דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמת הלבלב שהודגם הוא פשוט ומספק כלי לבידוד תאים בודדים בני קיימא מרקמת הלבלב בשלבים שונים בתהליך הממאירות, כולל גידולים מוצקים. שחזור תאים אצינאריים שלמים וברי קיימא הוא אתגר גדול. הפרוטוקול יכול לשחזר תאים בודדים קיימא מלבלב רגיל, לבלב שיש נגעים טרום ממאירים, או גידולים בלבלב המכילים תאי סטרומה וחיסון רבים.

השימוש בפרוטוקול זה לניתוח גידולי לבלב אנושיים או לבלב מודלק יכול לסייע בחקירת מחלות אלה כדי למצוא סמנים ביולוגיים וטיפולים חדשים. השיטה קלה לשימוש ויכולה לספק את התוצאות הרצויות עם תרגול מינימלי. סרטון זה יעזור להציג את הפרטים הקטנים של הפרוטוקול.

לפני תחילת הנתיחה, שמור את כל המכשירים והציוד מוכנים על קרח. לאחר תיקון העכבר המורדם, לרסס את בטנו עם 70% אתנול. באמצעות מספריים ומלקחיים, לבצע חתך בצורת V של 2.5 ס"מ באזור איברי המין של החיה, ולהמשיך כלפי מעלה כדי לפתוח באופן מלא את חלל הבטן.

אתר את הבטן בצד שמאל של העכבר ואת הלבלב, אשר ליד הטחול. באמצעות שני מלקחיים, להפריד את הלבלב מן הבטן ואת התריסריון ללא קריעה. המשך ולהפריד את הלבלב מן המעי הדק, jejunum ו ileum.

הזיזו את הלבלב לצד ימין והפרידו את החיבורים הנותרים בין הלבלב לחלל בית החזה בעזרת מלקחיים כדי לנתק לחלוטין את הלבלב והטחול המחובר. בזהירות, להסיר את הלבלב ללא שומן mesenteric או רקמה סמוכה אחרת, ולפרוס אותו לבדיקה בצלחת פטרי על קרח. בעקבות ההרכב המוזכר בטקסט, הכינו מראש את מאגרי הדיסוציאציה 1 ו-2, את חיץ השטיפה ואת תמיסת עצירת פעילות האנזים.

הניחו את הלבלב בצינור 50 מיליליטר על קרח ושטפו אותו בסרום בקר עוברי 10%, או FBS, ותמיסת מלח מאוזנת של האנק, או HBSS. השומן יצוף והלבלב ישקע. זוהי דרך קלה לדמיין ולהסיר במהירות את רקמת השומן הלבן המזהמת עדיין מחובר ללבלב.

לאחר מכן, העבירו ושמרו את רקמת הלבלב של העכבר בצלחת פטרי סטרילית המכילה חמישה מיליליטר HBSS על קרח עד לחיתוך. בעזרת מספריים Noyes ואזמל, לחתוך את הלבלב לחתיכות קטנות של אחד עד שלושה מילימטרים מעוקבים. לאחר העברת הרקמות לצינור צנטריפוגה, צנטריפוגות אותו ב 350G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

שאפו והשליכו את הסופרנאטנט כדי להסיר שברי תאים ותאי דם. השהה מחדש את החתיכות במאגר דיסוציאציה 1 המכיל 0.02%trypsin-C ו- 0.05% EDTA למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה. יש לשטוף מיד עם 10% FBS ו-Modified Eagle's Medium של Dulbecco, או DMEM, וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-350G ובארבע מעלות צלזיוס.

יש לשטוף שוב על ידי השעיית הגלולה ב-10 מיליליטר של חיץ כביסה, וצנטריפוגה כבעבר למשך חמש דקות לפני שלב הדיסוציאציה הבא. לדגור על הלבלב בחיץ דיסוציאציה 2 למשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב 180 סיבובים לדקה. לאחר 15 דקות, לבצע דיסוציאציה מכנית על ידי pipeting נמרצות את שברי הלבלב למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטות סרולוגיות סטריליות.

חזור על שימוש פיפטות בגודל יורד, החל מ 25, 10, ל 5 מיליליטר. לדגור על הדגימה כדי להביא אותה ל 37 מעלות צלזיוס. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לפקח על הדיסוציאציה בהתאם לכמות התא הבודד בהשעיה.

נטר את כדאיות התא באמצעות כחול טריפאן. המשך הדגירה ובדוק את הדיסוציאציה על ידי לקיחת דגימות כל חמש דקות. דוגרים עד ש-90% מהתאים מופרדים לתאים בודדים.

לאחר שרקמת הלבלב מנותקת היטב, המסומנת על ידי היעלמות שברי הלבלב והעכירות הגוברת של התמיסה, עצור את התגובה האנזימטית על ידי שטיפה פעמיים עם פעילות אנזים להפסיק פתרון במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. משלב זה, שמור את תרחיף התא על קרח. מעבירים את תרחיף התא דרך רשת ניילון של 70 מיקרון.

גודל רשת ניילון קטן יותר עלול להפחית את כדאיות התא. בדוק את כדאיות התא מתחת למיקרוסקופ. השהה מחדש ושטוף את הגלולה עם 5 עד 10 מיליליטר של תמיסת שטיפה חוצצת קרה כקרח לפני ספירת התאים.

אם נצפים מספר תאי דם אדומים, יש לטפל בתאים עם חיץ ליזה של תאי דם אדומים למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. במקרים בהם נצפים גושים, יש לטפל שוב בדגימות עם טריפסין, כפי שתואר קודם לכן. אם הכדאיות נמוכה מ-80% יש לבודד תאים חיים באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית, או ערכת הסרת תאים מתים MACS עם עמודות MACS MS.

הצבע האדום של רקמת הלבלב המבודדת נבע מביטוי של tdTomato בתאי הלבלב האצינריים. בשלב מוקדם של הדיסוציאציה, היו מספר נמוך של תאים מבודדים ומספר גדול של גושים. מאוחר יותר הושגו תאים ברי קיימא מבודדים תוך הימנעות מהפחתת מספר התאים בני קיימא.

דגירה ארוכה יותר הפחיתה את יכולת הקיום של התאים. התאים החיוביים של tdTomato הוערכו באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות. פרוטוקול הדיסוציאציה העדינה תמך בהתאוששות של סוגי תאים מרובים, עם כדאיות גבוהה שאפשרה מעקב אחר מיון תאים של סוגי תאים רצויים.

ספירת התאים החיים לתאים המתים נעשתה באמצעות המאציטומטר. תמונות הפלואורסצנטיות של חלקי לבלב קפואים הראו תאי אצינר חיוביים tdTomato. ריצוף הרנ"א של התא הבודד אישר את הזיהוי של כל סוגי התאים שזוהו במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות בכל רקמה שנכרתה מכל נקודות הזמן.

נחקר ביטוי carboxypeptidase1, או CPA1 בתאים אצינריים, המצביע על זיהום מינימלי עם תעתיק של סוגי תאים אחרים. חשוב לציין כי זמני דגירה ארוכים יותר הפחיתו את הכדאיות של התאים, ולכן חשוב לעקוב אחר הדגימה ולצפות בדיסוציאציה של הרקמה וביכולת קיום התא כל כמה דקות תחת המיקרוסקופ. פרוטוקול בידוד התא יכול לשמש לריצוף RNA של תא בודד, תרבית תאים, או כחומר מוצא לאורגנואידים.

טכניקה זו מאפשרת לחקור כיצד מתפתח סרטן הלבלב, ולחקור את יחסי הגומלין בין תאים החודרים לרקמה דלקתית או סרטנית.