Name: הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: למד הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה. שיטה זו מספקת תובנות לגבי מנגנוני התנגדות לכימותרפיה ומאפשרת זיהוי ביומרקרים לטיפול ממוקד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה על הדרכתו של פאבל לובצ'בסקי, PhD בהקמת פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון במחלקה למיילדות וגינקולוגיה בסנט לואיס ולמחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית, לתוכנית מלגות הדיקן של אוניברסיטת וושינגטון, לקרן קבוצת אונקולוגיה גינקולוגית ולתוכנית לפיתוח מדעני פוריות על תמיכתם בפרויקט זה.

רקמת הגידול ומיימת התקבלו לאחר קבלת הסכמת המטופל כחלק ממאגר ביולוגי אונקולוגי אונקולוגי שאושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס ועדת הביקורת המוסדית (IRB). המטופלות נכללו אם היה להן סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה בשלב מתקדם (HGSOC). כל ההליכים בוצעו בטמפרטורת החדר על הספסל, אלא אם כן צוין אחרת. כל הריאגנטים הוכנו בטמפרטורת החדר (אלא אם צוין אחרת) ואוחסנו ב -4 מעלות צלזיוס.
1. דור אורגנואידים
<ol><li>צור את האורגנואידים בעקבות הדו"ח שפורסם בעבר20.</li>
</ol>2. ציפוי והקרנה של אורגנואידים
<ol><li>באמצעות אורגנואידים בתרבית, עקרו את לשוניות האורגנואידים מתבשיל התרבית באמצעות מניפולציה ידנית של קצה פיפטה. לאסוף את האורגנואידים בצינור חרוטי 15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בעזרת פיפטה, שואפים בזהירות מהסופרנאטנט.</li>
	<li>הוסיפו לגלולה 1,000 מיקרוליטר של אנזים רקומביננטי ללא מקור מן החי (ראו טבלת חומרים). מערבבים את התמיסה ודגרים במשך 15 דקות בחום של 37°C.</li>
	<li>צנטריפוגה את התמיסה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בעזרת פיפטה, בזהירות לשאוף את supernatant.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה ושאיפה, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-1,000 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט.</li>
	<li>מעבירים 10 μL של התמיסה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ומערבבים עם 10 μL של כחול טריפאן.</li>
	<li>קח 10 μL של תמיסת התא הכחול טריפאן לתוך תא ספירת תאים לשקופית והכנס אותו למכונת ספירת התאים (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>צלחת 40,000 תאים לכל 20 מיקרוליטר של תמצית קרום מרתף (BME) לתוך שקופית תא זכוכית 8 בארות (ראה טבלה של חומרים). זה שומר על האורגנואידים במשך 3-5 ימים כדי לאפשר לתאים ליצור אורגנואידים ולגדול לגודל מתאים.</li>
	<li>כדי לגרום לשברי דנ"א דו-גדיליים, הקרינו את האורגנואידים המצופים ב-10 קרינת קרינה אפורה (Gy) (ראו טבלת חומרים לפרטים על הקרן). הערה: פעולה זו עשויה להימשך עד 5-10 דקות.</li>
	<li>לדגור על האורגנואידים במדיה התרבית שלהם באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 4 שעות.</li>
</ol>3. צביעה immunofluorescence
הערה: נפחים מתייחסים לכמות לבאר של שקופית תא 8 בארות (~ 300 μL).
<ol><li>לאחר הקרנה ודגירה של אורגנואידים, לשאוף את התקשורת עם פיפטה, בזהירות כדי לא לשבש את המטריצה 3D. יש לשטוף עם 300 μL של PBS.</li>
	<li>תקן את האורגנואידים ב 300 μL של 2% paraformaldehyde (PFA) למשך 10 דקות. הערות: אל תעזוב זמן רב מדי, מכיוון שה- BME יתפרק ועלול להישאף.</li>
	<li>שטפו את האורגנואידים עם 300 מיקרוליטר של חיץ צביעה (ראו טבלת חומרים). מניחים על שייקר למשך 5 דקות.</li>
	<li>לחדירה, הוסיפו בעדינות 300 מיקרוליטר של חיץ חדירות (ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך 20 דקות. יש לשטוף עם 300 μL של חיץ צביעה. מניחים על שייקר למשך 5 דקות.</li>
	<li>הוסף 300 μL של חיץ צביעה כדי לחסום את שלב החדירה. מניחים על שייקר למשך 30 דקות. יש לשאוף את חיץ הכתמים באמצעות פיפטה.</li>
	<li>הוסף 300 μL של נוגדנים ראשוניים (ארנב נגד RAD51, עכבר אנטי Geminin, ארנב anti-RPA, עכבר anti-ɣH2AX, ארנב anti-Geminin, עכבר anti-53BP1; ראה טבלה של חומרים) מדולל במאגר צביעה. לדגור ב 4 ° C במשך 16 שעות. הערה: הימנעו מכתמים משותפים עם אותה חיה מארחת. השאירו את המכסה כדי למנוע מהנוגדנים להתערבב בבארות שכנות.</li>
	<li>הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית. יש לבצע שלוש שטיפות עם 300 מיקרוליטר של חיץ כתמים למשך 5 דקות כל אחת על השייקר.</li>
	<li>הוסף 300 μL של נוגדן משני (עז נגד עכבר Alexa fluor 488 ו עז נגד ארנב Alexa fluor 647; ראה טבלה של חומרים) פתרון מדולל בחיץ צביעה לדגור במשך 1 שעה בחושך. הערה: יש לבצע את כל השלבים הבאים בחושך.</li>
	<li>לשאוף את פתרון הנוגדנים המשני. הוסף 300 μL של DAPI מדולל. מניחים על שייקר למשך 5 דקות.</li>
	<li>יש לבצע שלוש שטיפות עם 300 מיקרוליטר של חיץ כתמים למשך 5 דקות כל אחת על השייקר. הסר את חיץ הצביעה ונתק את התאים באמצעות ערכת ההסרה המצורפת לשקופיות התא (ראה טבלת חומרים). הערה: הקפד לא לדחוף יותר מדי קדימה כדי לשבש את המטריצה התלת-ממדית.</li>
	<li>בעזרת קצה פיפטה p200 עם קצה חתוך, הוסיפו אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) כדי לכסות כל באר בלשונית אורגנואיד (למשל, 20-30 מיקרוליטר לכל לשונית אורגנואידים).</li>
	<li>הניחו כיסוי מעל הדגימה, והימנעו מבועות.</li>
	<li>יש לקחת לק שקוף ולצבוע אותו על צידי זכוכית הכיסוי כדי לאטום את המגלשה. תן לו להתקשות במשך 1 שעה ומניחים אותו ב -20 ° C. הערה: לאחר ההדמיה, ניתן לאחסן את השקופית למשך 6 חודשים לפחות עם אובדן מינימלי של פלואורסצנטיות.</li>
</ol>4. הדמיה
<ol><li>קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים) במטרה של 63x עם שמן טבילה. הערה: אם הדמיה של חלבונים גרעיניים, 63x הוא יתרון, אבל 40x הוא גם מקובל.</li>
	<li>השתמש ב- DAPI כדי לאתר את האורגנואידים דרך העינית. בחר את המסננים המתאימים למיקרוסקופ בהתבסס על הפלואורופורים שבהם נעשה שימוש. קבעו את הפרמטרים ללכידת תמונות z-stack. הערה: הפלואורופורים ששימשו במחקר היו DAPI, 488 ו-647. הלייזרים 405, 488 ו-638 הופעלו כדי להמחיש את הצביעה. הערה: מחסנית z המומלצת תלויה בעוצמת הפתרון.</li>
	<li>התאם את התמונה החיה: הגדר מיקוד, עוצמת לייזר וכו '. הערה: ככל שעוצמת הלייזר גבוהה יותר, כך גדל הסיכוי שהדגימה תצלם אקונומיקה. לכן, בחר עוצמת לייזר אופטימלית.</li>
	<li>רכוש את ערימת z. הערה: פעולה זו עשויה להימשך עד 5-10 דקות.</li>
	<li>מתוך התמונות שנאספו בערימת z, צילום מסך לפחות שלוש תמונות לכל ערימה. הערה: הקפד להשיג צילומי מסך בכל הערימה כדי לא לשכפל את הגרעינים בעת הכימות.</li>
	<li>שמור כל קובץ כ- TIFF והמשך לניתוח (שלב 5).</li>
</ol>5. ניתוח
הערה: השתמש ב- JCountPro לכל ניתוח תמונות בעקבות דוח21 שפורסם בעבר. כדי להשיג תוכנה זו, עיין בפרסום המשויך.
<ol><li>תחת לוח ניתוח האובייקטים (החלק העליון של התוכנית) בכרטיסייה בחירת קבצים (בחלק התחתון של התוכנית), בחר את קבצי TIFF .</li>
	<li>לחץ על הוסף כדי להעביר את הקבצים שנבחרו לקבוצת הקבצים שנבחרה. בחר תצוגה.</li>
	<li>תחת הכרטיסיה סגמנטציה, בחר כחול כצבע הגרעינים. בחר סגמנטציה אוטומטית כדי למטב את סף הגרעינים. הערה: אם הסגמנטציה האוטומטית אינה מזהה במדויק את האובייקטים, המשתמש יכול להתאים את הכוונון העדין והגולמי לתמונה או לעיין במדריך למשתמש כדי למטב עוד יותר את הסגמנטציה.</li>
	<li>בחלונית 'אובייקטים', בחרו 'פיצול אוטומטי של עצמים גדולים' ומיטוב גודל הגרעינים. הערה: לגרעינים יש בדרך כלל גודל בלתי מותנה של 5,000 פיקסלים, בעוד שהגודל המותנה הוא 1,500 פיקסלים. עיין במדריך למשתמש כדי למטב עוד יותר את גודל האובייקטים.</li>
	<li>בחר זהה אובייקטים כדי לבדוק את הפרמטרים. הערה: אם פרמטרים אלה אינם מדויקים, ניתן להתאים את הגודל והכוונון יחד עם הגדרות אחרות. עיין במדריך למשתמש לקבלת הוראות בנוגע למיטוב נוסף.</li>
	<li>לאחר התאמת הפרמטרים לתמונה, בחרו 'זהה עצמים בכל התמונות ' כדי לזהות את הגרעינים בכל התמונות שנבחרו.</li>
	<li>בחר בחלונית ניתוח מוקדים (בחלק העליון של התוכנית).</li>
	<li>תחת הכרטיסיה בחירת קבצים (תחתית התוכנית), בחר את קובצי TIFF ששימשו לניתוח אובייקטים ובחר בלחצני החצים (>>) כדי להעביר את התמונות לקבוצה קבצי תמונה.</li>
	<li>בקבוצת הספריות שמתחת לקובצי התמונה שהועברו, לחצו פעמיים על התיקייה Manual Edit ובחרו להעביר את קובצי ioc לקבוצה 'קובצי אוסף אובייקטים'. הערה: כל קובצי ה- TIFF שנבחרו חייבים להיות תואמים.</li>
	<li>הקש Select כדי להעביר את הקבצים לקבוצת הקבצים שנבחרה. בחר את הכרטיסייה ספירת מוקדים בתחתית התוכנית.</li>
	<li>מטב את הפרמטרים לפי השלבים הבאים.<ol><li>מדד הגדרות הכובע העליון: 12.</li>
		<li>ערוץ מיקוד: בחר את צבע המוקדים (ירוק: ɣ-H2AX; אדום: RAD51).</li>
		<li>הגדרות כיפה H: גובה הכיפה %: 30; אחוז חסימה %: 28 ו-28.</li>
		<li>הגדרת צורה/גודל: גודל מיקוד מינימלי, פיקסלים: 5. בחר החל צורה/גודל. גודל מיקוד מרבי (מותנה): 32. מעוגלות מינימלית, x100: 96. מיקוד מרבי, פיקסלים: 60.</li>
		<li>מסנן רעש: גודל 1. הערה: אם קובעים אם גרעין חיובי לצביעת גמינין, תחת הערוץ השני בחר ירוק, ותחת ניתוח בחר עוצמה.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי לבדוק את הגדרת הפרמטרים, בחר את הלחצנים הבאים לפי הסדר: כובע עליון > H-Dome > Foci Count. הערה: אם פרמטרים אלה אינם פועלים, ניתן להתאים את הגודל והכוונון יחד עם הגדרות אחרות. עיין במדריך למשתמש כדי ללמוד עוד על האופן שבו ניתן למטב את התמונה עוד יותר.</li>
	<li>לאחר מיטוב הפרמטרים לתמונות שנבחרו, בחרו 'ספירה אוטומטית ' כדי לספור את המוקדים בכל תמונה לכל גרעינים. אם רוצים את הערוץ השני, התוכנית תקבע את העוצמה שבה ניתן להשתמש.</li>
</ol>

<ol><li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li>
<li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer%3A+ASCO+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li>
<li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis%3A+impact+on+risk%2C+prognosis+and+therapy+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713(2020).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li>
<li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li>
<li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li>
<li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li>
<li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers%3A+sensitivity+to+PARP+inhibitors%2C+platinum%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li>
<li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li>
<li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654(2015).</li>
<li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li>
<li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+%CE%B3-H2AX+assay+to+monitor+DNA+damage+and+repair+in+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research.</a> Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).</li>
<li>Fuh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+deficiency+real-time+clinical+assays%2C+ready+or+not%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not.</a> Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).</li>
<li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li>
<li>Lee, E. K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054(2020).</li>
<li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li>
<li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer%3A+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984(2022).</li>
<li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li>
<li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li>
<li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li>
<li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAS6%2FAXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li>
<li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709(2020).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732(2016).</li>
<li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266(2018).</li>
<li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li>
<li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer%3A+function+and+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758(2020).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תגובת הנזק לדנ"א ממלאת תפקיד אינטגרלי הן בהתפתחות סרטן השחלות והן בעמידות לכימותרפיה. לכן, הבנה מעמיקה של מנגנוני תיקון DNA היא הכרחית. כאן מוצגת מתודולוגיה לחקר חלבונים לתיקון נזקי דנ"א באורגנואידים תלת-ממדיים שלמים. פרוטוקול אמין הניתן לשחזור פותח תוך שימוש בנוגדנים סימן היכר להערכת נזק לדנ"א, רקומבינציה הומולוגית, חיבור קצה לא הומולוגי ועקה של שכפול. חשוב לציין, שיטות אלה מאומתות באמצעות בקרות מהונדסות-גנטית המדגימות את הספציפיות והרגישות של שיטות אלה.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא ציפ...

סרטן השחלות הוא סיבת המוות המובילה עקב ממאירות גינקולוגית. רוב החולים מטופלים בתרופות הפוגעות בדנ"א כגון קרבופלטין, ואלה עם גידולים הומולוגיים עם תיקון רקומבינציה הומולוגית (HRR) יכולים לקבל מעכבי פולי (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP) 1,2. עם זאת, רוב החולים מפתחים עמידות לטיפולים אלה ומתים תוך 5 שנים מהאבחון. חוסר ויסות של תגובת הנזק לדנ"א (DDR) נקשר להתפתחות סרטן השחלות ולכימותרפיה ולעמידות למעכבי PARP3. לפיכך, מחקר של DDR הוא הכרחי להבנת הפתופיזיולוגיה של סרטן השחלות, סמנים ביולוגיים פוטנציאליים, וטיפולים ממוקדים חדשניים.
השיטות הנוכחיות להערכת DDR משתמשות באימונופלואורסנציה (IF), מכיוון שהדבר מאפשר זיהוי מדויק ולוקליזציה של חלבונים הפוגעים בדנ"א ואנלוגים לנוקלאוטידים. ברגע שיש שבר דו-גדילי (DSB) בדנ"א, חלבון ההיסטון H2AX עובר זרחן מהיר, ויוצר מוקד שבו חלבונים לתיקון נזקי דנ"א מתכנסים4. זרחן זה ניתן לזהות בקלות באמצעות IF; למעשה, בדיקת ɣ-H2AX שימשה בדרך כלל כדי לאשר את האינדוקציה של DSB 5,6,7,8,9. נזק מוגבר לדנ"א נקשר לרגישות פלטינה וליעילות של חומרים המזיקים לדנ"א 10,11,12, ו-ɣ-H2AX הוצע כסמן ביולוגי הקשור לתגובה כימותרפית בטיפולים אחרים בסרטן 13. ב-DSB, תא המיומן ב-HRR מבצע סדרה של אירועים שמובילים לכך ש-BRCA1 ו-BRCA2 מגייסים את RAD51 כדי להחליף את חלבון השכפול A (RPA) ולהיקשר לדנ"א. תיקון HRR משתמש בתבנית DNA כדי לתקן נאמנה את DSB. עם זאת, כאשר גידולים חסרים HRR, הם מסתמכים על מסלולי תיקון חלופיים כגון חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ). NHEJ ידוע כנוטה לטעויות ויוצר עומס מוטציות גבוה על התא, המשתמש ב- 53BP1 כמווסת חיובי14. חלבונים אלה הפוגעים בדנ"א יכולים להיות מזוהים במדויק כמוקדים באמצעות IF. בנוסף לצביעה של חלבונים, ניתן להשתמש ב-IF כדי לחקור הגנה מפני מזלג והיווצרות פער DNA חד-גדילי. היכולת לקבל מזלגות יציבים נמצאה בקורלציה עם תגובת פלטינה, ולאחרונה, מבחני פער הראו את הפוטנציאל לחזות את התגובה למעכבי PARP 6,15,16,17. לכן, צביעה עבור אנלוגים נוקלאוטידים לאחר הקדמה לתוך הגנום היא דרך נוספת ללמוד את DDR.
עד כה, הערכת ה- DDR בסרטן השחלות הוגבלה במידה רבה לקווי תאים דו-ממדיים הומוגניים שאינם משחזרים את ההטרוגניות השבט, המיקרו-סביבה או הארכיטקטורה של גידולי in vivo 18,19. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שאורגנואידים עדיפים על קווי תאים דו-ממדיים בחקר תהליכים ביולוגיים מורכבים כגון מנגנוני DDR6. המתודולוגיה הנוכחית מעריכה RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA וגמינין במחשבי PDO. שיטות אלה מעריכות את האורגנואיד השלם ומאפשרות לחקור מנגנוני DDR בסביבה דומה יותר למיקרו-סביבה של הגידול in vivo. יחד עם מיקרוסקופ קונפוקלי וספירת מוקדים אוטומטית, מתודולוגיה זו יכולה לסייע בהבנת מסלול DDR בסרטן השחלות והתאמה אישית של תוכניות הטיפול למטופלות.

<table><tbody><tr><td>1x תמיסת מלח חומצה פוספט עם סידן ומגנזיום (PBS++)</td><td>Sigma</td><td>14-040-133</td><td></td></tr><tr><td>1x תמיסת מלח חוצצת פוספט ללא סידן ומגנזיום (PBS)</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>ICN1860454</tr><tr><td>נוגדן Ant-53BP1&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>612522</td><td>מדולל ל-1:500 במאגר צביעה</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-ג'מינין&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab104306</td><td>מדולל ל-1:200 במאגר צביעה</td></tr><tr><td>נוגדן נגד ג'מינין&nbsp;</td><td>ProteinTech</td><td>10802-1-AP</td><td>מדולל ל-1:400 במאגר צביעה</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-RAD51&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab133534</td><td>מדולל ל-1:1000 במאגר מכתים</td></tr><tr><td>נוגדן נגד yH2AX&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-636</td><td>מדולל ל-1:500 במאגר צביעה</td></tr><tr><td>אנטי-פוספו-RPA32 (S4/S8) נוגדן</td><td>Bethyl Laboratories&nbsp;</td><td>A300-245A-M</td><td>מדולל ל-1:200 במאגר צביעה</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>BP1605 100</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה; סורוול סטריט 16R צנטריפוגה</td><td>תרמו מדעית&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75004240 מיקרוסקופ קונפוקלי, מערכת קונפוקלית Leica SP5 DMI4000</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>389584 צינורות חרוטיים, 15 מ"ל</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 FL מונה תאים אוטומטי (מכונת ספירת תאים)&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAF2000</tr><tr><td>שקופיות תא ספירת תאים של רוזנת</td><td>תרמו מדעי&nbsp;</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי Slip</td><td>LA צבעים</td><td></td><td>כל לק שקוף יספיק</td></tr><tr><td>Cultrex&nbsp; תמצית קרום מרתף RGF, סוג 2</td><td>&nbsp; מו"פ D מערכות&nbsp;</td><td>3533-010-02</td><td>יכול כנראה להשתמש במטריג'ל או מטריצת BME אחרת&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>&nbsp; R37606</td><td>NucBlue מגיב תא קבוע ReadyProbes, מדולל ב-1x PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>גליצין&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>NC0756056</tr><tr><td>JCountPro</td><td>JCountPro</td><td></td><td>לגישה לתוכנה, דוא"ל: jcountpro@gmail.com&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>07-000-243</td><td></td></tr><tr><td>לק&nbsp;</td><td>StatLab</td><td>SL102450</td><td></td></tr><tr><td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית&nbsp;</td><td>157-4</td><td>יש לדלל ל-4% PFA ב-PBS++ כדי לקבל 2% PFA</td></tr><tr><td>מאגר חדירות</td><td>תוצרת מעבדה</td><td></td><td>0.2% X-100 טריטון ב-PBS++&nbsp;</td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>ריינין</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה&nbsp;</td><td>ריינין&nbsp;</td><td></td><td></td>17014967</tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; P36930</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מכתים&nbsp;</td><td>מיוצר במעבדה</td><td></td><td>0.5% BSA, 0.15% גליצין, 0.1% X-100 טריטון ב-PBS++&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת שקופיות קאמרית Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>12-565-8</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אלדריך&nbsp;</td><td></td><td></td>11332481001</tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604013</td><td>אנזים רקומביננטי ללא מקור מן החי</td></tr><tr><td>X-RAD 320 Biological Irradiator&nbsp;</td><td>קרינת רנטגן מדויקת&nbsp;</td><td>X-RAD320</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי dna באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Immunofluorescence היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר כדי לדמיין אנטיגנים המטרה עם רגישות גבוהה וספציפיות, המאפשר זיהוי מדויק לוקליזציה של חלבונים, גליקנים, מולקולות קטנות. בעוד טכניקה זו מבוססת היטב בתרבית תאים דו-ממדית (2D), פחות ידוע על השימוש בה במודלים תלת-ממדיים (3D) של תאים. אורגנואידים של סרטן השחלות הם מודלים תלת-ממדיים של גידולים המשחזרים הטרוגניות של תאי גידול, מיקרו-סביבה של הגידול ואינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים. לפיכך, הם עדיפים על קווי תאים להערכת רגישות לתרופות וסמנים ביולוגיים פונקציונליים. לכן, היכולת לנצל אימונופלואורסנציה על אורגנואידים ראשוניים של סרטן השחלות מועילה ביותר בהבנת הביולוגיה של סרטן זה. המחקר הנוכחי מתאר את הטכניקה של אימונופלואורסנציה לזיהוי חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות (PDOs) שמקורם בחולה סרוס ברמה גבוהה. לאחר חשיפת PDOs לקרינה מייננת, immunofluorescence מבוצעת על אורגנואידים שלמים כדי להעריך חלבונים גרעיניים כמוקדים. התמונות נאספות באמצעות הדמיית z-stack במיקרוסקופ קונפוקלי ומנותחות באמצעות תוכנה אוטומטית לספירת מוקדים. השיטות המתוארות מאפשרות ניתוח של גיוס זמני ומיוחד של חלבונים לתיקון נזקי DNA וקולוקליזציה של חלבונים אלה עם סמנים של מחזור התא.

הפרוטוקול המוצג יכול להכתים, לדמיין ולכמת בהצלחה חלבונים לתיקון נזקי DNA גרעיניים באורגנואידים. טכניקה זו שימשה כדי להכתים ולהעריך PDOs הן לפני ואחרי הקרנה. PDOs נחשפו לקרינה של 10 Gy והוערכו עבור הסמנים הביולוגיים הבאים: ɣ-H2AX (איור 1), סמן של נזק לדנ"א; RAD51 (איור 2), סמן עבור HRR; 53BP1, סמן של NHEJ; RPA, סמן של עקה שכפול (איור 3); וג'מינין, סמן מחזור תא פאזה G2/S14. המינון של 10 Gy נבחר על סמך מחקר שפור...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להערכת חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. להלן שיטות ציפוי וצביעה מקיפות, כמו גם הליכי כימות מפורטים ואובייקטיביים.

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

חקר תגובת הנזק לדנ"א הכרחי להבנת הפתופיזיולוגיה של סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לסרטן השחלות בטיפול ממוקד חדש. טכניקה זו מאפשרת לדגימה להישאר שלמה ומאפשרת בדיקה של אנטיגנים במיקום הפעולה שלהם. פרוטוקול זה הוא מהיר וניתן להתאים אותו לכל אנטיגן מקובל immunofluorescence.שיטה זו נותנת תובנה לגבי סרטן השחלות ותהליכי תיקון נזקי DNA המעורבים בעמידות לכימותרפיה ומעכבי PARP. שיטות אלה יכולות להיות מיושמות בתחומי מחקר אחרים הכוללים שימוש בתרבויות תלת ממדיות ואורגנואידים. כדי להתחיל, שאפו את המדיה מהאורגנואידים המוקרנים והמוגרים מבלי להפריע למטריצה התלת-ממדית.לאחר מכן לשטוף עם 300 מיקרוליטר של PBS. תקן את האורגנואידים ב 300 מיקרוליטר של 2% paraformaldehyde במשך 10 דקות. לאחר התיקון, שטפו את האורגנואידים עם 300 מיקרוליטר של חיץ מכתים והניחו אותם על שייקר למשך חמש דקות.לאחר מכן לחדור את האורגנואיד על ידי הוספה עדינה של 300 מיקרוליטר של מאגר חדירה. לאחר 20 דקות של דגירה, להסיר את החיץ ולשטוף עם 300 מיקרוליטר של חיץ צביעה. הניחו את האורגנואידים על שייקר למשך חמש דקות.לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר של חיץ צביעה כדי לחסום את שלב החדירה. מניחים על השייקר למשך 30 דקות ושאפו את חיץ הכתמים בעזרת פיפטה. לאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים מדוללים בחיץ צביעה.דוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 ש

visualizing-dna-damage-repair-proteins-patient-derived-ovarian-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר פרוטוקול לזיהוי מוקדי תיקון DNA הנגרמים על ידי קרינה בשורות תאי סרטן המעי הגס באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. חלבוני תיקון דנ"א מופעלים באתר הנזק לדנ"א; לכן, אנו יכולים לזהות אותם באמצעות נוגדנים ספציפיים ולדמיין אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הערכת מוקדי נזק לדנ"א: לזיהוי מוקדי נזק לדנ"א הנגרמים מקרינה בקו התאים הסרטניים באמצעות צביעת אימונופלואורסנציה

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת האימונופלואורסנציה כדי לדמיין את הלוקליזציה של חלבוני תיקון הדנ"א γH2AX ו- 53BP1 באתרים של הפסקות DNA דו-גדילי בגרעין התא המוקרנ.

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ' ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) הם תרבית תלת ממדית (3D) שיכולה לחקות את סביבת הגידול במבחנה. בסרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה, PDOs מייצגים מודל לחקר סמנים ביולוגיים וטיפולים חדשים.

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות רמות הדנ"א החד-גדילי בתאים. שיטה יעילה וניתנת לשחזור זו יכולה לשמש לבחינת לחץ שכפול, תכונה נפוצה במספר סוגי סרטן השחלות. בנוסף, בדיקה זו תואמת צינור ניתוח אוטומטי, אשר מגביר עוד יותר את יעילותו.

כימות עקה שכפול בתאי סרטן השחלות באמצעות אימונופלואורסנציה של DNA חד-גדילי

אנו מציגים פרוטוקול שניתן להשתמש בו לביצוע בדיקות תרופתיות טיפוליות עם אורגנואידים מסרטן השחלות שמקורם במטופלות.

מודלים אורגנואידים שמקורם בחולות סרטן השחלות לבדיקת תרופות פרה-קליניות

פרוטוקול זה מציע מסגרת שיטתית להקמת אורגנואידים של סרטן השחלות משלבי מחלה שונים ונותן מענה לאתגרים של שונות ספציפית למטופלת כדי להגדיל את התשואה ולאפשר התרחבות חזקה לטווח ארוך ליישומים הבאים. הוא כולל שלבים מפורטים לעיבוד רקמות, זריעה, התאמת דרישות מדיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.

אסטרטגיה לביו-בנקאות של אורגנואידים של סרטן השחלות: טיפול בהטרוגניות הבין-אשפוזית על פני תת-סוגים היסטולוגיים ושלבי מחלה

שביט וזמינותו היא שיטה יעילה לאיתור נזק לדנ א כולל יחיד, כפול גדילי ה-DNA שובר. אנו מתארים שביט אלקליין ונייטרלי מבחני למדוד נזק לדנ א בתאים סרטניים כדי להעריך את השפעת טיפולי כימותרפיה.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

למד הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה. שיטה זו מספקת תובנות לגבי מנגנוני התנגדות לכימותרפיה ומאפשרת זיהוי ביומרקרים לטיפול ממוקד.

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

גלה סרטונים נוספים