 שעות כדי למדל NAFLD במבחנה. לאחר מכן, התאים טופלו בפרקינסון או שלא קיבלו טיפול בפרקינסון במשך 24 שעות. רמות מיני החמצן הריאקטיבי (ROS) נותחו באמצעות צביעה של 2′,7′-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), ופוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית נקבע על ידי שיטת הצביעה JC-1. יתר על כן, רמות ביטוי החלבונים של LC3-II/LC3-I ו- p62/SQSTM1 בליזטים של התא נותחו על ידי כתם מערבי. נמצא כי PD מפחית באופן משמעותי את רמות הפוטנציאל של ROS וקרום המיטוכונדריה בקבוצה שטופלה ב-PA בהשוואה לקבוצת הביקורת. בינתיים, PD העלה את רמות LC3-II/LC3-I והוריד את רמות p62/SQSTM1 בקבוצה שטופלה ב-PA בהשוואה לקבוצת הביקורת. התוצאות הצביעו על כך שמחלת פרקינסון שיפרה את NAFLD במבחנה על-ידי הפחתת עקה חמצונית וגירוי אוטופגיה. מודל זה במבחנה הוא כלי שימושי לחקר התפקיד של PD ב- NAFLD.

ROS תוך-תאי בתאים תאי AML-12 הושרו עם PA של 300 מיקרומטר למשך 24 שעות, ומודל תאי NAFLD הוקם. לאחר מכן, התאים טופלו במחלת פרקינסון במשך 24 שעות. התאים סומנו בבדיקה פלואורסצנטית DCFH-DA, וייצור ROS נצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התוצאות של צביעת DCFH-DA של ROS תוך-תאי בתאים מוצגות באיור 1. התוצאות הראו כי פרקינסון יכול להפחית באופן משמעותי את רמת ה-ROS התוך-תאי בתאים שהודגרו עם 300 מיקרומטר של PA (P &lt; 0.01), מה שמצביע על כך שמחלת פרקינסון יכולה להפחית עקה חמצונ...

פרוטוקול זה חוקר את ההשפעות המגינות של platycodin D על מחלת כבד שומני לא אלכוהולי במודל המושרה על ידי חומצה פלמיטית במבחנה .

חקירת ההשפעות המגינות של Platycodin D על מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית במודל מבחנה המושרה על ידי חומצה פלמיטית

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

שיטה זו מדגימה את השימוש בתאי AML-12 אשר יאפשרו בניית מודל וחקירת ההשפעות המגינות של platycodin D על NAFLD. הסתמכות יתר על שימוש במודלים של בעלי חיים מגדילה את נטל פיתוח התרופות הטיפוליות. שימוש במודלים תאיים בשלב המוקדם של פיתוח תרופות NAFLD הוא מעשי יותר וחסכוני יותר.מודל TCM זה עשוי לסייע בשיפור ההבנה של התפקוד הביולוגי של platycodin D ולסייע בחקר השימוש ב-TCM אחרים לטיפול ב-NAFLD. התחל על ידי זריעת מיליליטר אחד של תאי AML-12 לכל באר בלוחות 12 באר. לאחר מכן חלקו את צלחת 12 הבארות לארבע קבוצות טיפול שונות ותייגו אותן כקבוצת ביקורת, טופלה במחלת פרקינסון, טופלה ברשות הפלסטינית והקבוצה שטופלה ב-PA בתוספת פרקינסון.הוסף מיליליטר אחד של מצע תרבית התאים הרגיל לכל באר לקבוצת הביקורת ולקבוצה שטופלה בפרקינסון. הוסף מיליליטר אחד של מצע תרבית התאים הרגיל בתוספת חומצה פלמיטית מיקרומולרית 300 לקבוצה שטופלה ברשות הפלסטינית וב- PA בתוספת PD שטופלה. לאחר 24 שעות של דגירה, להסיר את המדיום התרבית של התאים ולאחר מכן לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מדיה ללא סרום פעמיים.לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיה רגילה של תרבית תאים בתוספת רכב לקבוצת הביקורת ומיליליטר אחד של מדיה רגילה של תרבית תאים בתוספת פלטיקודין D מיקרומולרי אחד לקבוצה שטופלה בפרקינסון. הוסף מיליליטר אחד של מדיה רגילה של תרבית תאים בתוספת חומצה פלמיטית מיקרומולרית 300 מיקרומולרית לקבוצה שטופלה ברשות הפלסטינית ומיליליטר אחד של מדיה רגילה של תרבית תאים בתוספת חומצה פלמיטית מיקרומולרית 300 מיקרומולרית ופלטיקודין D מיקרומולרי אחד לקבוצה שטופלה ב- PA בתוספת PD. לאחר טיפול בתאים במשך 24 שעות, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של 1X PBS לכל באר שלוש פעמים.ואז להכתים את התאים עם 100 מיקרוליטר של 10 מיקרומולרי DCFH-DA לכל באר. לדגור על התאים בחושך במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 1X PBS שלוש פעמים ולהוסיף מיליליטר אחד של 1X PBS לכל באר.הניחו את לוח 12 הבארות על במת המיקרוסקופ והשתמשו במטרה של פי 20 כדי לבחון את המורפולוגיה של התאים בהגדלה של פי 200. כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, שטפו את התאים המטופלים שהוכנו קודם לכן עם מיליליטר אחד של 1X PBS לכל באר שלוש פעמים. לאחר מכן להכתים את התאים עם 100 מיקרוליטר של חמישה מיקרוגרם למיליליטר JC-1 פתרון עבודה לדגור את התאים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.לאחר מכן שטפו את התאים עם 1X PBS שלוש פעמים והוסיפו מיליליטר אחד של 1X PBS לכל באר. הניחו את לוח 12 הבארות על במת המיקרוסקופ והשתמשו במטרה של פי 20 כדי לבחון את המורפולוגיה של התאים בהגדלה של פי 200. לפרק את התאים המטופלים ולאסוף את התא lysate לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה את הצינורות ב 12, 000 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף מאגר טעינת דגימות של 5X SDS-PAGE לסופרנאטנט ליזט התא ביחס נפח של אחד עד ארבעה. לאחר מכן, הכניסו את הג'ל המוכן 12%SDS-PAGE עם 12 בארות למיכל האלקטרופורזה והוסיפו 1X SDS מעלה חיץ דגימה מהולל במים טהורים במיוחד למגבלת הגובה המומלצת.לאחר אלקטרופורזה SDS-PAGE, בצע את העברת האלקטרו של החלבונים לקרום PVDF של 0.45 מיקרון. לדגור על הממברנה בחמישה מיליליטר של הנוגדנים הראשוניים המדוללים בחיץ חוסם. השתמש בנוגדנים ספציפיים עבור LC-III, p62 ובטא-אקטין .דוגרים לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לדגור על קרום PVDF עם נוגדן משני LGG HRP נגד עכבר ארנב מדולל אחד עד 10, 000 בחיץ חוסם. לדגור על הממברנה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור במשך שעתיים.לאחר הדגירה, מניחים את קרום PVDF על ניילון נצמד. מוסיפים כמות מתאימה של פתרון עבודה ECL ודגרים במשך שתי דקות. לאחר מכן הסר את פתרון העבודה ECL וחשף את קרום PVDF במערכת ההדמיה לפיתוח תמונה.צביעת DCFH-DA הראתה כי פלטיקודין D יכול להפחית באופן משמעותי את רמת ה-ROS התוך-תאי בתאי ALM-12, מה שמצביע על כך שטיפול זה יכול להפחית את העקה החמצונית התאית. יתר על כן, הפלואורסצנטיות הירוקה המייצגת מונומרים JC-1 או מיטוכונדריה דה-פולריים הייתה גבוהה יותר בתאים שטופלו בחומצה פלמיטית מאשר בתאים שלא טופלו, בעוד שהפלואורסצנטיות האדומה שייצגה את דימרים JC-1 או מיטוכונדריה מקוטבת הייתה נמוכה יותר בתאים שטופלו בחומצה פלמיטית מאשר בתאים שלא טופלו, מה שמצביע על דפולריזציה MMP הנגרמת על ידי חומצה פלמיטית. בנוסף, בהשוואה לקבוצת המודל, היחס בין מונומרים JC-1 לדימרים ירד בקבוצת הטיפול בפלטיקודין D, מה שמצביע על כך שהוא יכול לשפר את MMP המושרה על ידי חומצה פלמיטית.רמות ביטוי החלבונים של חלבונים הקשורים לאוטופגיה LC-III ו-p62 נחקרו על ידי Western Blotting. היחס בין LC-32 ל-LC-31 ירד משמעותית ורמת ביטוי החלבון של p62 עלתה לאחר הטיפול בחומצה פלמיטית. מצד שני, platycodin D הפחית באופן משמעותי את רמת ביטוי החלבון של p62 והגדיל את היחס של LC-32 ל LC-31, מה שמצביע על שחזור השטף האוטופגי המושרה על ידי חומצה פלמיטית.אם הערך הפלואורסצנטי של התאים בקבוצת הביקורת השלילית גבוה יחסית, ניתן להתאים את ריכוזי העבודה של הגשושיות הפלואורסצנטיות לפי הצורך.

investigating-protective-effects-platycodin-d-on-non-alcoholic-fatty

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

כאן מתוארות שיטות מותאמות ליצירת מודלים in vivo ו-in vitro של סטיאטוזיס בכבד ולניתוח הפנוטיפים הסטאטוטיים והפרמטרים הפיזיולוגיים הקשורים.

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגרימת הכבד שלפוחית השומן בתאי HepaRG עם חומצות שומן מלח נתרן לרדוף ולהעסיק שיטות זיהוי וכימות של הצטברות שומנים בדם, כולל anti-סטוקס קוהרנטי פיזור ראמאן (מכוניות) מיקרוסקופ, ניתוח ציטופלוורימטרי, שמן אדום כתמים ו-qPCR.

גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG

פרוטוקול זה נועד להיות כלי לחקר סטאטוזיס ואת השינויים המולקולריים, הביוכימיים, התאיים המיוצרים על ידי חשיפה יתר של hepatocytes שומנים במבחנה.

מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה משולבת לחקר המטרות והמנגנונים העיקריים של Fructus Phyllanthi נגד היפרליפידמיה המבוססת על חיזוי פרמקולוגיה של הרשת ואימות מטבולומי.

חיזוי פרמקולוגיה ברשת ותיקוף מטבולומיקה של מנגנון פרוקטוס פילנתי נגד היפרליפידמיה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בשמן אדום O כדי לצבוע טיפות שומנים (LDs), לחשב את הגודל והמספר של LDs במודל הפטוציטים שומניים המושרה על ידי חומצות שומן, ולהשתמש ב- BODIPY 493/503 כדי לצפות בתהליך של LDs קטנים המתמזגים ל- LDs גדולים על ידי הדמיה של תאים חיים.

הערכת גודל טיפות שומנים ואיחוי בתאי כבד בקר

מאמר זה מתאר את השימוש בתאי HepG2 הנגרמים על ידי חומצה אולאית כמודל למחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי.

מידול חוץ גופי של שקיעת שומן במחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי

פיתחנו מודל פרוסת מוח שבו ניתן להשתמש כדי לבחון מנגנונים מולקולריים מעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה. טכניקה זו יוצרת רקמת מוח בוגרת קיימא ומפחיתה את המספרים של בעלי חיים הנדרשים לניסויים, תוך שמירה על המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ותאי postsynaptic שלמים בחלקו.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

שיטה זו פותחה במטרה לספק פתרון תרופתי קבוע באמצעות העורק הראשי, כדי להעריך את הפרמקוקינטיקה של תרופות חדשניות במודלים של עכברים.

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

חקור את ההשפעות המגינות של Platycodin D על מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית במודל תאי AML-12 המושרה בחומצה פלמיטית. שיטה זו מציעה חלופה יעילה וחסכונית למודלים בעלי חיים.

חקירת ההשפעות המגינות של Platycodin D על מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית במודל מבחנה המושרה על ידי חומצה פלמיטית

גלה סרטונים נוספים