Name: בדיקות ציטוטוקסיות עם קווי תאים של דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: חקור הערכת ציטוטוקסיות בקווי תאים של דגי זברה (ZEM2S ו-ZFL) באמצעות מגוון מבחני חיות. שיטה זו תומכת במחקר אקוטוקסיקולוגי ללא שימוש בבעלי חיים ומספקת פרוטוקול פשוט ואמין לבדיקת רעילות כימיקלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

לזכרו של ד"ר מרסיו לורנצ'יני, מחבר שותף של עבודה זו, חוקר מעולה בתחום הקוסמטיקה ומוקדש לקידום המחקר הקוסמטי בברזיל. המחברים אסירי תודה למעבדה מרובת המשתמשים במחלקה לפיזיולוגיה (UFPR) על זמינות הציוד ועל התמיכה הכספית של התיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES, ברזיל) (קוד כספים 001) ו- Grupo Boticario.

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת החומרים המשמשים בפרוטוקול זה ובטבלה 1 עבור הרכב הפתרונות והמדיה המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת תאי ZFL ו- ZEM2S
<ol><li>התחל עם בקבוק T75 של תאי ZFL או ZEM2S עם מפגש של 80%, בתרבית בתווך המלא המתאים ב 28 ° C ללא CO2.</li>
	<li>הסר את מדיום התרבית מן הבקבוק ולשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS) (0.01 M). הוסף 3 מ"ל של 1x טריפסין (0.05% v/v; 0.5 mM טריפסין-EDTA) לצלוחיות התרבית. יש לדגור בטמפרטורה של 28°C למשך 3 דקות.</li>
	<li>טפחו בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן עצרו את עיכול הטריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום תרבית שלם לצלוחית.</li>
	<li>מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 100 × גרם למשך 5 דקות.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של מדיום מלא עבור תאי ZFL או ZEM2S, ולהשעות מחדש את הגלולה באמצעות micropipette.</li>
</ol>2. ספירת תאים על ידי הרחקת צבע כחול טריפאן
<ol><li>הוסף 10 μL של תרחיף התא ו 10 μL של צבע כחול טריפאן למיקרו-צינורית כדי לספור את התאים ולהעריך את הכדאיות שלהם. מערבבים את תרחיף התא וצובעים בעזרת פיפטה.</li>
	<li>לאחר מכן, העבירו 10 μL של תערובת זו (תרחיף תאים + טריפאן כחול) לתא נויבאואר וספרו את התאים בארבעת הריבועים הגדולים (רבעים Q) הממוקמים בפינות התא, בהתחשב בכך שתאים בני קיימא הם אלה שאינם תופסים טריפאן כחול. קבע את מספר התאים בני קיימא באמצעות משוואה (1): <img alt="נוסחת ספירת תאים: מספר תא = (ΣQ/4) × 10^4; משוואה מתמטית לכמות." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> (1)</li>
	<li>חשב את מספר התא הסופי בתרחיף התא על-ידי הכפלת מספר התא שנקבע באמצעות משוואה (1) בשניים (גורם הדילול עקב השימוש בכחול טריפאן). הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכת ספירת תאים אוטומטית (למשל, ציטומר עם פונקציית ספירת תאים ויכולת כדאיות).</li>
</ol>3. ציפוי תאים בצלחות 96 בארות
<ol><li>חשב את נפח תרחיף התא הדרוש כדי לקבל את מספר התאים הדרושים לביצוע בדיקות ציטוטוקסיות. מספר התאים בני קיימא עבור כל קו תא מצוין להלן:<ol><li>צלחת 60,000 תאי ZEM2S קיימא לכל באר; לכן, עבור הצלחת כולה, להשתמש שישה מיליון תאים ב 20 מ"ל של תווך שלם (200 μL / באר, צלחת 96 באר).</li>
		<li>צלחת 40,000 תאי ZFL קיימא לכל באר; לכן, עבור הצלחת כולה, להשתמש ארבעה מיליון תאים ב 20 מ"ל של תווך שלם (200 μL / טוב, צלחת 96 באר).</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר מכן, להעביר את נפח המתאים של תרחיף התא למאגר מגיב (סטרילי) ולמלא עם המדיום תרבית מלאה עבור ZFL או ZEM2S ל 20 מ"ל. בעזרת פיפטה רב ערוצית, מערבבים את התמיסה בעדינות למעלה ולמטה. הערה: יש להקפיד לא ליצור קצף או בועות.</li>
	<li>הוסף 200 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת פוליסטירן שקופה 96 באר באמצעות micropipette רב ערוצי. לדגור את הצלחות ב 28 ° C במשך 24 שעות. הערה: על הלוח להכיל לפחות שלוש בארות ללא תאים לבקרה הריקה, ויש להוסיף רק מדיה שלמה לבארות אלה. אפקט הקצה (הנגרם על ידי אידוי גבוה יותר בבארות הקצה) מתרחש בדרך כלל במבחני לוחות של 96 בארות ויכול להשפיע על הכדאיות של התאים בבארות הקצה של הצלחת28. השפעה זו יכולה להיות גבוהה או נמוכה יותר בהתאם למותג הצלחת 96 בארות ועיצוב28. למרות שלא הבחנו בהפרעה כלשהי בצמיחת תאים / כדאיות עבור ZFL ו- ZEM2S בבארות הקצה, אנו מציעים לאטום את הצלחת עם רדיד איטום פרפילם או דבק כדי למנוע השפעה זו, או לטפח את התאים רק ב -60 הבארות הפנימיות ולמלא את בארות הקצה עם PBS.</li>
</ol>4. חשיפה של תאים לבדיקת כימיקלים
<ol><li>בזהירות להשליך את התקשורת בילה מן הבארות באמצעות micropipette רב ערוצי.</li>
	<li>חשוף את התאים לבדיקת כימיקלים בריכוזים שונים. הכינו את התמיסות של הריכוזים הכימיים לבדיקה בתרבית עבור ZFL או ZEM2S ללא נסיוב בקר עוברי (FBS) (מדיית חשיפה). לאחר מכן, הוסף 100 μL לכל באר של תמיסות אלה בטריפליקט טכני (כלומר, שלוש בארות / ריכוז כימי בדיקה).</li>
	<li>עבור בקרות, מקם את קבוצות הבקרה על אותה צלחת כמו כימיקל הבדיקה בטריפליקטים טכניים (שלוש בארות/קבוצת ביקורת). כך, עבור הבקרה הריקה (B), הוסף 100 μL של מדיית החשיפה בבארות נטולות תאים, עבור הבקרה השלילית (NC), הוסף 100 μL של מדיית החשיפה לבארות עם תאים, ועבור הבקרה החיובית (PC), חשוף את התאים לתמיסה של 1% Triton X-100 שהוכנה במדיית החשיפה. במקרים מסוימים, בקרת ממס (SC) צריכה להיכלל בצלחת, בהתחשב בריכוז לא ציטוטוקסי בעליל כריכוז ממס סופי. הערה: מומלץ להשתמש ב-0.5% DMSO כממס; DMSO יכול לשמש עד 1% כממס בשורות תאים אלה מבלי לחרוג מסף ציטוטוקסיות של 10% הקשורים לבקרה השלילית.</li>
	<li>לדגור את הצלחות ב 28 ° C במשך 24 שעות. אטמו את הצלחות עם רדיד אלומיניום פרפילם או דבק כדי למנוע אידוי בינוני של התרבית. הערה: כימיקלים מסוימים עשויים להיות בעלי ספיגת רקע פנימית או פלואורסצנטיות שעלולים להפריע לספיגה או לפלואורסצנטיות של צבעי האינדיקטור (למשל, תרכובות עם צבע עשויות להשפיע על הספיגה, אלבומיןבסרום 29 ותרכובות המפריעות לאנזימי חיזור30,31). במקרה זה, הצלחת חייבת לכלול בקרה נוספת על ידי הוספת פתרונות כימיים בדיקה בבארות ללא תאים. זאת כדי לאמת את ההפרעה האפשרית של הספיגה האוטומטית הכימית / אוטופלואורסצנטיות עם הצבעים. אם מזוהה הפרעה, יש להעריך אם ניתן לשלול אותה כדי לקבל חיזוי נכון של ציטוטוקסיות.</li>
</ol>5. בדיקות ציטוטוקסיות
הערה: הכינו את כל הפתרונות לפי טבלה 1. כל השלבים המתוארים להלן (איור 1) מתבצעים בתנאים סטריליים. השימוש בפיפטה כדי להשליך את אמצעי החשיפה אינו מומלץ, מכיוון שהתאים יכולים להתנתק בקלות מהבארות לאחר טיפול כימי.
<ol><li>מבחני AB ו- CFDA-AM<ol><li>לאחר 24 שעות של חשיפה לכימיקלים בבדיקה, יש להשליך בזהירות את מדיית החשיפה על-ידי מזיגת התוכן למגש איסוף.</li>
		<li>לשטוף את הצלחת עם 200 μL של PBS. הסר בזהירות את PBS על ידי מזיגת אותו לתוך מגש איסוף כדי למנוע אובדן תאים.</li>
		<li>הוסף 100 μL לכל באר של תמיסת AB/CFDA-AM. לדגור על הצלחת במשך 30 דקות בחושך ב 28 ° C.</li>
		<li>מדוד את הפלואורסצנטיות בקורא לוחות פלואורסצנטיים ב- 530 ננומטר (עירור) ו- 595 ננומטר (פליטה) עבור AB, וב- 493 ננומטר (עירור) ו- 541 ננומטר (פליטה) עבור CFDA-AM.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת NR הערה: השלבים עבור בדיקת NR מתבצעים מיד לאחר מבחני AB ו-CFDA-AM (איור 1).<ol><li>צנטריפוגה את פתרון העבודה NR (40 מיקרוגרם / מ"ל) ב 600 × גרם למשך 10 דקות. הערה: אין להעביר משקעים של NR בצינור ללוחות. לכן, לאחר צנטריפוגה של פתרון העבודה NR, לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה מבלי לשאוף את משקעי NR. מעבירים את הסופרנאטנט למאגר מגיבים.</li>
		<li>הסר בזהירות את תמיסת AB/CFDA-AM על-ידי מזיגת התוכן למגש איסוף.</li>
		<li>הוסף 100 μL לכל באר של פתרון העבודה NR באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית. לדגור את הצלחת ב 28 ° C במשך 3 שעות. הערה: לאחר הדגירה של 3 שעות, בדוק אם משקעים NR התרחשו בלוחות באמצעות מיקרוסקופ. משקעי NR עלולים להפריע לכימות יכולת הקיום של התא, ולכן הם לא אמורים להיות נוכחים.</li>
		<li>הסר בזהירות את תמיסת NR על-ידי מזיגת התוכן למגש איסוף. לשטוף את הבארות על ידי הוספת 150 μL של PBS לכל באר.</li>
		<li>מוסיפים 150 μL לכל באר של תמיסת מיצוי NR ודגרים על הצלחת על שייקר צלחת למשך 10 דקות לניעור עדין. מדוד את הספיגה ב- 540 ננומטר בקורא לוחות. הערה: יש לבצע קריאה שנייה ב- 690 ננומטר כדי לא לכלול ספיגת טביעות אצבע ברקע בלוחית.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת MTT הערה: בדיקת MTT חייבת להתבצע בנפרד מהבדיקות המתוארות לעיל (בלוח חדש) (איור 2).<ol><li>הסר בזהירות את המדיה החשופה על-ידי מזיגת התוכן למגש איסוף.</li>
		<li>הוסף 100 μL של פתרון עבודה MTT לכל באר באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית. לדגור את הצלחת ב 28 ° C במשך 4 שעות.</li>
		<li>השליכו את תמיסת MTT על ידי יציקת התוכן למגש איסוף.</li>
		<li>מוסיפים 100 μL לכל באר של DMSO כדי לחלץ את גבישי הפורמזן, ודוגרים את הצלחת על שייקר צלחת במשך 10 דקות. מדוד את הספיגה ב- 570 ננומטר באמצעות קורא לוחות. הערה: יש לבצע קריאה שנייה ב- 690 ננומטר כדי לא לכלול ספיגת טביעות אצבע ברקע בלוחית. חשוב לציין כי כימיקלים לבדיקה עלולים להפריע ל- MTT, אשר יש להעריך כדי להבטיח את איכות הנתונים שנוצרו32. לשם כך יש לחשוף בארות נטולות תאים המכילות את ריכוזי הבדיקה ו-MTT (0.5 מ"ג/מ"ל), ולאחר מכן לדגור כדי לצפות בכל שינוי צבע בבארות שעלול להגביר את הספיגה ולהוביל לתוצאות כדאיות שווא. יש להימנע מכימיקלים המקיימים אינטראקציה עם MTT בבדיקה זו.</li>
	</ol></li>
</ol>6. חישוב כדאיות התא / ציטוטוקסיות
הערה: הספיגה הגולמית או הפלואורסצנטיות הנרכשת משמשת לחישוב כדאיות התא כאחוז הקשור לבקרה שלילית (עבור כימיקלים לבדיקה שהוכנו ישירות באמצעי חשיפה) או בקרת ממס (עבור כימיקלים לבדיקה שהוכנו באמצעות ממסים, כגון DMSO). לפני קביעת אחוז הכדאיות של התא, הנתונים הגולמיים חייבים להיות מנורמלים על-ידי הפקד הריק.
<ol><li>חישוב ממוצע הספיגה או הפלואורסצנטיות עבור כל קבוצת בדיקה של ריכוז כימי וקבוצת ביקורת (שלוש בארות/טיפול).</li>
	<li>כדי לקבוע את אחוז הכדאיות של התא ביחס לבקרה (שלילית או ממס), השתמש במשוואה (2): <img alt="נוסחת חישוב כדאיות התא בניתוח ביוכימי, המציגה אחוזים המבוססים על ספיגה." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> (2) הערה: יחידות ספיגה (ABS) או פלואורסצנטיות (fluo) מייצגות את ממוצע הספיגה או הפלואורסצנטיות הנמדד בשלוש הבארות לכל ריכוז; ריק מייצג בארות ללא תאים.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

מבחני ציטוטוקסיות נמצאים בשימוש נרחב להערכת רעילות חוץ גופית, ומאמר פרוטוקול זה מציג ארבע בדיקות ציטוטוקסיות נפוצות ששונו לביצוע בשורות תאים של דגי זברה (כלומר, צפיפות תאים עבור צלחת 96 בארות, זמן דגירה במבחן MTT, דלדול FBS במהלך מצב החשיפה לכימיקלים, וריכוז מרבי מקובל עבור SC). מכיוון שבדיקות אלה מכמתות ציטוטוקסיות לפי נקודות קצה שונות של כדאיות התא (תפקוד מטבולי, שלמות קרום ליזוזומלי ושלמות קרום התא), השילוב ביניהן מספק הערכה מדויקת של ציטוטוקסיות כימית בשורות תאים של דגי זברה. פרוטוקול זה ממליץ גם על תרבית של...

חומרים כימיים צריכים להיבדק לגבי בטיחותם לבריאות האדם והסביבה. סמנים ביולוגיים מולקולריים ותאיים נלקחים בחשבון יותר ויותר בהערכות בטיחות כדי לחזות השפעות על אורגניזמים חיים על ידי סוכנויות רגולטוריות ו / או חקיקה (למשל, REACH, OECD, US EPA)1,2, שכן הם יכולים להקדים את התוצאה השלילית in vivo (למשל, הפרעה אנדוקרינית, תגובה חיסונית, רעילות חריפה, פוטוטוקסיות)3,4,5,6,7 . בהקשר זה, ציטוטוקסיות נלקחה כמדד לחיזוי רעילות חריפהשל דגים 5,8; עם זאת, יכולים להיות לה יישומים רבים אחרים במחקרי רעילות אקולוגית, כגון הגדרת ריכוזים תת-ציטוטוקסיים של חומרים כימיים כדי לחקור את מערך ההשפעות המגוון ביותר שלהם על דגים (למשל, השפעות משבשות אנדוקריניות).
במערכות תרבית תאים (מערכות במבחנה ), ציטוטוקסיות של חומרים כימיים יכולה להיקבע על ידי שיטות שונות בסוגי נקודות הקצה. לדוגמה, שיטה ציטוטוקסית יכולה להתבסס על נקודת קצה הקשורה למורפולוגיה ספציפית שנצפתה במהלך תהליך המוות של התא, בעוד ששיטה אחרת יכולה לקבוע ציטוטוקסיות על ידי מדידת מוות תאי, כדאיות ופונקציונליות, מורפולוגיה, מטבוליזם של אנרגיה והתקשרות תאים והתפשטות. חומרים כימיים יכולים להשפיע על כדאיות התא באמצעות מנגנונים שונים, ולכן הערכת ציטוטוקסיות המכסה נקודות קצה שונות של כדאיות התא נחוצה כדי לחזות השפעות כימיות9.
MTT ו- Alamar Blue (AB) הם מבחנים הקובעים את ההשפעות על כדאיות התא בהתבסס על פעילות מטבולית של תאים. בדיקת MTT מעריכה את הפעילות של האנזים המיטוכונדריאלי סוקצינאט דהידרוגנאז10. ההפחתה של 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) לכחול formazan מתרחשת רק בתאים בני קיימא, והצפיפות האופטית שלו עומדת ביחס ישר למספר התאים הקיימים10. בדיקת AB היא אינדיקטור רגיש להפחתת חמצון, המתווך על ידי אנזימים מיטוכונדריאליים המפליאים ומשנים את צבעם בעת הפחתת רזזורין לרסורופין על ידי תאים חיים11; עם זאת, אנזימים ציטוסוליים ומיקרוזומליים תורמים גם הם להפחתת AB ו- MTT12. אנזימים אלה עשויים לכלול מספר רדוקטאזים, כגון אלכוהול ואלדהיד אוקסידוקטאז, NAD(P)H: quinone oxidoreductase, flavin reductase, NADH dehydrogenase, ו cytochromes11.
בדיקת אדום נייטרלי (NR) היא בדיקת כדאיות תאים המבוססת על שילוב צבע זה בליזוזומים של תאים בני קיימא13. ספיגת NR תלויה ביכולת התאים לשמור על שיפועי pH. שיפוע הפרוטון בתוך הליזוזומים שומר על pH נמוך יותר מהציטופלסמה. ב-pH פיזיולוגי תקין, ה-NR מציג מטען נטו של כאפס, המאפשר לו לחדור לקרומי התא. לכן, הצבע הופך טעון ונשמר בתוך הליזוזומים. כתוצאה מכך, ככל שכמות ה-NR השמור גדולה יותר, כך גדל מספר התאים בני הקיימא14. חומרים כימיים הפוגעים בפני השטח של התא או בקרומים הליזוזומליים פוגעים בספיגה של צבע זה.
בדיקת CFDA-AM היא בדיקת כדאיות תאים פלואורומטרית המבוססת על שימור 5-carboxyfluorescein diacetate acetoxymethyl ester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, מצע אסטראז, מומר לקרבוקסיפלואורסצאין, חומר פלואורסצנטי שהוא קוטבי ובלתי חדיר על ידי ממברנות של תאים חיים15; לכן, הוא נשמר בצד הפנימי של קרום התא שלם, המציין תאים קיימא.
לאחרונה, שלוש בדיקות ציטוטוקסיות (CFDA-AM, NR ו- AB assays) שולבו בהנחיית ISO (ארגון התקינה הבינלאומי) מאומתת (ISO 21115:2019)16 ובשיטת הבדיקה של OECD (הארגון לשיתוף פעולה ופיתוח כלכלי) (OECD TG 249) להערכת רעילות חריפה של דגים באמצעות קו התאים RTgill-W1 (קו תאים קבוע מפורל הקשת [Oncorhynchus mykiss] gill) בצלחות 24 בארות17 . למרות שקיימת שיטה מבוססת תאים לחיזוי רעילות חריפה של דגים, הושקעו מאמצים בפיתוח שיטות דומות עם מיני דגים אחרים ובהגדלת התפוקה של השיטה. כמה דוגמאות כוללות פיתוח של קווי תאי ZFL הנגועים בגנים של כתב עבור מסלולי רעילות ספציפיים18,19, בדיקות פוטוטוקסיות בקו תאי RTgill-W120, והשימוש בקווי תאים ZFL ו- ZF4 (פיברובלסטי של דגי זברה שמקורם בעוברים בני יום אחד) כדי להעריך רעילות על ידי מספר בדיקות ציטוטוקסיות21.
דג זברה (Danio rerio) הוא אחד ממיני הדגים העיקריים המשמשים בחקר רעילות ימית; לכן, שיטות מבוססות תאים עם שורות תאים של דגי זברה לבדיקת רעילות דגים עשויות להיות שימושיות ביותר. קו תאי ZFL הוא קו תאי הפטוציטים אפיתל של דג זברה המציג את המאפיינים העיקריים של תאים פרנכימליים בכבד ויכול לעכל קסנוביוטיקה 7,22,23,24,25. בינתיים, קו התאים ZEM2S הוא קו תאים פיברובלסטי עוברי של דג זברה הנגזר משלב הבלסטולה שניתן להשתמש בו כדי לחקור השפעות התפתחותיות על דגים26,27. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר ארבע בדיקות ציטוטוקסיות (מבחני MTT, AB, NR ו- CFDA-AM), עם שינויים שיש לבצע עם קווי תאים ZFL ו- ZEM2S בלוחות 96 בארות.

<table><tbody><tr><td>5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester)</td> <td>Invitrogen</td><td>C1345</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים, צלחת 96 באר</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td>משטח: סטנדרטי, בסיס שטוח</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>אבקה, גלוקוז גבוה, פירובט</td></tr><tr><td>FBS - סרום בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>תערובת נוטריאנטים F-12 של Ham's, אבקת</td><td>גיבקו</td><td>21700026</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>(1 מ')</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td>Powder</td>Neutral</tr> Red<tr><td>&nbsp;</td>אבקת <td>Sigma-Aldrich</td><td>N4638</td><td>, BioReagent, מתאימה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 מ"מ קוטר סיבוב</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10X) עם סידן ומגנזיום</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יחידות / מ"ל)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin מלח נתרן&nbsp;</td><td>אבקת Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td>, BioReagent, מתאימה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>, &nbsp; bioreagent לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide&nbsp; 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים ZEM2S</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>קו תאים זה נתרם באדיבות על ידי פרופסור ד"ר מייקל ג'יי קרוואן (אוניברסיטת ויסקונסין, מילווקי, ארה"ב)</td></tr><tr><td>קו תאים ZFL</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקות ציטוטוקסיות עם קווי תאים של דגי זברה

Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines

קווי תאי דגים הפכו יותר ויותר בשימוש במחקרי רעילות אקולוגית, ומבחני ציטוטוקסיות הוצעו כשיטות לחיזוי רעילות חריפה של דגים. לפיכך, פרוטוקול זה מציג מבחני ציטוטוקסיות ששונו כדי להעריך את כדאיות התא בדגי זברה (Danio rerio), עובר (ZEM2S) וקווי תאי כבד (ZFL) בלוחות 96 בארות. נקודות הקצה של ציטוטוקסיות שהוערכו הן שלמות מיטוכונדריאלית (מבחני Alamar Blue [AB] ו-MTT), שלמות הממברנה באמצעות פעילות אסטראז (בדיקת CFDA-AM), ושלמות הממברנה הליזוזומלית (בדיקת אדום נייטרלי [NR]). לאחר חשיפת חומרי הבדיקה בצלחת 96 בארות, מבוצעות בדיקות ציטוטוקסיות; כאן, AB ו- CFDA-AM מתבצעים בו זמנית, ואחריו NR על אותה צלחת, בעוד בדיקת MTT מבוצעת על צלחת נפרדת. הקריאות עבור בדיקות אלה נלקחות על ידי פלואורסצנטיות עבור AB ו- CFDA-AM, וספיגה עבור MTT ו- NR. ניתן להשתמש במבחני ציטוטוקסיות המבוצעים עם קווי תאי דגים אלה כדי לחקור את הרעילות החריפה של חומרים כימיים על דגים.

איור 3 מראה את הלוחות של מבחני AB, CFDA-AM, NR ו-MTT. עבור בדיקת AB (איור 3A), הבארות והבארות הריקות ללא או מספר מופחת של תאים בני קיימא מראות צבע כחול ופלואורסצנטיות נמוכה, בעוד שהבארות עם מספר גבוה של תאים בני קיימא הן ורדרדות ומציגות ערכי פלואורסצנטיות גבוהים עקב הפיכת רסזורין (AB) לרסורופין (חומר ורדרד) על-ידי התאים בני הקיימא. עבור בדיקת CFDA-AM, אין הבדל נראה לעין בצבע הבארות על הצלחת; עם זאת, הפלואורסצנטיות גבוהה יותר בבארות המכילות תאים ברי קיימא עקב שימ...

פרוטוקול זה מציג מבחני ציטוטוקסיות נפוצים (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red ו-MTT assays) המותאמים להערכת ציטוטוקסיות בעוברים של דגי זברה (ZEM2S) ובקווי תאי כבד (ZFL) בלוחות של 96 בארות.

Fish cell lines have become increasingly used in ecotoxicity studies, and cytotoxicity assays have been proposed as methods to predict fish acute ...

פרוטוקול בדיקת ציטוטוקסיות המשתמש בשורות תאים של דגי זברה יכול לענות על שאלות בנוגע לרעילות חריפה של כימיקלים על דגים או לעזור להגדיר את ריכוזי הבדיקה המתאימים לבדיקות דגים חלופיות אחרות. היתרון העיקרי של בדיקת צלחת זו של 96 בארות הוא שילוב של נקודות קצה שונות של כדאיות כדי לקבוע ציטוטוקסיות עבור תאי דגי זברה, שהוא מין דגים חשוב במחקרי רעילות אקולוגית. הפרוטוקול פשוט מאוד.אם אתה מבצע את כל השלבים המתוארים כראוי, אחד לא צריך להיתקל בכל בעיה. פרוטוקול זה אינו מסייע להשיג מחקרי רעילות אקולוגית המבוססים על בעלי חיים המעריכים השפעות בשורות תאי דגים הנגזרות מאיברים שונים או משלבי חיים שונים, כגון הפטוציטים בתאים עובריים. כדי להתחיל לצפות את תאי ZEM2S או ZFL, חשב את נפח מתלי התאים המתאימים הדרושים להשגת מספר התאים הרצוי לבדיקות.מלא מאגר מגיב סטרילי עם מדיום התרבית המלא עבור קו התא המתאים ולהעביר את נפח מחושב של השעיית התא למאגר עבור נפח כולל של 20 מיליליטר. בעזרת פיפטה רב ערוצית, מערבבים בעדינות את התמיסה למעלה ולמטה מבלי ליצור קצף או בועות. לאחר מכן באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, להוסיף 200 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת פוליסטירן שקופה 96-באר כדי לקבל ספירת תאים קיימא של 60, 000 תאים לכל באר עבור תאי ZEM2S ו 40, 000 תאים לכל באר עבור תאי ZFL.לדגור על הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. כדי לחשוף את כל סוגי התאים לריכוזים שונים של כימיקלים לבדיקה, הכינו את הריכוז הרצוי של תמיסות כימיות בדיקה באמצעי התרבית לקו התא המעניין ללא נסיוב בקר עוברי או FBS. לאחר הדגירה של 24 שעות, בזהירות להשליך את המדיה בילה מן הבארות באמצעות micropipette רב ערוצי.לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסה כימית בדיקה מסוימת לכל באר בטריפליקטים טכניים, כלומר שלוש בארות לכל ריכוז כימי בדיקה. הניחו את קבוצות הבקרה על אותה צלחת כמו כימיקלים הבדיקה בטריפליקטים טכניים. עבור הבקרה הריקה, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיית החשיפה בשלוש בארות נטולות תאים.עבור הבקרה השלילית, להוסיף 100 מיקרוליטר של אמצעי החשיפה לשלוש בארות המכילות תאים. לבקרה חיובית, חשוף שלוש בארות המכילות תאים לתמיסת טריטון X-100 1% שהוכנה במדיית החשיפה. אטמו את הפלטות עם רדיד אלומיניום פרפילם או דבק למניעת אידוי בינוני של התרבית ודגרו על הצלחות בטמפרטורה של 28 מעלות למשך 24 שעות.לאחר 24 שעות מהחשיפה הכימית לבדיקה, יש להשליך בזהירות את מדיית החשיפה מהבארות על ידי יציקת התוכן למגש איסוף ולשטוף כל באר עם 200 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן כדי להסיר את PBS מבלי לאבד תאים, בזהירות לשפוך אותו לתוך מגש איסוף. כדי לבצע את בדיקות Alamar Blue או AB ו- CFDA-AM, הוסף 100 מיקרוליטר של התמיסה המתאימה לכל באר ודגר על הצלחת במשך 30 דקות בחושך ב 28 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, מדדו את הפלואורסצנטיות בקורא לוחות פלואורסצנטיים באורכי גל העירור והפליטה המתאימים המוזכרים בטקסט. כדי לבצע את הבדיקה האדומה או NR הניטרלית, קח את פתרון העבודה NR בעל ריכוז של 40 מיקרוגרם למיליליטר וצנטריפוגה ב 600 גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר בזהירות את פתרונות AB ו- CFDA-AM שנוספו בעבר מהבארות על ידי יציקת התוכן למגש איסוף.באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון העבודה NR לכל באר לדגור את הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר סיום הדגירה, יוצקים בזהירות את תמיסת NR מהצלחת למגש איסוף, ושוטפים את הבארות על ידי הוספת 150 מיקרוליטר PBS לכל באר. לאחר השטיפה, הוסיפו 150 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי NR לכל באר ודגרו על הצלחת על ידי ניעור עדין על שייקר צלחות למשך 10 דקות לפני מדידת הספיגה ב-540 ננומטר באמצעות קורא צלחות.כדי לבצע את בדיקת MTT, לאחר החשיפה הכימית של 24 שעות, הסר בזהירות את מדיית החשיפה על ידי יציקת התוכן למגש איסוף ושימוש במיקרופיפטה רב ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של פתרון עבודה MTT לכל באר בחושך. דוגרים על הצלחת בחום של 28 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות בחושך. לאחר מכן השליכו את תמיסת MTT על ידי יציקת התוכן למגש איסוף והוסיפו 100 מיקרוליטר DMSO לכל באר כדי לחלץ את גבישי הפורמזן.יש לדגור על הצלחת על שייקר במשך 10 דקות לפני מדידת הספיגה ב-517 ננומטר באמצעות קורא צלחות. עבור בדיקת AP, הבארות המתאימות לבקרה ריקה, חיובית וריכוזים ציטוטוקסיים מאוד של כימיקלים לבדיקה הראו צבע כחול ופלואורסצנטיות נמוכה המצביעים על היעדר או הפחתה של תאים בני קיימא. לעומת זאת, הבארות המתאימות לריכוזים ציטוטוקסיים נמוכים של בקרה כימית ושלילית המכילה מספר גבוה של תאים ברי קיימא המירו את הרזזורין לרסורופין ורוד בעל פלואורסצנטיות גבוהה יותר.עבור בדיקת NR, ריכוזים ציטוטוקסיים מאוד של כימיקלים לבדיקה ובקרה חיובית הם שקופים או ורודים בהירים עם ספיגה נמוכה, בעוד בארות המכילות תאים קיימא השומרים על צבע NR הציגו צבע ורוד כהה וספיגה גבוהה. באופן דומה, עבור בדיקת MTT, בארות ללא תאים ברי קיימא הן שקופות, בעוד אלה המכילות תאים קיימא הופכות MTT לפורמזן בצבע סגול. בהתבסס על אחוזי הכדאיות של התא המחושבים, ריכוז המעכב החצי המקסימלי או ערך IC50 הוערך עבור כימיקלים שונים בקווי תאים ZFL ו- ZEM2S.לא נצפה הבדל משמעותי בכדאיות התא עבור תרביות עם ובלי FBS, דבר המצביע על התאמתם של אמצעי תרבית שנשללו מ-FBS למשך תקופת חשיפה כימית של 24 שעות. בדיקות MTT ו-NR לא הראו השפעה משמעותית של ריכוזי DMSO משתנים מ-0.1% ל-1% על כדאיות התא, מה שמצביע על כך שקווי תאים אלה תומכים בשימוש ב-DMSO כממס עד 1%שימו לב במיוחד בעת הטיפול בתאים מצופים כדי למנוע ניתוק עצמי במהלך כל ההליך והכינו בזהירות את תמיסת העבודה האדומה הניטרלית כדי למנוע משקעים בצבע. הליך זה יכול להיות מיושם במחקרים העוסקים במספר היבטים של השפעות כימיות על דגים באמצעות מודלים במבחנה, ולתרום להתקדמות של מחקרים על רעילות אקולוגית ללא בעלי חיים.

cytotoxicity-assays-with-zebrafish-cell-lines

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

סרטון זה מתאר את בדיקת xenograft של דג הזברה כדי להעריך היווצרות גידול in vivo וללמוד את ההשפעה של חומרים טיפוליים.

Zebrafish Xenograft Assay: שיטה להערכת היעילות האנטי-סרטנית של טיפולים על גידולים בדגי זברה in vivo

עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) ב זברה-דג מבוגר באמצעות ציספלטין כסוכן נטרוקסי. פירטנו את השלבים כדי להעריך את הרבייה של הטכניקה ושתי טכניקות לניתוח דלקת ומוות תאים ברקמת הכליה, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL, בהתאמה.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

מאמר זה מציג את השיטה של פיתוח, אפיון ומעקב בזמן אמת של גרורות הגידול במודל דגי הזברה של נוירובלסטומה, במיוחד בקו דגי הזברה הטרנסגניים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO1, המפתח גרורות באופן ספונטני.

מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

דג הזברה נוצל לאחרונה כמודל לאימות משנים פוטנציאליים של קרינה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים המפורטים לשימוש בעוברים של דגי זברה לניסויי סינון מבוססי קרינה וכמה גישות תצפיתיות להערכת ההשפעה של טיפולים וקרינה שונים.

זחלי דגי זברה כמודל להערכת רדיוסנסיטיזרים או מגינים פוטנציאליים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים של שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים).

שיטת תרבית תלת ממדית של ספרואידים של קווי תאים עובריים ודגי זברה בכבד

השתמשנו בצביעת התפשטות תאים כדי לזהות תאים שקטים במודל לוקמיה לימפובלסטית חריפה מסוג T של דג הזברה. הכתם נשמר בתאים שאינם מתחלקים ומצטמצם במהלך התפשטות התאים, מה שמאפשר בחירה של תאים רדומים להמשך חקירה. פרוטוקול זה מספק כלי פונקציונלי לחקר התחדשות עצמית בהקשר של שקט תאי.

זיהוי תאים שקטים במודל לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T של דג זברה באמצעות צביעת התפשטות תאים 

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

נהלי Microplate מבוססות מתוארים לניתוח colorimetric או fluorometric של פעילות אנזים תאית. נהלים אלה מאפשרים לassay המהיר של פעילות מסוג זה במספר הגדול של דגימות סביבתיות בתוך מסגרת זמן לניהול.

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

חקור הערכת ציטוטוקסיות בקווי תאים של דגי זברה (ZEM2S ו-ZFL) באמצעות מגוון מבחני חיות. שיטה זו תומכת במחקר אקוטוקסיקולוגי ללא שימוש בבעלי חיים ומספקת פרוטוקול פשוט ואמין לבדיקת רעילות כימיקלים.

בדיקות ציטוטוקסיות עם קווי תאים של דגי זברה

גלה סרטונים נוספים