הערכה של טיפול אפנון התכווצות הלב בקרדיומיוציטים דו-ממדיים שמקורם בתאי גזע אנושיים

מעבדות משרד המדע וההנדסה ב-FDA מפתחות כלים מדעיים רגולטוריים כדי לסייע למפתחי מכשור רפואי ולסוקרי FDA. המטרה הסופית שלנו היא להאיץ את גישת המטופלים למכשירים רפואיים חדשניים, בטוחים ויעילים באמצעות המדע הטוב ביותר הזמין. בפרוטוקול זה, אנו מיישמים טכנולוגיה חדשנית של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים להערכת מכשירים רפואיים המשמשים לטיפול במצבים לבביים מסכני חיים.

כלי פשוט זה מאפשר הערכה ניתנת לשחזור של מכשירים אלקטרופיזיולוגיים של הלב בצלחת באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. ניתן להשתמש בו גם עם תאים ספציפיים למטופל שמקורם בתורמים עם מחלות לב שונות. כדי להתחיל, צלחת את iPSC אנושי מופשר cardiomyocytes על 0.1% ג 'לטין מצופה שש צלחות סטריליות שש באר לפחות יומיים לפני זריעת cardiomyocytes על מצע הידרוג'ל גמיש.

תרבית את ה- iPSC האנושי הפיק קרדיומיוציטים בתווך קרדיומיוציטים סטנדרטי במשך יומיים עד ארבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר להם להתאושש מהשימור בהקפאה. רענן את המדיום בילה עם 100% cardiomyocyte בינוני כל 48 שעות. בדוק את המצב של קרדיומיוציטים הנגזרים מ- iPSC האנושי לפני הדיסוציאציה על ידי הערכת בריאות התאים, הבטחת כדאיות ופעימות יציבות.

לשטוף את cardiomyocytes עם ארבעה מיליליטר לכל באר של DPBS ללא סידן כלורי או מגנזיום כלורי. מוסיפים מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה בטמפרטורת החדר לכל באר ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום cardiomyocyte כדי סטרילי 15 מיליליטר צינור חרוט.

לנתק את cardiomyocytes מן צלחות שש באר עם פיפטה 1, 000 מיקרוליטר ולהוסיף את השעיית התא צינור חרוט. לשטוף את הבארות עם מיליליטר אחד של מדיום cardiomyocyte טרי כדי לאסוף כל שאריות cardiomyocytes ולהוסיף אותם צינור חרוט. לאחר מכן להביא את הנפח הסופי של צינור חרוטי ל 15 מיליליטר עם המדיום.

צנטריפוגו את הצינור ב-200 גרם למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנאטנט עד למיליליטר אחד. להשעות מחדש את התאים בתווך cardiomyocyte לנפח סופי של חמישה מיליליטר ולספור את cardiomyocytes עם מונה תאים ידני או אוטומטי. לאחר מכן, לדגור על תרחיף התא cardiomyocyte במשך כ 30 דקות בטמפרטורת החדר בעוד מצעי הידרוג'ל גמישים מוכנים.

מכינים פיפטה של 20 מיקרוליטר במיקרוליטר אחד, קצוות פיפטה, פלטה תחתונה סטרילית מזכוכית 48 בארות וטיימר סטופר במכסה המנוע של תרבית הרקמות. ערבבו את המטריצה החוץ תאית או מצע הידרוג'ל מבוסס ECM על ידי הקשה עדינה על הצינור ומיד הנחתו בחזרה על קרח. הפעל את שעון העצר מיד לפני ציפוי מצע ההידרוג'ל הראשון וסמן זאת כזמן אפס.

פיפטה מיקרוליטר אחד של מצע ההידרוג'ל מעלה ומטה בערך שלוש פעמים כדי לקרר את קצה הפיפטה. לאחר מכן להחיל כ מיקרוליטר אחד של מצע הידרוג'ל מדולל אופקית על החלק התחתון של כל באר בצלחת 48 באר, מחזיק פיפטה בזווית 45 מעלות. לוחים את כל מצעי ההידרוג'ל באותו כיוון בכל באר כדי לסייע בזיהוי המצע בעת ביצוע הניסויים בהגדלה של פי 40.

מניחים את המכסה על צלחת 48 בארות ומאפשרים למצעי ההידרוג'ל לדגור במשך שמונה עד 10 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית הרקמה לפני הוספת התאים. לאחר הדגירה, מיד זרע cardiomyocytes dropwise ישירות על מצעי הידרוג'ל עם כ 30, 000 cardiomyocytes קיימא לכל באר בנפח בינוני נמוך של כ 200 מיקרוליטר של מדיום cardiomyocyte. לאחר סגירת המכסה, אפשרו לקרדיומיוציטים לדגור ללא הפרעה במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע כדי לאפשר לתאים להיצמד למצע ההידרוג'ל.

מוסיפים בעדינות 100 מיקרוליטר של מדיום קרדיומיוציטים טריים לכל באר. הניחו את המכסה סגור על אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך יומיים עד ארבעה ימים. הפעל את המיקרוסקופ ואת תא הבקרה הסביבתית כדי לאזן ל -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני.

הסר את מדיום cardiomyocyte מן צלחת 48 באר ולשטוף בעדינות כל טוב פעמיים עם 600 מיקרוליטר של אפנון התכווצות הלב או מדיום בדיקת CCM. לאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטר של מדיום בדיקת CCM לכל באר ולהניח את צלחת 48 באר על המיקרוסקופ בתא הבקרה הסביבתית. הכנס את האלקטרודות ואזן את התאים למשך חמש דקות.

כדי להקליט את סרטוני ההתכווצות באמצעות מיקרוסקופ מבוסס וידאו, פתח את תוכנת הקלטת הווידאו והגדר קצב פריימים של 100 פריימים לשנייה. לאחר מכן בחר אזור עניין או החזר השקעה ליד מרכז השכבה החד-שכבתית hiPSC-CM. לאחר מכן שדה לעורר את התאים עם מחולל דופק מסחרי כדי קצב חשמלי את monolayers cardiomyocytes 2D.

מקם את cardiomyocyte על סף פי 1.5 בהרץ אחד עם פרמטרים הדופק הבסיסי. לדוגמה, קצב גל מרובע מונופאזי פולסים עם משך פעימת גירוי של שתי אלפיות השנייה של חמישה וולט. הקלט את סרטון הקצב הבסיסי בלבד לפני CCM למשך חמש פעימות לפחות.

לאחר מכן לעורר את monolayer cardiomyocytes עם אות חשמלי ניסיוני של עיכוב 30 אלפיות השנייה, שני פולסים biphasic סימטרי של 5.14 אלפיות השנייה משך פאזה, עם משך כולל 20.56 אלפיות השנייה, 10 וולט משרעת פאזה, ומרווח interphase אפס. הקלט את סרטון ההתכווצות הנגרמת על ידי CCM במשך חמש פעימות לפחות. כבה את אות CCM, עורר עם דופק קצב בסיסי והקלט סרטון התכווצות של תקופת ההתאוששות לאחר CCM למשך חמש פעימות לפחות.

השתמש בתוכנת כיווץ סטנדרטית כדי לנתח את סרטוני ההתכווצות באופן אוטומטי ולכמת את תכונות ההתכווצות העיקריות כמו משרעת התכווצות, שיפוע התכווצות, שיפוע הרפיה, זמן לשיא, זמן לקו הבסיס 90% ומשך התכווצות 50% ה- iPSC האנושי הדו-ממדי שמקורו בתכונות חוזיות חד-שכבתיות אופיינו והפרמטרים העיקריים של התכווצות קרדיומיוציטים כומתו. היישום של פרמטרי גירוי CCM סטנדרטיים הביא לתכונות כיווץ משופרות במבחנה. ההשפעות של אפנון ריכוזי סידן חוץ-תאיים על תכונות ההתכווצות האנושית עם וללא גירוי CCM הוערכו.

נצפתה תלות בסיסית צפויה בסידן של התכווצות, כמו גם עלייה הנגרמת על ידי CCM ברגישות לסידן ברמה של חד-שכבה קרדיומיוציטים. בנוסף, החקירה הפרמקולוגית של מסלול איתות בטא אנדרוגני גילתה כי ההשפעות האינוטרופיות המושרות על ידי CCM מתווכות בחלקן על ידי איתות בטא אדרנרגי. יתר על כן, כלי זה ניתן להרחיב cardiomyocytes מחלה ספציפית למטופל, כולל אלה של קרדיומיופתיה מורחבת כדי להבין את ההשפעה של CCM בהקשר של מצבי מחלה.

כאן, אנו מתמקדים בעיקר בהערכת תכונות התכווצות אנושית. עם זאת, באמצעות כלי זה, ניתן גם להעריך קריאות צימוד אחרות של התכווצות עירור הלב, כולל פוטנציאלי פעולה וטיפול בסידן. זהו הכלי המדעי הרגולטורי הראשון המשלב תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי טכנולוגיה עם הערכה של מכשירי לב.

שיטה חלופית זו סוללת את הדרך להערכת מכשירים רפואיים בצלוחית ויש לה פוטנציאל להפחית את הצורך בניסויים בבעלי חיים ובבני אדם.