Name: בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: למד את שיטת DMS-MaP לניתוח מבנה RNA באמצעות דימתיל סולפט וריצוף. הפרוטוקול מציג טכניקות חישוף במבחנה ובתאים חיים לחקר דינמיקה מבנית של RNA ותפקוד ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tertiary+structure+of+yeast+phenylalanine+transfer+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA.</a> Science. 185 (4149), 435-440 (1974).</li>
<li>Robertus, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+yeast+phenylalanine+tRNA+at+3+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Å resolution.</a> Nature. 250 (467), 546-551 (1974).</li>
<li>Zaug, A. J., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+splicing+of+the+ribosomal+RNA+precursor+in+nuclei+of+Tetrahymena%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor in nuclei of Tetrahymena.</a> Cell. 19 (2), 331-338 (1980).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NONCODE+2016%3A+An+informative+and+valuable+data+source+of+long+non-coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NONCODE 2016: An informative and valuable data source of long non-coding RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 44, D203-D208 (2016).</li>
<li>Vandivier, L. E., Anderson, S. J., Foley, S. W., Gregory, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conservation+and+function+of+RNA+secondary+structure+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The conservation and function of RNA secondary structure in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 67, 463(2016).</li>
<li>Jumper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+accurate+protein+structure+prediction+with+AlphaFold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold.</a> Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).</li>
<li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+structure%3A+A+renaissance+begins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA structure: A renaissance begins.</a> Nature Methods. 18 (5), 439-439 (2021).</li>
<li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2%E2%80%B2-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29+for+direct%2C+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1643-1669 (2015).</li>
<li>Mathews, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7287-7292 (2004).</li>
<li>Zuker, M., Stiegler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+computer+folding+of+large+RNA+sequences+using+thermodynamics+and+auxiliary+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information.</a> Nucleic Acids Research. 9 (1), 133-148 (1981).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ViennaRNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ViennaRNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6, (2011).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+Software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, (2010).</li>
<li>Wells, S. E., Hughes, J. M. X., Igel, A. H., Ares, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dimethyl+sulfate+to+probe+RNA+structure+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of dimethyl sulfate to probe RNA structure in vivo.</a> Methods in Enzymology. , 479-493 (2000).</li>
<li>Tomezsko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+RNA+structural+diversity+and+its+role+in+HIV-1+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Determination of RNA structural diversity and its role in HIV-1 RNA splicing.</a> Nature. 582 (7812), (2020).</li>
<li>Zubradt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMS-MaPseq+for+genome-wide+or+targeted+RNA+structure+probing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo.</a> Nature Methods. 14 (1), (2017).</li>
<li>Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+intermediates+in+RNA+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Compact intermediates in RNA folding.</a> Annual Reviews in Biophysics. 39, (2010).</li>
<li>Morandi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+deconvolution+of+RNA+structure+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-scale deconvolution of RNA structure ensembles.</a> Nature Methods. 18 (3), 249-252 (2021).</li>
<li>Olson, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+large-scale%2C+cell-state-responsive+allosteric+switch+in+the+7SK+RNA+using+DANCE-MaP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Discovery of a large-scale, cell-state-responsive allosteric switch in the 7SK RNA using DANCE-MaP.</a> Molecular Cell. 82 (9), 1708-1723 (2022).</li>
<li>Incarnato, D., Morandi, E., Simon, L. M., Oliviero, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Framework%3A+An+all-in-one+toolkit+for+the+analysis+of+RNA+structures+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA Framework: An all-in-one toolkit for the analysis of RNA structures and post-transcriptional modifications.</a> Nucleic Acids Research. 46 (16), (2018).</li>
<li>Lan, T. C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+structural+ensembles+of+the+SARS-CoV-2+RNA+genome+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Secondary structural ensembles of the SARS-CoV-2 RNA genome in infected cells.</a> Nature Communications. 13 (1), 1128(2022).</li>
<li>Homan, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+correlated+chemical+probing+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule correlated chemical probing of RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (38), 13858-13863 (2014).</li>
<li>Yang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+SARS-CoV-2+interactions+in+vivo+reveals+functional+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of SARS-CoV-2 interactions in vivo reveals functional virus-host interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5113(2021).</li>
<li>Manfredonia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+SARS-CoV-2+RNA+structures+identifies+therapeutically-relevant+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of SARS-CoV-2 RNA structures identifies therapeutically-relevant elements.</a> Nucleic Acids Research. 48 (22), 12436-12452 (2020).</li>
<li>Fischer, N. M., Polěto, M. D., Steuer, J., vander Spoel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Na%2B+and+Mg2%2B+ions+on+RNA+structures+studied+with+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Influence of Na+ and Mg2+ ions on RNA structures studied with molecular dynamics simulations.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 4872-4882 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

הפרוטוקול כאן מתאר כיצד לחקור RNA במבחנה ובתאים באמצעות ניסויי פרופיל מוטציה של DMS. יתר על כן, הוא נותן הוראות כיצד להכין ספריות לריצוף Illumina כדי ליצור נתונים ספציפיים לגנים ולנתח את קבצי ה- .fastq המתקבלים. בנוסף, ניתן להשתמש בגישות ספרייה כלל-גנומית. עם זאת, RT-PCR ספציפי לגן מפיק את הנתונים האיכותיים והחזקים ביותר. לכן, אם משווים בין דוגמאות, חשוב לוודא שהם מוכנים עם אסטרטגיות רצף זהות, שכן יצירת הספרייה גורמת להטיה מסוימת. תמיד יש למדוד את יכולת השכפול באמצעות משכפלים.
מספר אמצעי זהירות רנ"א היא מולקולה לא יציבה הרגישה להתפרקות הן באמצעות טמפרטורות גבוהות והן על ידי RNases. לכן, מומלץ להשתמש באמצעים מיוחדים - שימוש בציוד מגן אישי (PPE), חומר נטול RNAse ומעכבי RNAse. והכי חשוב, RNA צריך להישמר על קרח במידת האפשר. זה חל במיוחד על RNA מתילציה, אשר רגיש עוד יותר לטמפרטורות גבוהות.
חשוב לוודא שמבנה הרנ"א אינו רגיש לריכוז ה-DMS ולתנאי החיץ. מאגרים כגון 100 mM Tris, 100 mM MOPS ו- 100 mM HEPES ב- pH 7-7.5 נותנים אות גבוה אך עשויים שלא להספיק כדי לשמור על ה- pH במהלך התגובה21. כאשר DMS עובר הידרוליזה במים, מה שמפחית את ה-pH, חיץ חזק הוא קריטי לשמירה על pH נייטרלי במהלך תגובת השינוי. התוספת של bicine הוכחה כמסייעת לשמור על ה- pH כבסיסי מעט21 אך גורמת לשינוי DMS נמוך ב- Gs ו- Us, אשר יכול להיות אינפורמטיבי אך יש לנתח אותו בנפרד בשל ייצור אות נמוך בהרבה מאשר As ו- Cs ואינו נדון בהמשך פרוטוקול זה.
ב-RT-PCR ספציפי לגנים, הרנ"א המהונדס מתועתק לאחור לתוך הדנ"א ומוגבר בשברים על ידי PCR. בעוד שגודל הרנ"א יכול תיאורטית להיות בלתי מוגבל, מקטעי PCR אלה לא יעלו על אורך של 400-500 זוגות בסיסים (bp) כדי למנוע הטיה במהלך תגובת השעתוק ההפוכה. באופן אידיאלי, השברים צריכים להיות בטווח של הרצת הרצף (כלומר, אם הרצף מתבצע באמצעות תוכנית ריצוף של 150 x 150 מחזור, מקטע יחיד לא יעלה על 300 bp). בעת שימוש בתוכניות ריצוף עם פחות מחזורים, ניתן לפצל את מוצרי ה-PCR באמצעות dsDNase. יתר על כן, מכיוון שרצפים בתוך רצפי הפריימר אינם מכילים מידע מבני כלשהו, השברים חייבים לחפוף כאשר הרנ"א הנחקר כולל מקטע >1. תגובות RT יכולות להכיל פריימרים מרובים של RT עבור מקטעים שונים (עד 10 פריימרים שונים של RT). בהתאם לרצפים, איגום פריימרים RT יכול להפוך את השעתוק ההפוך לפחות יעיל, אך בדרך כלל עובד היטב. כל תגובת PCR צריכה להתבצע בנפרד.
כאשר חוקרים RNA עם DMS, תנאי הניסוי ממלאים תפקיד נוסף, שכן רנ"א רבים אינם יציבים מבחינה תרמודינמית ומשנים את הקונפורמציה שלהם בהתבסס על גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה. כדי למנוע אי סדרים, יש לשמור על תנאי הניסוי קבועים ככל האפשר, גם ביחס לזמני התגובה. נראה כי תנאי החיץ ניתנים להחלפה במידה מסוימת 17,20,22,23 כאשר התנאים הבסיסיים נשמרים - יכולת האגירה והנוכחות של יונים חד-ערכיים (Na) ודיוולנטיים (Mg) - כדי להבטיח קיפול תקין של RNA 24.
לגבי הכנת הספרייה של רנ"א שונה, יש לקחת בחשבון מספר היבטים. ראשית, כפי שצוין קודם לכן, רנ"א שעברו שינוי הם פחות יציבים ממקביליהם שלא שונו, כלומר הם עשויים לדרוש אופטימיזציה של זמני הפיצול להתפלגות אופטימלית של גודל השבר. יתר על כן, ערכות הכנה מסוימות של ספריית RNA, כמו גם גישות RNAseq רבות אחרות, משתמשות בפריימרים אקראיים בערכת השעתוק ההפוכה. זה עלול להוביל לכיסוי נמוך יותר של הייחוס, במיוחד ב-3' של גן, ובסופו של דבר, לעומק כיסוי לא מספיק. אם הכיסוי של אזור מסוים נמוך מדי, ייתכן שיהיה צורך להסיר בסיסים אלה מחיזוי המבנה. מלבד ערכות RT-PCR ו-RNAseq של גנום שלם, ניתן להשתמש בגישות אחרות להכנת ספרייה. פרוטוקולים הכוללים קשירת מתאמי 3' ו/או 5' ל-RNA הם יתרון כאשר משתמשים בשברי RNA קטנים או כאשר יש להימנע מאובדן מידע בדיקה באזורי הפריימר.
לבסוף, יש לפרש תמיד בזהירות את ניתוח הניסויים הכימיים. נכון לעכשיו, אין תוכנה המנבאת את מבנה הרנ"א של כל רנ"א מהרצף לבדו בדיוק גבוה. למרות שאילוצים של בדיקה כימית משפרים מאוד את הדיוק, יצירת מודלים טובים עבור רנ"א ארוך (>500 nt) עדיין מאתגרת. מודלים אלה צריכים להיבדק עוד יותר על ידי גישות אחרות ו/או מוטגנזה. תוכנת חיזוי RNA מבצעת אופטימיזציה למספר המרבי של זוגות בסיסים, ובכך מענישה באופן משמעותי קונפורמציות פתוחות, שאולי אינן מייצגות במדויק קיפול RNA5. לפיכך, יש לבחון את מודל המבנה המתקבל על ידי כימות הסכם החיזוי עם נתוני הבדיקה הכימיים הבסיסיים (למשל, על ידי AUROC) ובין שכפולים (למשל, על ידי mFMI), כפי שהודגם על ידי Lan et al.20.
באופן אידיאלי, יש להשתמש במספר ניסויים במערכות שונות כדי לאתגר את מודל המבנה המתקבל כדי לחזק את ההשערה. אלה יכולים לכלול שימוש בגישות חוץ גופיות ובתוך התא, מוטציות מפצות וקווי תאים ומינים שונים. יתר על כן, תגובות גולמיות הן לעתים קרובות אינפורמטיביות באותה מידה או אפילו יותר מאשר תחזיות מבנה, מכיוון שהן מתעדות את תמונת "האמת הקרקעית" של אנסמבל קיפול הרנ"א. ככזה, תגובתיות גולמית מתאימה מאוד ואינפורמטיבית להשוואת שינויי מבנה בין תנאים שונים. חשוב לציין שמבני האנרגיה החופשית הנמוכים ביותר המחושבים באמצעות אילוצי בדיקה כימית עם חיזוי חישובי צריכים לשמש רק כהשערת מוצא לקראת מודל מבנה שלם.

מאז הגילוי שלרנ"א יש תכונותמבניות של 1,2 וגם תכונותקטליטיות 3, נחשפו בהדרגה חשיבותו של הרנ"א ותפקודו הרגולטורי במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. ואכן, ההשפעה של מבנה הרנ"א על ויסות גנים זכתה לתשומת לב גוברת4. בדומה לחלבונים, לרנ"א יש מבנים ראשוניים, משניים ושלישוניים, המתייחסים לרצף הנוקלאוטידים, למיפוי הדו-ממדי של אינטראקציות זיווג-בסיס, ולקיפול התלת-ממדי של מבנים אלה המזווגים בבסיס, בהתאמה. בעוד שקביעת המבנה השלישוני היא המפתח להבנת המנגנונים המדויקים העומדים מאחורי תהליכים תלויי RNA, המבנה המשני הוא גם אינפורמטיבי מאוד לגבי תפקוד הרנ"א והוא הבסיס לקיפול תלת-ממדי נוסף5.
עם זאת, קביעת מבנה הרנ"א הייתה מאתגרת במהותה בגישות קונבנציונליות. בעוד שעבור חלבונים, קריסטלוגרפיה, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ומיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) אפשרו לקבוע את מגוון המוטיבים המבניים, מה שמאפשר חיזוי מבנה מהרצף בלבד6, גישות אלה אינן ישימות באופן נרחב על רנ"א. ואכן, רנ"א הן מולקולות גמישות עם אבני בניין (נוקלאוטידים) שיש להן הרבה יותר חופש קונפורמציה וסיבובי בהשוואה למקבילותיהן בחומצות אמינו. יתר על כן, האינטראקציות באמצעות זיווג בסיסים הן דינמיות ורב-תכליתיות יותר מאלו של שאריות חומצות אמינו. כתוצאה מכך, גישות קלאסיות הצליחו רק עבור רנ"א קטנים יחסית עם מבנים מוגדרים היטב וקומפקטיים מאוד7.
גישה נוספת לקביעת מבנה הרנ"א היא באמצעות בדיקה כימית בשילוב עם ריצוף מהדור הבא (NGS). אסטרטגיה זו מייצרת מידע על מצב הקשירה של כל בסיס ברצף RNA (כלומר, המבנה המשני שלו). בקצרה, הבסיסים במולקולת RNA שאינם עוסקים בזיווג בסיסים משתנים באופן דיפרנציאלי על ידי תרכובות כימיות קטנות. תמלול לאחור של רנ"א אלה באמצעות תעתיק הפוך מיוחד (RTs) משלב את השינויים בחומצה דאוקסיריבונוקלאית משלימה (cDNA) כמוטציות. מולקולות cDNA אלה מוגברות לאחר מכן על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ומרוצפות. כדי לקבל מידע על "מצבם" כמאוגדים או לא מאוגדים, תדרי המוטציות בכל בסיס ברנ"א של עניין מחושבים ומוכנסים לתוכנת חיזוי מבנה כאילוצים8. בהתבסס על כללי השכן הקרוב ביותר9 וחישובי אנרגיה חופשית מינימליים 10, תוכנה זו מייצרת מודלים מבניים המתאימים ביותר לנתונים הניסיוניים שהתקבלו11,12.
DMS-MaPseq משתמש ב-DMS, אשר מתילציה של חנקן N1 באדנוסינים וחנקן N3 בציטוזינים על פני ווטסון-קריק שלהם באופן ספציפי מאוד13. שימוש בטרנסקריפטאז הפוך (TGIRT-III) מקבוצה תרמוספטיבית II (TGIRT-III) בתעתיק הפוך יוצר פרופילים מוטציוניים עם יחסי אות לרעש חסרי תקדים, ואף מאפשר פירוק של פרופילים חופפים הנוצרים על ידי שני קונפורמציות חלופיות או יותר14,15. יתר על כן, DMS יכול לחדור לקרומי תאים ולרקמות שלמות, מה שהופך את הבדיקה בהקשרים פיזיולוגיים לאפשרית. עם זאת, יצירת נתונים באיכות טובה היא מאתגרת, מכיוון ששינויים בהליך הטיפול יכולים להשפיע על התוצאות. לכן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט הן למבחנה והן ל-DMS-MaPseq בתוך התא כדי להפחית את ההטיה ולהנחות מצטרפים חדשים לשיטה דרך הקשיים שהם עלולים להיתקל בהם. במיוחד לאור מגיפת SARS-CoV2 האחרונה, נתונים באיכות גבוהה על נגיפי RNA הם כלי חשוב לחקר ביטוי גנים ומציאת טיפולים אפשריים.

<table><tbody><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>10787018</td><td>תרמו</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>M6250-250 מ"ל</td><td>חומצה סיגמא-פנול</td><td></td></tr><tr><td>: כלורופורם, pH 4.5</td><td>AM9720</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>Advantage PCR</td><td>639206</td><td>Takara</td><td></td></tr><tr><td>CloneAmp HiFi PCR Premix</td><td>639298</td><td>Takara</td><td></td></tr><tr><td>DMS</td><td>D186309 &nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 10 מ"מ כל אחד</td><td>U151B</td><td>Promega</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel EX ג'ל אגרוז, 2%</td><td>G402022</td><td>ג'ל אגרוז תרמו טרומי</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (200 הוכחה)</td> <td>E7023-4X4L</td> צינורות <td>סיגמא</td><td></td></tr><tr><td>פלקון, 15 מ"ל, 50 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr> תאי HCT-8 <tr><td>משקעים משותפים</td>של<td>GlycoBlue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ATCC #CCL-244</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; MgCl2&nbsp; (1 מ')</td><td>AM9530G</td><td>fisherscientific</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>278475</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 תמלול</td><td>AM1334</td><td></td> ספקטרופוטומטר <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Thermo<td>NanoDrop</td></tr><tr><td>Novex TBE ג'לים, 8%, 10 באר</td><td>EC6215BOX</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>OC43&nbsp;</td><td>ATCC #VR-1558</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboRuler סולם RNA לטווח נמוך</td><td>SM1831</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>RNAse H</td><td>M0297L</td><td>NEB</td><td></td></tr><tr><td>נתרן קקודילאט, 0.4 M, pH 7.2</td><td>102090-964</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן הידרוקסיד</td><td>S8263-150ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase עבור FSB ו-DTT</td><td>18064014</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>TGIRT-III אנזים</td><td>TGIRT50</td><td>Ingex</td><td></td></tr><tr><td>The Oligo Clean & רכז</td><td>D4060</td><td>Genesee</td><td></td></tr><tr><td>ה-RNA נקי & ערכות ריכוז הן ערכות ניקוי RNA</td><td>R1016</td><td>Genesee</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol ריאגנטים</td><td>15596018</td><td>ריאגנט בידוד RNA</td><td>תרמו</td></tr><tr><td>מים, (לעבודת RNA) (מטופל DEPC, DNASE, ללא RNASE/Mol. Biol.)</td><td>BP561-1</td><td>fisherscientific</td><td></td></tr><tr><td>xGen ספריית RNA רחבת טווח הכנה 16rxn</td><td>10009865</td><td>IDT</td><td></td></tr><tr><td>Zymo RNA עמודות נקיות ומרכזיות</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת מבנה rna עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells

תפקידו של מבנה הרנ"א כמעט בכל תהליך ביולוגי נעשה ברור יותר ויותר, במיוחד בעשור האחרון. עם זאת, גישות קלאסיות לפתרון מבנה RNA, כגון קריסטלוגרפיה של RNA או cryo-EM, לא הצליחו לעמוד בקצב של התחום המתפתח במהירות והצורך בפתרונות בעלי תפוקה גבוהה. פרופיל מוטציה עם ריצוף באמצעות דימתיל סולפט (DMS) MaPseq היא גישה מבוססת ריצוף כדי להסיק את מבנה הרנ"א מתגובתיות הבסיס עם DMS. DMS מתילאט את החנקן N1 באדנוסינים ואת N3 בציטוזינים על פני ווטסון-קריק שלהם כאשר הבסיס אינו מזווג. תמלול לאחור של הרנ"א המתוקן עם הטרנסקריפטאז ההפוך של הקבוצה התרמוספטיבית II (TGIRT-III) מוביל לכך שהבסיסים שעברו מתילציה משולבים כמוטציות ב-cDNA. כאשר מריצפים את ה-cDNA המתקבל וממפים אותו בחזרה לתעתיק ייחוס, שיעורי המוטציה היחסיים עבור כל בסיס מעידים על "מצבו" של הבסיס כמזווג או לא מזווג. למרות שלתגובתיות DMS יש יחס אות לרעש גבוה הן במבחנה והן בתאים , שיטה זו רגישה להטיה בהליכי הטיפול. כדי להפחית את ההטיה הזו, מאמר זה מספק פרוטוקול לטיפול ב-RNA עם DMS בתאים ועם רנ"א מתועתק במבחנה .

DMS-MaP ספציפי לגנים במבחנה כדי לחקור את ה-5'UTR של SARS2, הוזמנו 300 ה-bp הראשונים של הנגיף כרצף gBlock, לצד שלושה פריימרים. אלה כללו שני פריימרים להפצת השבר ("FW" ו-"RV") באמצעות PCR, וכן אחד לחיבור מקדם T7 ("FW-T7"). ניתן לראות רצפים אלה בטבלה 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם</td>
			<td>רצף (5'-&gt;3')</td>
		</tr><tr><td>פ.וו.</td>
			<td>ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC</td>
		</tr><tr><td>קרוואן</td>
			<td>GCAAACTGAGTTGGACGTGT</td>
		</tr><tr><td>FW-T7</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGG ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: רצף פריימר עבור DMS-MaP RT-PCR של SARS-CoV2 5'UTR. כאן, FW-T7 ו- RV נדרשים ליצירת תבנית DNA לתעתיק חוץ גופי , ה- RV משמש בתעתיק ההפוך וזוג הפריימרים של FW-RV משמש בהגברת ה- PCR הבאה של ה- cDNA. הפריימרים מתקרבים לתחילת הגנום של SARS-CoV2 (FW) והרצף ממש במורד הזרם של אזור העניין. קיצורים: DMS-MaP = פרופיל מוטציה עם ריצוף באמצעות דימתיל סולפט; RT-PCR = תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור; SARS-CoV2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה-קורונה 2; UTR = אזור לא מתורגם; RV = פריימר הפוך; FW = פריימר קדימה.
כדי ליצור רנ"א מקטע gBlock, הרצף של מקדם הפולימראז T7 חובר באמצעות PCR חופף באמצעות פרמיקס PCR לפי הסכימה שנראתה באיור 2A. מהקטע המוארך, רנ"א נוצר באמצעות ערכת השעתוק T7. תבנית הדנ"א עוכלכה לאחר מכן באמצעות ה-DNase וה-RNA שבודדו באמצעות עמודות RNA Clean ו-Concentrator.
בקרת האיכות של השעתוק במבחנה נעשתה על ידי הרצת מוצר ה-RNA על ג'ל אגרוז 1% לצד סולם ssRNA. מכיוון שהייתה רק רצועה אחת גלויה, בוצעו בדיקות DMS במבחנה ו-RT-PCR (ראו איור 2B).
כדי לאמת את הצלחת תגובת ה-PCR, הדגימה הופעלה על ג'ל אגרוז של 2% באמצעות סולם dsDNA. לאחר יצירת האינדקס, הרצועה צריכה לרוץ ~ 150 bp גבוה יותר על אותו ג'ל, בהתחשב בגודל של פריימרים אינדקס.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig2v2.jpg"> איור 2: שעתוק חוץ גופי של תבנית הדנ"א. (א) כדי לתמלל במבחנה תבנית דנ"א שעדיין אין לה מקדם RNA פולימראז פנימי, יש לחבר את התבנית על ידי חפיפה PCR תחילה. זה נעשה באמצעות פריימר קדימה, הכולל את הרצף TAATACGACTCACTATAGG (במקרה של T7 RNA פולימראז) במעלה הזרם של הבסיסים הראשונים חופפים עם השבר הרצוי. הבסיס המסומן בקו תחתון כאן מסמל את אתר התחלת השעתוק של הפולימראז. לאחר שהמקדם התחבר למקטע dsDNA, ניתן לתמלל אותו על ידי פולימראז T7. חשוב לציין שהפולימראז משתמש בגדיל המתנגד לרצף המקדם שהוזכר כתבנית (כחול), ולמעשה יוצר RNA זהה לרצף מיד במורד הזרם של רצף המקדם המצוין (אדום). (B) ג'ל אגרוז 1% עם סולם ssRNA (נתיב 1) ותוצר RNA מתועתק במבחנה ב-300 nt (נתיב 2). (C) ג'ל אגרוז של 2% עם GeneRuler 1 קילו פלוס סולם (נתיב 1), מוצר ה-PCR לאחר RT-PCR הפועל ב-300 כ"ס (נתיב 2), והמקטע האינדקס לאחר הכנת הספרייה בריצה של 470 כ"ס (נתיב 3). קיצורים: RT-PCR = תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור; DMS = דימתיל סולפט; nt = נוקלאוטידים; dsDNA = דנ"א דו-גדילי; ssRNA = RNA חד-גדילי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
גנום שלם in vivo DMS-MaP באמצעות תאים נגועים בנגיף לפני הטיפול ב-DMS, תאי ה-HCT-8 היו נגועים ב-OC43. כאשר נצפתה השפעה ציטופתית (CPE) 4 ימים לאחר ההדבקה (dpi) (כפי שניתן לראות באיור 3A), התאים האלה טופלו, והרנ"א הופק וריבודפל. בעת הרצת הרנ"א הכולל על ג'ל אגרוז, נראו שני פסים בהירים, המהווים את יחידות המשנה 40S ו-60S של הריבוזום, המהוות כ-95% ממסת הרנ"א הכוללת (ראו איור 3B). כאשר מיצוי הרנ"א לא הצליח או נפגע (למשל, על-ידי מחזורי הפשרה מרובים של הקפאה), תוצרי פירוק הרנ"א נראו בתחתית הג'ל (ראו איור 3C, נתיב שני). יתר על כן, לאחר הידלדלות ה-rRNA, שני הפסים הבהירים נעלמו, והותירו כתם בנתיב (ראו איור 3C, נתיב שלישי). לבסוף, לאחר הכנת הספרייה, הדגימות היו בחלוקות בגדלים שונים והוצגו ככתם על ג'ל PAGE הסופי. הרצועה נכרתה בין 200 נוקלאוטידים (nt) ל-500 nt, בהסכמה עם ריצת הריצוף הזוגית בגודל 150 x 150 שתוכננה לנתח ספריות אלה. והכי חשוב, דימרים של מתאמים שפועלים ב~150 nt הופרדו החוצה (ראו איור 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig3v2.jpg"> איור 3: מחסומים של in vivo DMS-MaP עם תאים נגועים בנגיף. (A) תמונת מיקרוסקופיה קלה של תאי HCT-8 נגועים בנגיף, 4 ימים dpi. כדי להשיג את התפוקה הגבוהה ביותר האפשרית של RNA נגיפי מסך הרנ"א תוך מזעור ההשפעות השליליות עקב מוות תאי, יש להוסיף DMS כאשר CPE מתחיל או אפילו לפני כן, כפי שניתן לראות בתמונה. (B) ג'ל אגרוז 1% עם שש דגימות של 1 מיקרוגרם של RNA כולל. בכל נתיב נראים שני פסים בהירים, המהווים את יחידות המשנה 40S ו- 60S, מכיוון ש- RNA ריבוזומלי מהווה ~ 95% מסך ה- RNA. הערה: טיפול ב-DMS בתוך התא גורם לפיצול ולמריחה מסוימת של RNA, אך שני רצועות ה-rRNA עדיין צריכות להיות גלויות. פיצול קל לאחר שינוי נסבל מכיוון שהמידע המכיל את סימן המתילציה נוצר ומדווח על מבנה הרנ"א במהלך דגירה של DMS בזמן שהתאים עדיין בחיים. (C) ג'ל אגרוז 1% של GeneRuler 1 kb בתוספת סמן DNA סולם (נתיב 1) סך RNA שאוחסן בעבר בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים (נתיב 2) ורנ"א ריבודפל (נתיב 3). כאשר מאחסנים RNA במשך זמן רב עם מספר מחזורי הפשרה בהקפאה, הרנ"א מתחיל להתדרדר ואולי אין להשתמש בו לניסויים ניסיוניים. יתר על כן, לאחר ריבודפל הרנ"א הכולל, שני הפסים הבהירים, המהווים את יחידות המשנה 40S ו-60S של הריבוזום, דהייה וכתם של שאריות ה-RNAs מתחילים להראות. (D) ג'ל PAGE של GeneRuler 1 kb בתוספת סמן DNA סולם (נתיב 1) ודגימת ספרייה של RNA מוכן לגנום שלם. יש לכרות את הג'ל בהתאם לצרכי הרצף. עבור ריצת ריצוף זוגית, המתפרשת על פני 150 מחזורים משני הצדדים, יש לכרות את הג'ל בין 300 כ"ס ל-500 כ"ס. יש להפריד בין דימרים של מתאמים (הפועלים ב-170 כ"ס). קיצורים: DMS-MaP = פרופיל מוטציה עם ריצוף באמצעות דימתיל סולפט; dpi = ימים לאחר ההדבקה; CPE = אפקט ציטופתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
לאחר הרצף, קבצי ה- .fastq נותחו על-ידי שליחת עבודה לשרת האינטרנט DREEM (http://rnadreem.org/), יחד עם קובץ הפניה מסוג .fasta. הפלט שנוצר על ידי השרת כולל קבצי בקרת איכות שנוצרו על ידי fastqc (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) ו- TrimGalore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), כמו גם קבצי פלט אחרים המכילים את תדרי המוטציה הממוצעת של האוכלוסייה. מלבד הדיאגרמה המציגה את תדרי המוטציות בתבנית אינטראקטיבית .html (ראו איור 4A) וקובץ .csv עם ההפעלות הגולמיות לכל בסיס וקובץ struct_constraint.txt, הניתן לקריאה על ידי מספר תוכנות חיזוי מבנה RNA, זה כולל גם קובץ bitvector.txt המדווח על המוטציות שנקראו. מתוך אלה, המבנים הממוצעים של האוכלוסייה חושבו על ידי שליחת קבצי .fasta ו- struct_constraint.txt לשרת האינטרנט RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi). זה משתמש בתוכנת ViennaRNA כדי ליצור תחזיות מבנה המבוססות על האנרגיה החופשית המינימלית, אשר ניתן לצפות באינטרנט או להוריד בפורמט ct או וינה. כדי ליצור מודלים של מבנה רנ"א, הקבצים האלה להורדה נשלחו ל-VARNA (https://varna.lri.fr/, ראו איור 4B). לבסוף, קבצים .txt bitvector יכולים לשמש את הגרסה היציבה של DREEM (https://codeocean.com/capsule/6175523/tree/v1) כדי לחפש קונפורמציות RNA חלופיות. כדי להשיג מודלים של מבנה טוב באמצעות DREEM, יש להשיג כיסוי של 10,000 קריאות לכל בסיס; עבור קיבוץ באשכולות, ייתכן שיידרשו עד 100,000 קריאות לכל בסיס. סקירה כללית של זרימת העבודה כולה ניתן למצוא באיור 4C.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig4v2.jpg"> איור 4: נתונים לדוגמה שהתקבלו מניסויי בדיקה כימיים של SARS-CoV2 5'UTR. (A) פרופיל תגובתיות של 300 הבסיסים הראשונים של הגנום של SARS-CoV2 הצבועים לפי בסיס (A: אדום, C: כחול, U: ירוק, G: צהוב). התגובות הגולמיות מחושבות כתדירות המוטציה המוחלטת חלקי הכיסוי. לבסיסים עם קונפורמציה פתוחה יש ערכי תגובתיות גבוהים; לבסיסים העוסקים בזיווג בסיסים יש ערכי תגובתיות נמוכים. אתה ו-G אינם משתנים על-ידי DMS ויש להם ערכי תגובתיות נמוכים, שמקורם בבגידה בפולימראז. התחזיות נעשו עם שרת האינטרנט DREEM. (B) מודל המבנה של SARS-CoV2 5'UTR שנחזה מערכי תגובתיות שנעשו עם VARNA. בסיסים עם ערכי תגובתיות גבוהים צבועים באדום; בסיסים עם ערכי תגובתיות נמוכים צבועים בלבן. (C) זרימת עבודה של ניתוח DMS-MaP החל מקבצי .fastq המתקבלים מרצף. אלה יכולים להיות מבוקרי איכות באמצעות fastqc; רצפי המתאם נחתכים באמצעות TrimGalore ולאחר מכן ממופים בחזרה לרצף ייחוס באמצעות Bowtie2. מקבצי ה- .bam המתקבלים, DREEM סופר את המוטציות בכל קריאה, ויוצר מפת מוטציות או קובץ .bitvector.txt. אלה מדווחים על המוטציות של כל קריאה באופן תלוי מיקום, שעל בסיסו ניתן ליצור פרופילי תגובתיות ממוצעים של האוכלוסייה. לחלופין, ניתן לקבץ סיביות באמצעות DREEM כדי לחפש קונפורמציות RNA חלופיות. לבסוף, מודלי המבנה המתקבלים מוצגים באופן חזותי באמצעות תוכנה (למשל, VARNA). קיצורים: DMS-MaP = פרופיל מוטציה עם ריצוף באמצעות דימתיל סולפט; SARS-CoV2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה-וירוס קורונה 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

הפרוטוקול מספק הוראות לשינוי RNA עם דימתיל סולפט לניסויים בפרופיל מוטציות. הוא כולל בדיקה במבחנה ו - in vivo עם שתי שיטות הכנה חלופיות לספרייה.

בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

The role of RNA structure in virtually any biological process has become increasingly evident, especially in the past decade. However, classical ...

DMS-MaP היא שיטה מבוססת ריצוף המאפשרת לנו לקבל תמונת מצב של מבנה הרנ"א, וללמוד כיצד הוא משתנה בתנאים שונים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות לקביעת מבנה, כמו קריסטלוגרפיה ומיקרוסקופיית אלקטרונים, ניתן להשתמש ב-DMS-MaP בתאים ובהרכבי מבנה RNA דה-קונבולוטיים. מכיוון שלמבנה הרנ"א יש השלכות על שלל תופעות ביולוגיות, השיטה שלנו יכולה לספק תובנות מכניסטיות כמעט בכל תחום של מחקר ביולוגי.התחל על ידי העברת 89 מיקרוליטרים של המאגר המתקפל לתוך צינור ייעודי של 1.5 מיליליטר עבור כל תגובה בעלת נפח סופי של 100 מיקרוליטר. מחממים את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמושייקר המונח מתחת למכסה המנוע הכימי. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לתוך צינור PCR, והעבירו לתוכו 10 פיקומולים של RNA.דגרו אותו בתרמוציקלר בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי לנטרל את הרנ"א. ואז מיד להניח את הצינור על גוש קרח כדי למנוע קיפול שגוי של RNA. כעת, כדי לשחזר את הרנ"א, הוסיפו את הדגימה לצינור הייעודי המכיל את החיץ המתקפל מחדש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וערבבו היטב לפני הדגירה שלו במשך 10 עד 20 דקות.לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של 100% דימתיל סולפט, או DMS, בעל ריכוז של 10.5 טוחנת לתוך הצינור המכיל את דגימת ה- RNA, ודגירה של תערובת התגובה במשך חמש דקות תוך ניעור זה 800 עד 1, 400 סיבובים לדקה. לאחר התגובה בת חמש הדקות, הרוו אותה עם 60 מיקרוליטרים של 100% בטא-מרקפטואתנול, וערבבו אותה היטב לפני המערבולת ומיד מניחים את הרנ"א על הקרח. לאחר מכן נקו את הרנ"א והכניסו אותו ל-10 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז.לכמת את הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. לבסוף, לאחסן את RNA שונה במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הוספת תערובת התגובה לצינור ה-PCR, העבירו לפחות 100 ננוגרם של ה-RNA המותאם ב-10 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לצינור ה-PCR.לדגום את התערובת בטמפרטורה של 57 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד 1.5 שעות בתרמו-ציקלר. 30 דקות מספיקות כדי ליצור מוצר המכיל 500 נוקלאוטידים. לאחר מכן, מוסיפים לו מיקרוליטר אחד של ארבעה נתרן הידרוקסיד טוחנת, מערבבים היטב על ידי פיפטה, ודוגרים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות כדי להשפיל את הרנ"א, ולשחרר TGIRT מהדנ"א המשלים.באמצעות גישה מבוססת עמודות להסרת הפריימרים, נקו את הדנ"א המשלים. ולבצע PCR כדי להגביר אותו. ודא את הצלחת ה- PCR על ידי הפעלת שני מיקרוליטרים של מוצר ה- PCR על ג'ל אגרוז לפני שתמשיך להכנת הספרייה.לאחר מכן כימתו את השברים שחולצו באמצעות ספקטרופוטומטר לפני יצירת אינדקס של השברים לריצוף. העבירו את התאים הנגועים בנגיף שגודלו לשלב ההדבקה הרצוי לתוך קולט אדים ייעודי ומתאים בעל רמת הבטיחות הביולוגית הנדרשת. הוסף נפח של 2.5% של DMS למדיום התרבית המכיל את התאים, ואטם את המיכל באמצעות פרפילם.מיד לדגור את המיכל ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, יש לבצע פיפטה בזהירות ולהשליך את המדיום המכיל DMS לפסולת כימית מתאימה. לאחר מכן מוסיפים בעדינות 10 מיליליטר של מאגר עצירה לתוך התאים, מגרדים את התאים ומעבירים אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.גלולה למטה את התאים על ידי צנטריפוגה הצינור במשך שלוש דקות ב 3, 000 גרם. הסר את supernatant, ולשטוף את כדור התא פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS. הסר בזהירות PBS שיורי ככל האפשר לאחר הכביסה.ממיסים את הכדור בכמות מתאימה של מגיב בידוד RNA לביצוע מיצוי RNA. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של כלורופורם למיליליטר אחד של תאים הומוגניים בריאגנט בידוד RNA, ומערבבים אותו למשך 15 עד 20 שניות עד שתמיסת התא הופכת ורודה בהירה. המתן עד שהתרחשה הפרדת פאזה, המסומנת על ידי שלב השומנים הוורוד המתיישב בתחתית.סובב את הצינור במהירות של כ -20, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני העברת השלב המיימי העליון לצינור חדש. נקו את ה-RNA והוסיפו כמות מספקת של מים נטולי נוקלאזות. לאחר מכן, לאחר ביצוע דלדול RNA ריבוזומלי בגישה המועדפת, יש לדחוס את הרנ"א בנפח הולם של מים נטולי נוקלאזה, ולכמת אותו באמצעות ספקטרופוטומטר.ניתן להשתמש שוב ב-RNA המטוהר ב-RT-PCR. באמצעות שרת האינטרנט שהוזכר, ניתן לנתח בנוחות את נתוני DMS-MaP. הקריאות ממופות להפניה, והמוטציות לכל בסיס נספרות.הקבצים הממוצעים של האוכלוסייה המתקבלים יכולים לשמש כאילוצים בתוכנת חיזוי מבנה RNA ידועה. ניתן לדמיין את מבני האנרגיה החופשית המינימליים המתקבלים באמצעות תוכנה כמו VARNA. נכון לעכשיו, רק הגרסה היציבה של DREAM יכולה לנטרל הרכבי מבנה RNA.עם זאת, העבודה כדי להפוך תכונה זו לנגישה יותר לכל הקהילה נמצאת בעיצומה. שעתוק במבחנה של מקטע gBlock המוארך על ידי חיבור של מקדם פולימראז T7 יצר את ה-RNA המעניין, והופיע כלהקה יחידה ב-300 נוקלאוטידים על ג'ל 1%agarose. ההצלחה של RT-PCR ספציפי לגן שבוצע על RNA שונה DMS צוינה על ידי פס יחיד ב 300 זוגות בסיס על ג'ל 2% agarose.הקטע האינדקס הופיע כ-150 זוגות בסיסים גבוה כצפוי. טיפול DMS בוצע בתאי HCT-8 בעלי השפעה ציטופתית ארבעה ימים לאחר ההדבקה בנגיף. הרנ"א הכולל שחולץ הופיע על ג'ל האגרוז כשני פסים בהירים, המהווים את יחידות המשנה 40S ו-60S.לאחר דלדול הרנ"א הריבוזומלי, נעלמו שני הפסים הבהירים, והותירו כתם בנתיב המתאים. לאחר הכנת הספרייה, הדוגמאות היו בחלוקות בגדלים שונים והופיעו כמריחה. הרצועה נכרתה בין 200 ל-500 נוקלאוטידים, ודימרים של המתאם הופרדו החוצה.מודל המבנה של הגנום של SARS-CoV-2 הראה כי לבסיסים עם קונפורמציה פתוחה יש תגובתיות גבוהה יותר בהשוואה לאלה העוסקים בזיווג בסיסים. פרופיל התגובה של הבסיסים הצביע על כך שלאורציל וגואנין היו ערכי תגובתיות נמוכים ולא שונו על ידי DMS. בעזרת השיטה שלנו, אנו מסוגלים לחזות מבנים בתאים באופן בעל תפוקה גבוהה ללא מגבלות גודל.מדדי בקרה חשובים מאוד, מכיוון שהם מספקים תובנה לגבי הדיוק של תחזיות המבנה. כדי לאמת עוד יותר את דיוק החיזוי, יש לערוך ניסויים נוספים שמפריעים או משנים את המבנה.

probing-rna-structure-with-dimethyl-sulfate-mutational-profiling-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

חלבונים שקושרים רצפי RNA ספציפיים ממלאים תפקידים חיוניים בביטוי הגנים. אפיון מפורט של אתרים אלה מחייב חיוני להבנת הכונה. . הנה, מתואר בגישה צעד אחר צעד עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA. גישה זו היא רלוונטית עבור כל האתרים מחייב חלבון ה-RNA.

בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

פרוטוקולים מפורט עבור שני acylation במבחנה, בתא סלקטיבי 2'-הידרוקסיל נותחו על ידי פריימר ניסויים סיומת (צורה) כדי לקבוע את מבנה שניוני של רצפי ה-pre-mRNA עניין בנוכחות מולקולה קטנה פילוח RNA הם הציג במאמר זה.

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

פרוטוקול זה מתאר יישום של פלואורסצנטיות מולקולה אחת בהכלאה situ (smFISH) כדי למדוד את הקינטיות vivo של סינתזה mRNA והשפלה.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

המבנה המשני של ה-RNA נצפה בעיקר ב-RNA בוגר בשיטות בדיקת מבנה. רצף מעקב מבנה קו-טרנספריפליונלי (CoSTseq) מאחד את ריצת הגרעין, ששימשה לחקר מיקום הפולימראז על RNA מתהווה, עם חקירת מבנה. כך CoSTseq מאפשר תצפית על מבנה ה-RNA המשני ב-RNA תחת שעתוק פעיל.

ניתוח השוואתי של מבנה RNA של תעתיקים צעירים ובוגרים ב-Saccharomyces cerevisiae

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ויזואלית באמצעות דיווחי RNA ברוקולי מפוצלים לזיהוי וכימות של זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה.

הדמיה וכימות של זיווג בסיסי RNA בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה באמצעות דיווחי RNA ברוקולי מפוצל

למד את שיטת DMS-MaP לניתוח מבנה RNA באמצעות דימתיל סולפט וריצוף. הפרוטוקול מציג טכניקות חישוף במבחנה ובתאים חיים לחקר דינמיקה מבנית של RNA ותפקוד ביולוגי.

בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

גלה סרטונים נוספים