בדיקות ציטוטוקסיות עם קווי תאים של דגי זברה

פרוטוקול בדיקת ציטוטוקסיות המשתמש בשורות תאים של דגי זברה יכול לענות על שאלות בנוגע לרעילות חריפה של כימיקלים על דגים או לעזור להגדיר את ריכוזי הבדיקה המתאימים לבדיקות דגים חלופיות אחרות. היתרון העיקרי של בדיקת צלחת זו של 96 בארות הוא שילוב של נקודות קצה שונות של כדאיות כדי לקבוע ציטוטוקסיות עבור תאי דגי זברה, שהוא מין דגים חשוב במחקרי רעילות אקולוגית. הפרוטוקול פשוט מאוד.

אם אתה מבצע את כל השלבים המתוארים כראוי, אחד לא צריך להיתקל בכל בעיה. פרוטוקול זה אינו מסייע להשיג מחקרי רעילות אקולוגית המבוססים על בעלי חיים המעריכים השפעות בשורות תאי דגים הנגזרות מאיברים שונים או משלבי חיים שונים, כגון הפטוציטים בתאים עובריים. כדי להתחיל לצפות את תאי ZEM2S או ZFL, חשב את נפח מתלי התאים המתאימים הדרושים להשגת מספר התאים הרצוי לבדיקות.

מלא מאגר מגיב סטרילי עם מדיום התרבית המלא עבור קו התא המתאים ולהעביר את נפח מחושב של השעיית התא למאגר עבור נפח כולל של 20 מיליליטר. בעזרת פיפטה רב ערוצית, מערבבים בעדינות את התמיסה למעלה ולמטה מבלי ליצור קצף או בועות. לאחר מכן באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, להוסיף 200 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת פוליסטירן שקופה 96-באר כדי לקבל ספירת תאים קיימא של 60, 000 תאים לכל באר עבור תאי ZEM2S ו 40, 000 תאים לכל באר עבור תאי ZFL.

לדגור על הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. כדי לחשוף את כל סוגי התאים לריכוזים שונים של כימיקלים לבדיקה, הכינו את הריכוז הרצוי של תמיסות כימיות בדיקה באמצעי התרבית לקו התא המעניין ללא נסיוב בקר עוברי או FBS. לאחר הדגירה של 24 שעות, בזהירות להשליך את המדיה בילה מן הבארות באמצעות micropipette רב ערוצי.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסה כימית בדיקה מסוימת לכל באר בטריפליקטים טכניים, כלומר שלוש בארות לכל ריכוז כימי בדיקה. הניחו את קבוצות הבקרה על אותה צלחת כמו כימיקלים הבדיקה בטריפליקטים טכניים. עבור הבקרה הריקה, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיית החשיפה בשלוש בארות נטולות תאים.

עבור הבקרה השלילית, להוסיף 100 מיקרוליטר של אמצעי החשיפה לשלוש בארות המכילות תאים. לבקרה חיובית, חשוף שלוש בארות המכילות תאים לתמיסת טריטון X-100 1% שהוכנה במדיית החשיפה. אטמו את הפלטות עם רדיד אלומיניום פרפילם או דבק למניעת אידוי בינוני של התרבית ודגרו על הצלחות בטמפרטורה של 28 מעלות למשך 24 שעות.

לאחר 24 שעות מהחשיפה הכימית לבדיקה, יש להשליך בזהירות את מדיית החשיפה מהבארות על ידי יציקת התוכן למגש איסוף ולשטוף כל באר עם 200 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן כדי להסיר את PBS מבלי לאבד תאים, בזהירות לשפוך אותו לתוך מגש איסוף. כדי לבצע את בדיקות Alamar Blue או AB ו- CFDA-AM, הוסף 100 מיקרוליטר של התמיסה המתאימה לכל באר ודגר על הצלחת במשך 30 דקות בחושך ב 28 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, מדדו את הפלואורסצנטיות בקורא לוחות פלואורסצנטיים באורכי גל העירור והפליטה המתאימים המוזכרים בטקסט. כדי לבצע את הבדיקה האדומה או NR הניטרלית, קח את פתרון העבודה NR בעל ריכוז של 40 מיקרוגרם למיליליטר וצנטריפוגה ב 600 גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר בזהירות את פתרונות AB ו- CFDA-AM שנוספו בעבר מהבארות על ידי יציקת התוכן למגש איסוף.

באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון העבודה NR לכל באר לדגור את הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר סיום הדגירה, יוצקים בזהירות את תמיסת NR מהצלחת למגש איסוף, ושוטפים את הבארות על ידי הוספת 150 מיקרוליטר PBS לכל באר. לאחר השטיפה, הוסיפו 150 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי NR לכל באר ודגרו על הצלחת על ידי ניעור עדין על שייקר צלחות למשך 10 דקות לפני מדידת הספיגה ב-540 ננומטר באמצעות קורא צלחות.

כדי לבצע את בדיקת MTT, לאחר החשיפה הכימית של 24 שעות, הסר בזהירות את מדיית החשיפה על ידי יציקת התוכן למגש איסוף ושימוש במיקרופיפטה רב ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של פתרון עבודה MTT לכל באר בחושך. דוגרים על הצלחת בחום של 28 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות בחושך. לאחר מכן השליכו את תמיסת MTT על ידי יציקת התוכן למגש איסוף והוסיפו 100 מיקרוליטר DMSO לכל באר כדי לחלץ את גבישי הפורמזן.

יש לדגור על הצלחת על שייקר במשך 10 דקות לפני מדידת הספיגה ב-517 ננומטר באמצעות קורא צלחות. עבור בדיקת AP, הבארות המתאימות לבקרה ריקה, חיובית וריכוזים ציטוטוקסיים מאוד של כימיקלים לבדיקה הראו צבע כחול ופלואורסצנטיות נמוכה המצביעים על היעדר או הפחתה של תאים בני קיימא. לעומת זאת, הבארות המתאימות לריכוזים ציטוטוקסיים נמוכים של בקרה כימית ושלילית המכילה מספר גבוה של תאים ברי קיימא המירו את הרזזורין לרסורופין ורוד בעל פלואורסצנטיות גבוהה יותר.

עבור בדיקת NR, ריכוזים ציטוטוקסיים מאוד של כימיקלים לבדיקה ובקרה חיובית הם שקופים או ורודים בהירים עם ספיגה נמוכה, בעוד בארות המכילות תאים קיימא השומרים על צבע NR הציגו צבע ורוד כהה וספיגה גבוהה. באופן דומה, עבור בדיקת MTT, בארות ללא תאים ברי קיימא הן שקופות, בעוד אלה המכילות תאים קיימא הופכות MTT לפורמזן בצבע סגול. בהתבסס על אחוזי הכדאיות של התא המחושבים, ריכוז המעכב החצי המקסימלי או ערך IC50 הוערך עבור כימיקלים שונים בקווי תאים ZFL ו- ZEM2S.

לא נצפה הבדל משמעותי בכדאיות התא עבור תרביות עם ובלי FBS, דבר המצביע על התאמתם של אמצעי תרבית שנשללו מ-FBS למשך תקופת חשיפה כימית של 24 שעות. בדיקות MTT ו-NR לא הראו השפעה משמעותית של ריכוזי DMSO משתנים מ-0.1% ל-1% על כדאיות התא, מה שמצביע על כך שקווי תאים אלה תומכים בשימוש ב-DMSO כממס עד 1%שימו לב במיוחד בעת הטיפול בתאים מצופים כדי למנוע ניתוק עצמי במהלך כל ההליך והכינו בזהירות את תמיסת העבודה האדומה הניטרלית כדי למנוע משקעים בצבע. הליך זה יכול להיות מיושם במחקרים העוסקים במספר היבטים של השפעות כימיות על דגים באמצעות מודלים במבחנה, ולתרום להתקדמות של מחקרים על רעילות אקולוגית ללא בעלי חיים.