Name: שיטת תרבית תלת ממדית של ספרואידים של קווי תאים עובריים ודגי זברה בכבד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למדו שיטה מהירה ויעילה ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים מקווי תאים של דגי זברה ZEM2S ו-ZFL. פרוטוקול זה מאפשר מחקר רחב של השפעות כימיקלים על דגים ובהערכת רעילות סביבתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

לזכרו של ד"ר מרסיו לורנצ'יני, מחבר שותף של עבודה זו, חוקר מעולה בתחום הקוסמטיקה ומוקדש לקידום המחקר הקוסמטי בברזיל. המחברים אסירי תודה למעבדה מרובת המשתמשים במחלקה לפיזיולוגיה (UFPR) על זמינות הציוד ועל התמיכה הכספית של התיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES, ברזיל) (קוד האוצר 001) וה- Grupo Boticário.

שלבי המפתח ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של קווי תאים ZFL ו-ZEM2S בלוח עגול בעל תחתית עגולה של 96 בארות מוצגים באיור 1.
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה ובטבלה 1 עבור פתרונות ומדיית תרבות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. תרביות מדיום וחד-שכבתיות של תרביות תאים
<ol><li>לגדל את שני קווי התאים (ZFL, ZEM2S) כחד-שכבות באינקובטור ב-28°C ללאCO2, ולגדל אותם בתת-גידול ביחס של 1:3 כאשר הם מגיעים למפגש ~80%.<ol><li>התחל עם בקבוק T75 של תאי דג זברה במפגש ~80%, בתרבית כמתואר לעיל.</li>
		<li>הסר את המדיום המלא ושטוף את התאים על ידי הוספת 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) (0.01 M) לבקבוק תרבית בעזרת פיפטה.</li>
		<li>בעזרת פיפטה, להוסיף 3 מ"ל של 1x טריפסין-0.5 mM EDTA (0.05% [v/v]) לצלוחיות התרבית, ולדגור ב 28 ° C במשך 3 דקות לניתוק תאים מן הצלוחית.</li>
		<li>טפחו בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן עצרו את עיכול הטריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום תרבית שלם לצלוחית.</li>
		<li>באמצעות פיפטה, להעביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב 100 × גרם במשך 5 דקות.</li>
		<li>לאחר היווצרות הכדור, בזהירות להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של המדיום המלא עבור קו התא המתאים בשימוש (ZFL או ZEM2S), ו resuspend באמצעות micropipette. קח aliquot עבור ספירת תאים.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ספירת תאים עם בדיקת אי הכללת צבע כחול טריפאן
<ol><li>הוסף 10 μL של תרחיף התא ו 10 μL של צבע כחול טריפאן למיקרו-צינורית כדי לספור את התאים ולהעריך את הכדאיות שלהם. מערבבים את תרחיף התא וצובעים בעזרת פיפטה.</li>
	<li>לאחר מכן, העבירו 10 μL של תערובת זו (תרחיף תאים + טריפאן כחול) לתא נויבאואר וספרו את התאים בארבעת הריבועים הגדולים (רבעים: Q) הממוקמים בפינות התא, בהתחשב בתאים שאינם תופסים כחול טריפאן כבני קיימא. חשב את מספר התאים בני קיימא באמצעות משוואה (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>כדי לחשב את מספר התא הסופי בתרחיף התא, הכפל את מספר התא שנקבע באמצעות משוואה (1) ב- 2 (גורם הדילול עקב השימוש בכחול טריפאן). הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכת ספירת תאים אוטומטית.</li>
</ol>3. ציפוי תאים בצלחות ULA
<ol><li>לאחר חישוב מספר התא, התאם את מתלה התא ללוח 200 μL של תרחיף זה לכל באר של לוחית ULA בעלת תחתית עגולה של 96 בארות עם מספר התאים הדרוש לכל קו תא, כמפורט להלן:<ol><li>צלחת 7,000 תאי ZFL קיימא / באר; לכן, עבור צלחת ULA כולה, להשתמש 700,000 תאים ב 20 מ"ל של תווך שלם.</li>
		<li>צלחת 3,500 תאי ZEM2S קיימא / באר; לכן, עבור צלחת ULA כולה, להשתמש 350,000 תאים ב 20 מ"ל של מדיום שלם.</li>
	</ol></li>
	<li>מכינים את תרחיף התא עם ריכוז התאים המותאם במאגר בינוני ומערבבים אותו באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, תוך הקפדה שלא ליצור קצף או בועות. באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, להוסיף 200 μL של תרחיף התא מותאם לכל באר של צלחת ULA. הערה: הצלחת חייבת להיות אטומה עם ציפוי פרפילם או נייר איטום דבק כדי למנוע אידוי בינוני של תרבית מהצלחת בעלת 96 הקידוחים.</li>
</ol>4. היווצרות ספרואידים
<ol><li>לדגור את צלחת ULA על שייקר מסלול ב 70 סל"ד במשך 5 ימים באינקובטור 28 מעלות צלזיוס. אפשרו לכדוריות להיווצר במשך 5 ימים של רעידות מסלוליות (איור 2), ולהגיע לגודל ממוצע של ~225 מיקרומטר בקוטר (ספרואידים ZFL) וקוטר ~226 מיקרומטר (ספרואידים ZEM2S)12. הערה: לאחר 5 ימי דגירה (מעגליות מרבית), הספרואידים מוכנים לשימוש.</li>
	<li>כדי לשמור על הספרואידים בתרבית במשך יותר מ -5 ימים, להסיר 100 μL של המדיום בילה כל 5 ימים, ולהוסיף 100 μL של מדיום תרבית שלמה טרי באמצעות micropipette רב ערוצי. הערה: יש להיזהר שלא לשאוף את הספרואידים במהלך תהליך זה.</li>
</ol>5. מדידת גודל (קוטר) וצורה (אינדקס מעגליות) של ספרואידים
<ol><li>רכוש את התמונות.<ol><li>תחת מיקרוסקופ אור הפוך עם מערכת לכידת הדמיה, קבל תמונה בקנה מידה מוגדר. הערה: השתמש בשקופית כיול שלב במיקרוסקופ או בשקופית נויבאואר (שבה ידועים גדלי הרביע) כדי לקבל את קנה המידה.</li>
		<li>תחת המיקרוסקופ ובאמצעות אותה עדשה אובייקטיבית המשמשת לקבלת תמונת הסולם, קבל תמונות של הספרואידים שנוצרו במלואם (כלומר, ספרואידים בני 5 ימים). הערה: יש לצלם את כל התמונות באמצעות אותה מערכת לכידת הדמיה, מכיוון שרזולוציית התמונה חשובה לקביעת הגודל והצורה של הספרואידים, והיא עשויה להשתנות בין סוגי המערכות.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדר את קנה המידה.<ol><li>באמצעות תוכנת ImageJ, פתח את התמונה של קנה המידה המוגדר (לחץ על קובץ | פתוח).</li>
		<li>בחרו בבורר הקו הישר מסרגל הכלים וגררו קו החוצה באמצעות העכבר לאורך ההרחבה של קנה המידה שהוגדר בתמונה.</li>
		<li>הגדר את קנה המידה על-ידי בחירה באפשרות נתח | הגדר קנה מידה והמתן לפתיחת החלון הגדר קנה מידה .</li>
		<li>בחלון הגדרת קנה מידה , מלא את הריק של המרחק הידוע במרחק הידוע (μm) המתאים לקו הישר; מלא את יחידת האורך ב - um עבור μm. לחץ על אישור. הערה: קנה המידה בפיקסלים/מיקרומטר מוצג בתחתית החלון.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדר את פרמטרי המדידה.<ol><li>בתוכנת ImageJ, בחר נתח | הגדר מידות כדי לפתוח את החלון הגדרת מדידות .</li>
		<li>בחלון Set Measurements, בחרו בתיבות למדידות הרצויות (כלומר, מתארי שטח וצורה). לחץ על אישור.</li>
	</ol></li>
	<li>קבל את הקוטר והמעגליות של הספרואידים.<ol><li>פתח את התמונה של ספרואיד (קובץ | פתוח).</li>
		<li>בחרו בכלי הבחירה החופשית בסרגל הכלים ובעזרת העכבר בחרו את הצד החיצוני של הספרואיד, כפי שמודגם באיור 3A. הערה: כדי להגדיל או להקטין את התצוגה של התמונה, הקש על מקש Ctrl והשתמש בעכבר כדי לגלול למטה או למעלה, או הקש על מקש Ctrl והשתמש במקשי החצים למעלה או למטה בלוח המקשים.</li>
		<li>בחר נתח | מדידה כדי לפתוח את החלון 'תוצאות ', שבו מוצגים הערכים הנמדדים.</li>
		<li>באמצעות ערך השטח , חשב את הגודל (קוטר) של הספרואידים באמצעות משוואה (2): <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
		<li>מדד המעגליות ניתן בחלון התוצאות כ- "Circ.", ומחושב אוטומטית על ידי התוכנה באמצעות משוואה (3): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) הערה: אינדקס המעגליות של 1.0 מייצג צורה כדורית מושלמת, בעוד שערך קרוב ל- 0.0 מציין צורה מוארכת13.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research.+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+representative+in+vitro+method+for+fish+ecotoxicology%3A+morphological+and+biochemical+characterisation+of+three-dimensional+spheroidal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes.</a> Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).</li>
<li>Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+hepatocyte+spheroids+-+A+powerful+%28though+underexplored%29+alternative+in+vitro+model+to+study+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470(2022).</li>
<li>Baron, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutical+metabolism+in+fish%3A+using+a+3-D+hepatic+in+vitro+model+to+assess+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance.</a> PloS One. 12 (1), 0168837(2017).</li>
<li>Langan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+size+does+not+impact+metabolism+of+the+%CE%B2-blocker+propranolol+in+3D+intestinal+fish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 947(2018).</li>
<li>Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+three-dimensional+%283D%29+spheroid+cultures+of+the+continuous+rainbow+trout+liver+cell+line+RTL-W1%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).</li>
<li>Jeong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+CBZ-induced+catalysis+and+cytochrome+gene+expression+in+three+dimensional+zebrafish+liver+cellculture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+and+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture.</a> Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161(2016).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720(2011).</li>
<li>Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hollow+sphere+soft+lithography+approach+for+long-term+hanging+drop+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>de Souza, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+cultures+of+zebrafish+liver+and+embryo+cell+lines%3A+a+comparison+of+different+spheroid+formation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods.</a> Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ%2FFiji%22%5BJournal%5D)">ImageJ user guide.</a> ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).</li>
<li>Guidony, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+proteins+activity+and+cytotoxicity+in+zebrafish+hepatocytes+exposed+to+triclosan%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan.</a> Environmental Pollution. 271, 116368(2021).</li>
<li>da Silva, N. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+goethite+in+the+effects+of+glyphosate+and+Roundup%C2%AE+on+ZFL+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line.</a> Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+is+a+key+factor+influencing+the+invasion+and+proliferation+of+Toxoplasma+gondii+in+fish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells.</a> Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).</li>
<li>Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+induced+by+glyphosate+and+glyphosate-based+herbicides+in+the+zebrafish+hepatocyte+cell+line+%28ZF-L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L).</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).</li>
<li>Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+water+soluble+fraction+of+gasoline+on+ZFL+cell+line%3A+Cytotoxicity%2C+genotoxicity+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress.</a> Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).</li>
<li>Morozesk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+multiwalled+carbon+nanotubes+co-exposure+with+cadmium+on+zebrafish+cell+line%3A+Metal+uptake+and+accumulation%2C+oxidative+stress%2C+genotoxicity+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).</li>
<li>Dognani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofibrous+membranes+for+low-concentration+Cr+VI+adsorption%3A+kinetic%2C+thermodynamic+and+the+influence+on+ZFL+cells+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability.</a> Materials Research. , 24(2021).</li>
<li>ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/crl-2147">https://www.atcc.org/products/crl-2147</a> (2022).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Gajski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+potential+of+selected+cytostatic+drugs+in+human+and+zebrafish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research+International%22%5BJournal%5D)">Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells.</a> Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).</li>
<li>Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+octocrylene+on+zebrafish+larvae+and+liver+cell+line+%28ZFL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL).</a> Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+determination+of+oxygen+consumption+rates+and+diffusion+coefficients+in+multicellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids.</a> Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).</li>
<li>Ho, R. K., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+of+cell+fate+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo.</a> Science. 261 (5117), 109-111 (1993).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-19+and+N-cadherin+interact+to+control+cell+movements+during+anterior+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).</li>
<li>Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptome+characterization+of+model+zebrafish+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines.</a> Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

זוהי שיטה פשוטה, קלה ומהירה ליצירת ספרואידים של קווי תאי כבד ועובר של דגי זברה. שיטה זו פותחה על ידי קבוצה זו בהתבסס על שינויים של שיטות ספרואידים תלת ממדיות קיימות כדי להתגבר על בעיות שדווחו במחקרים מדעיים הקשורים להיווצרות ספרואידים, כמו גם אי ודאויות בדיוק הנתונים מבדיקות ספרואידים תלת ממדיות. לדוגמה, הבעיות המדווחות נעוצות בקשיי טיפול, באופי הגוזל זמן של יצירת ספרואידים, בצורך לבחור ספרואידים בגודל ובצורה דומים לביצוע בדיקה, כמו גם קשיים בתהליך העברת הספרואידים מהטיפות למיקרו-צלחות בשיטת הטיפה התלויה<sup class="xref"...

ספרואידים הם כדורים קטנים של תאים הנוצרים כאשר תאים מתורבתים במגע קרוב בין תאים בתרבית תלת-ממדית. היכולת של ספרואידים לחקות את סביבת הרקמה in vivo כבר נחקרה במגוון קווי תאים ותאים ראשוניים 1,2. עם זאת, למרות שספרואידים מפותחים היטב עבור מחקרי רעילות יונקים, הפיתוח של ספרואידים למחקרי רעילות עם בעלי חוליות שאינם יונקים (למשל, דגים) עדיין בעיצומו3. עבור קווי תאי דגים, ספרואידים פותחו במגוון שיטות שונות, כגון טלטול אורביטלי (OS) באמצעות סוגים שונים של לוחות באר 3,4,5,6,7, ושיטת הריחוף המגנטי באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים 8. עם זאת, חלק משיטות התרבית הללו עבור ספרואידים עשויים להיות בעלי חסרונות רבים יותר מאחרים.
לדוגמה, שיטות גירטוריות במיקרו-צלחות גדולות (צלחות של 24 בארות) עשויות ליצור מספר גבוה של ספרואידים השונים זה מזה בגודל ובצורה; ואכן, הודגמה היווצרות מבנה רב-ספרואידי7. זה דורש מאמצים אינטנסיביים לבחור ספרואידים עם גודל וצורה דומים לניסוי. שיטת תרבית תלת ממדית של טיפה תלויה משמשת בדרך כלל ליצירת ספרואידים של קווי תאים של יונקים 1,2,9,10,11, לפיה ניתן ליצור ספרואידים בודדים בכל טיפה, תוך הימנעות מהבעיות שתוארו לעיל. עם זאת, למרות ששיטת נפילה תלויה שונה (טיפה תלויה + טלטול מסלולי) מסוגלת לייצר ספרואידים ZFL בשיטה זולה, יש לה חסרונות12. הצברים התאיים שנוצרו אינם יכולים להישמר לפרקי זמן ארוכים בטיפות; לכן, הם צריכים להיות מועברים צלחות היטב. תהליך זה דורש טיפול אינטנסיבי ופרקי זמן ארוכים של עבודה במכסה מנוע זרימה למינרית, שכן הוא מבוצע באמצעות מיקרופיפטה12. בנוסף, שיטה זו דורשת 10 ימים כדי ליצור באופן מלא את הספרואידים ZFL (5 ימים טיפה תלויה + 5 ימים במערכת ההפעלה)12. חסרונות אלה יכולים להגביל את היישום של כדורי דגים תלת-ממדיים לבדיקת רעילות, במיוחד בהתחשב ביישומים פוטנציאליים לתעדוף כימי וקיימות המוצר.
לפיכך, מאמר זה מתאר פרוטוקול תרבית תלת-ממדי המסוגל ליצור ספרואידים בודדים של קווי תאים ZFL (D. rerio normal hepatocyte) ו-ZEM2S (D. rerio blastula phase fetryo) בהתבסס על שימוש משולב של לוחות חיבור 96 באר ואולטרה-נמוכים (לוחות ULA) ושייקר אורביטלי (קוטר סיבוב של 22 מ"מ). השיטה המיושמת היא פשוטה וניתנת לשחזור, ויכולה ליצור מספר גבוה של ספרואידים בגודל וצורה דומים בתקופה קצרה (5 ימים). היתרונות של שיטה זו יכולים לתמוך ביישום מודלים תלת ממדיים של דגים למחקרי רעילות ימית הן בתעשייה והן באקדמיה, כמו גם בהתקדמות יישום שיטות חלופיות לבדיקת רעילות אקולוגית.

<table><tbody><tr><td>96 בארות שקוף תחתון עגול נמוך במיוחד Microplate, עטוף בנפרד, עם מכסה,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>7007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, אבקה, גלוקוז גבוה, פירובט</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>תערובת חומרים מזינים F-12 של Ham, אבקת</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>עיבוד וניתוח תמונה ב-Java ( ImageJ) תוכנת 1.52p</td><td>&nbsp; National Institutes of Health, ארה"ב</td><td></td><td>זמין ב:</td></tr><tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html L-15 Medium, אבקת</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 מ"מ קוטר סיבוב</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10x) עם סידן ומגנזיום</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td></td></tr><tr><td>FBS - סרום בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט, אבקה,&nbsp; ביו-ריאגנט לביולוגיה מולקולרית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים ZEM2S</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>קו תאים זה נתרם באדיבות על ידי פרופסור ד"ר מייקל J. Carvan (אוניברסיטת ויסקונסין, מילווקי, ארה"ב)</td></tr><tr><td>קו תאים ZFL</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת תרבית תלת ממדית של ספרואידים של קווי תאים עובריים ודגי זברה בכבד

A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines

קווי תאי דגים מבטיחים מודלים במבחנה להערכת רעילות אקולוגית; עם זאת, למערכות תרבית חד-שכבתיות קונבנציונליות (תרבית דו-ממדית) יש מגבלות ידועות (למשל, אריכות ימים בתרבית ותחזוקה של חלק מהתפקודים התאיים in vivo ). לפיכך, הוצעו תרביות תלת-ממדיות, כגון ספרואידים, שכן מודלים אלה יכולים לשחזר מבנים דמויי רקמות, וללכוד טוב יותר את תנאי in vivo . מאמר זה מתאר פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים עם שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים). הפרוטוקול מורכב מציפוי התאים בצלחת בעלת תחתית עגולה, נמוכה במיוחד, בעלת 96 בארות. לאחר 5 ימים תחת רעידות מסלוליות (70 סל"ד), נוצר ספרואיד יחיד לכל באר. הספרואידים שנוצרו מציגים גודל וצורה יציבים, ושיטה זו מונעת היווצרות של ספרואידים מרובים בבאר; לכן, אין צורך לבחור ידנית ספרואידים בגדלים דומים. הקלות, המהירות ויכולת השחזור של שיטה ספרואידית זו הופכים אותה לשימושית עבור בדיקות מבחנה בעלות תפוקה גבוהה.

ספרואידים בודדים לכל באר עם גודל וצורה יציבים נוצרים בשיטה זו. איור 2 מדגים את תהליך ההיווצרות של ספרואידים בודדים של תאי ZFL ו-ZEM2S בבאר של צלחת ULA תחת טלטול אורביטלי (70 סל"ד). לקווי התאים ZFL ו-ZEM2S יש התנהגויות שונות בתרבית תלת-ממדית. קו התאים ZEM2S מציג תכונות שמעניקות את היכולת ליצור בקלות צורה ספרואידית מאז היום הראשון של הרעידה המסלולית (איור 2E), בעוד שקו תאי ZFL דורש 5 ימים כדי להגיע לצורה הכדורית הרצויה (איור 2...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים של שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים).

Fish cell lines are promising in vitro models for ecotoxicity assessment; however, conventional monolayer culture systems (2D culture) have well-known ...

פרוטוקול זה יכול ליצור בקלות ספרואידים של דגי זברה, מודל תלת-ממדי במבחנה עם פוטנציאל יישום שונה בבדיקת רעילות דגים. זוהי שיטה פשוטה ומהירה ליצירת ספרואידים בודדים של קווי תאים של דגי זברה דומים מאוד בגודל ובצורה. אם בצע את כל השלבים המתוארים כראוי, אחד לא צריך להיתקל בבעיות.ספרואידים של דגי זברה עשויים להועיל מאוד למנגנון, חקר ההשפעות של כימיקלים על דגים, מה שעוזר לשפר את הערכת הבטיחות הסביבתית של מוצרים כגון קוסמטיקה. מי שתדגים את ההליך תהיה איריסדוריס רודריגז דה סוזה, רופאה לגנטיקה מהמעבדה שלי. בתור התחלה, קחו בקבוק T75 של תאי דגי זברה במפגש של כ-80%.הסר את המדיום השלם, ושטוף את התאים על ידי הוספת PBS טוחנת 0.01 לבקבוק התרבית עם פיפט. שטפו את בקבוק התרבית עם PBS על ידי ניעור עדין של הבקבוק ולאחר מכן הסירו את PBS. מוסיפים שלושה מיליליטר טריפסין 0.5 מילימולר EDTA לבקבוק התרבית, ודגרים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.לניתוק התאים מהצלוחית, טפחו בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים. ואז לעצור את העיכול טריפסין על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מדיום תרבית מלאה לצלוחית. באמצעות פיפט, להעביר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מיליליטר צנטריפוגה צנטריפוגה ב 100 G במשך חמש דקות.לאחר מכן הסר בזהירות את supernatant. הוסף מיליליטר אחד של המדיום המלא עבור קו התאים המתאים בשימוש והשהה מחדש את הגלולה באמצעות מיקרופיפט. הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף התא ו -10 מיקרוליטר של צבע כחול טריפאן לצינור מיקרו כדי לספור את התאים ולהעריך את הכדאיות שלהם.מערבבים את תרחיף התא וצובעים באמצעות פיפט, ומעבירים 10 מיקרוליטר מתערובת זו לתא נויבאואר. ספרו את התאים בארבעת הריבועים או הרבעים הגדולים הממוקמים בפינות החדר, תוך התחשבות בתאים שאינם תופסים כחול טריפאן כברי קיימא. לאחר מכן חשב את מספר התאים בני קיימא באמצעות המשוואה המוצגת על המסך.הכפל מספר תא זה בשניים כדי לחשב את מספר התא הסופי בהשעיית התא. לאחר חישוב מספר התא, התאם את תרחיף התא לצלחת 200 מיקרוליטר של תרחיף זה לכל באר של לוח ULA תחתון עגול של 96 בארות עם מספר התאים הדרוש לכל קו תא. מכינים את התרחיף עם ריכוז התאים המותאם במאגר בינוני ומערבבים אותו באמצעות מיקרופיפט רב ערוצי מבלי ליצור קצף או בועות.הוסף 200 מיקרוליטר של תרחיף התא המותאם לכל באר של צלחת ULA התחתונה העגולה. באמצעות פיפטה רב ערוצית. הצלחת חייבת להיות אטומה עם Parafilm או נייר איטום דבק כדי למנוע אידוי בינוני תרבית מן הצלחת 96 בארות.לדגור על הצלחת על שייקר מסלול במהירות 70 סל"ד למשך חמישה ימים באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני. לאחר חמישה ימים, התבונן בכדורידים תחת מיקרוסקופ אור הפוך כדי להעריך את הספרואידים שנוצרו. כדי למדוד את צורתם וגודלם, קבל תמונות של הספרואידים, והשתמש בתוכנה כדי לעבד ולנתח את התמונות.לאחר הגדרת התוכנה למדידת אזור נבחר בהתבסס על קנה מידה ידוע, בחר את הצד החיצוני של הספרואיד כדי לקבוע את שטחו ואת מעגליותו. שטח הספרואיד משמש לקביעת גודלו על ידי חישוב הקוטר, d, והתוכנה מספקת את המעגליות של הספרואיד על ידי נוסחה המשתמשת בשטח ובהיקף שנבחרו. צבר תאי ZFL נוצר ביום הראשון של רעידות מסלוליות.צבר התא מגביר את המעגליות שלו ביום השלישי, ומגיע לצורה כדורית נאותה ביום החמישי. ספרואיד ZFL בן 16 יום בצלחת ULA מוצג כאן. קו התאים ZEM2S יוצר ספרואידים מהיום הראשון של רעידות מסלוליות.הספרואיד שומר על צורתו וגדל בגודלו ביום השלישי, והמעגליות המקסימלית שלו מגיעה ביום החמישי. ספרואיד ZEM2S בן 10 ימים בצלחת ULA מוצג כאן. הגודל הנמדד של ספרואידים של קווי התאים ZFL ו- ZEM2S ומדד המעגליות הנמדד של ספרואידים ZFL ו- ZEM2S מוצגים באיור זה.תמונה גרפית זו מייצגת את דפוס הצמיחה של כדורי ZFL ו- ZEM2S. ספרואיד ZFL וספרואיד ZEM2S שנוצרו לאחר חמישה ימים של רעידות מסלוליות ב-100 סל"ד מוצגים כאן. דפוס הצמיחה ומדד המעגליות של הספרואידים שנוצרו במהירויות סיבוב של 70 ו -100 סל"ד מוצגים באיור זה.70 סל"ד היא המהירות המתאימה ביותר ליצירת ספרואידים ZFL ו- ZEM2S בשיטה זו. צביעה של קרומי תאים על ידי Lectin Alexa Fluor 594 וגרעינים על ידי DAPI מדגימה את שלמות התא בליבת הספרואידים. פלואורסצנטיות של resorufin שנוצר על ידי הפחתה של AlamarBlue מדגים תאים קיימא בליבה של שני הספרואידים.בדיקת כדאיות MTT בתרבית תלת-ממדית ובתרבית דו-ממדית של קו התאים ZEM2S ו-ZFL מוצגת כאן, ללא הבדלים משמעותיים. בעת ניסיון הליך זה, הקפד לאטום את הלוחות כדי למנוע שינוי ה- pH של אמצעי התרבות ואידוי בבארות. הספרואידים יכולים להיות מיושמים במגוון בדיקות חוץ גופיות כדי להעריך השפעות רעילות בכבד דגים או מחקרים התפתחותיים באמצעות קו תאי ZEM2S עובר.פרוטוקול זה יכול לעזור לדחוף קדימה את הפיתוח של ניסויי דגים במבחנה, ולתרום להתקדמות של מחקרי רעילות אקולוגית ללא בעלי חיים.

a-3d-culture-method-spheroids-embryonic-liver-zebrafish-cell

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

ספרואידים הם סוג של מודל תרבית תאים תלת-ממדי המשמש לייצוג מדויק יותר של סביבת התא בהשוואה למודלים חד-שכבתיים של תרבית תאים דו-ממדית. בפרוטוקול לדוגמה, נראה מדענים מייצרים ספרואידים מקו תאים של סרטן המעי הגס ומיישמים הדמיה של תאים חיים כדי לעקוב אחר גדילת הספרואידים.

יצירת ספרואידים מקווי תאים: שיטת תרבית תאים תלת ממדית (3D)

Somitogenesis הוא תהליך התפתחותי קצבי שמרחבית דפוסי ציר הגוף של עוברי החולייתנים. בעבר, פיתחנו קווי דג הזברה מהונדסים המשתמשים בכתבי ניאון להתבונן גנים מחזוריים המניע את התהליך הזה. כאן, אנו תרבות מפוזרת תאים משורות אלה ותמונת התנודות שלהם לאורך זמן במבחנה.

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

כאן אנו מספקים שיטה לשחזור לבחון neurogenesis למבוגרים באמצעות assay neurosphere נגזר מתוך הכלל המוח או מאחד את telencephalic, tectal או אזורים של המוח הקטן של המוח דג הזברה מבוגר. בנוסף, אנו מתארים את ההליך כדי לתפעל ביטוי גני neurospheres דג הזברה.

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

אנו מציגים פרוטוקול יעיל, קל לשימוש עבור הכנת תרביות תאים הראשי של דג זברה העוברים על תרביות תאים, תא חי הדמיה, כמו גם פרוטוקול להכין ראשי תאים מהמוח דג זברה למבוגרים.

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לתרבות רקמות תלת-ממדית של ציר הגוף האחורי של דג הזברה, המאפשר מחקר חי של פילוח בעלי חוליות. מודל הסבר זה מספק שליטה על התארכות הציר, שינוי מקורות מורפוגן והדמיה חיה ברמת הרקמה בתת-תאיות.

תרבות הסבר זנב תלת-ממדית לחקר פילוח בעלי חוליות בזברהפיש

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

אנו מציגים פרוטוקול לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ואפיונם הפנוטיפי באמצעות לכידת תמונה ופרוטאומיקה.

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

אורגנואידים מחוללים מהפכה במידול רקמות מותאם אישית לפיתוח איברים, גילוי תרופות וחקר מחלות. הנדסת אורגנואידים מתקדמת ליצירת רקמות סינתטיות מורכבות. המטרה היא לשלב מורפוגנזה, טכנולוגיית אסמבלואידים וביומטריצות כדי לקדם את הנדסת הרקמות. פרוטוקול זה מסייע במידול אורגנוגנזה בכבד ובקביעת הנחיות לבניית רקמות סינתטיות.

טכניקות גידול במבחנה למידול אורגנוגנזה של כבד, בניית מכלולים ותכנון רקמות סינתטיות באמצעות קווי תאים אנושיים

למדו שיטה מהירה ויעילה ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים מקווי תאים של דגי זברה ZEM2S ו-ZFL. פרוטוקול זה מאפשר מחקר רחב של השפעות כימיקלים על דגים ובהערכת רעילות סביבתית.

שיטת תרבית תלת ממדית של ספרואידים של קווי תאים עובריים ודגי זברה בכבד

גלה סרטונים נוספים