דיאלקטרופורזה הנגרמת על ידי אור לאפיון ההתנהגות החשמלית של תאי גזע מזנכימליים אנושיים

פרוטוקול דיאלקטרופורזה המושרה באור או LiDEP מספק שיטה שלב אחר שלב לאפיון תאי גזע מזנכימליים אנושיים. שיטה זו יכולה לעזור לספק תשובות לגבי ההטרוגניות של דגימות תאי גזע. היתרון של LiDEP הוא היכולת לבצע שינויים בזמן אמת בתצורת האלקטרודות הווירטואליות בתגובה להטרוגניות תאי גזע, דבר שאינו אפשרי בשיטות DEP מסורתיות.

משתמש חדש בטכניקה זו עשוי להתקשות בעיבוי הקל של המקרן מספיק על התקן המיקרו פלואיד כדי ליצור את האלקטרודה הווירטואלית. אנו ממליצים להגדיר מחדש את ההתקנה עד שהיא תעבוד. מי שיעזור להדגים את ההליך יהיה צורי רשאד, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, הכינו את המיקרו-ערוץ על ידי ניקוב חורים בקוטר ארבעה מילימטרים על סרט דו-צדדי, במרחק של כחמישה עד שישה מילימטרים מקצה הממד הקצר יותר וממורכז בין הצדדים הארוכים יותר של הקלטת. בעזרת אזמל, חתכו שני קווים ישרים במרחק של שלושה מילימטרים זה מזה לאורך החורים, וודאו שיריעות המגן בשני פני הסרט מופעלות במהלך כל חיתוך המיקרו-ערוץ. סמן את המיקום כולו בטוש רחיץ וודא שהחורים שנקדחו מתיישרים עם החורים המנוקבים בסרט הדו-צדדי.

שני חורים אלה ישמשו כחורי הכניסה והיציאה של המכשיר המיקרופלואידי. קדח שני חורים בקוטר שלושה מילימטר במגלשת זכוכית ITO העליונה. לאחר מכן, בחלק העליון של זכוכית מצופה ITO קדוח, מניחים את הקצה הארוך של הסרט מיושר עם הקצה הארוך של הזכוכית.

הסר צד אחד של סרט המגן על הסרט הדו-צדדי. יישרו את חורי הסרט במגלשת זכוכית ITO העליונה ולחצו אותם בעדינות זה לזה תוך הסרת כיסי אוויר, במיוחד ליד המיקרו-ערוץ. הסר את סרט המגן השני מהסרט הדו-צדדי.

לחץ על שקופית זכוכית ITO מצופה מוליבדן וסיליקון אמורפית התואמת את קצה השקופית מוליכת התמונה הפוך לצד מרווח שני מילימטר עם קצה הסרט הדו-צדדי לכיוון מרכז שקופית זכוכית ITO העליונה. בדרך זו, הנגאובר קיים בין ITO לבין שקופית ITO מוליך תמונה. לחץ על משטח ישר כדי להבטיח הדבקה טובה וחתך את הסרט העודף בצדדים.

כדי לחבר את מחולל הפונקציות, החל סרט נחושת על קצוות שכבת זכוכית ITO ושכבת זכוכית ITO מצופה מוליך צילום. עטפו את הסרט בצד ה-ITO או חומר מוליך צילום מקצה הסרט הדו-צדדי עד כשלושה סנטימטרים על הצד הלא מצופה של מצע הזכוכית. כדי להבטיח ייצור מוצלח של המכשיר, השתמש במד גובה כדי לבדוק את קריאת ההתנגדות בין השקופיות המצופות של שני מצעי הזכוכית לבין סרט הנחושת שהוצמד לזכוכית.

הוסף 25 מיליליטר מים טהורים במיוחד לצינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 4.25 גרם סוכרוז ו 0.15 גרם גלוקוז. מערבבים היטב עד שמחצית הסוכרוז והגלוקוז מתמוססים ומפצה במים טהורים במיוחד עד לסימן 50 מיליליטר. לאחר מכן ערבבו במרץ את מאגר ה-DEP עד להמסה מלאה.

מניחים 20 מיליליטר של סוכרוז מוכן פתרון גלוקוז לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסף 0.1 גרם של אלבומין בסרום בקר, BSA, לתוך הצינור. מערבלים היטב עד שכל ה- BSA מתמוסס כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5% BSA במאגר DEP.

מניחים פי 10 לששת תאי הגזע המזנכימליים האנושיים או HMSCs או הכליה העוברית האנושית, HEK293 מרחפים במיליליטר אחד של מדיום גדילה לתוך צינור צנטריפוגה של 10 מיליליטר. צנטריפוגה, תאי HEK293 ב 201 G במשך חמש דקות ואת HMSCs ב 290 G במשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט.

01 והשהה מחדש בעדינות את התאים בתמיסת חיץ DEP של מיליליטר אחד עם 0.5% BSA. חזור על הצנטריפוגה פעמיים נוספות והשהה מחדש את התאים במאגר DEP עם 0.5% BSA. הכן את פריטי ההתקנה הניסיונית כגון מחשב נייד, מקרן, עדשת אובייקטיבי, מיקרוסקופ דיגיטלי ומחולל פונקציות לכימות התגובות הסלולריות ל- LiDEP.

מקם את עדשת האובייקט 10x, שבב LiDEP והמחזיק על גבי עדשת המקרן. השתמש במחשב הנייד כדי לעצב הקרנות אור כגון כוכב, יהלום, שלושה קווים ואליפסה וחבר את המחשב הנייד למקרן. חבר את שבב LiDEP למחולל הפונקציות כדי להפעיל את השדה החשמלי AC.

כדי לצפות בתאים החווים את כוח LiDEP, השתמש במיקרוסקופ דיגיטלי להדמיית הקלטת NVIDIA. לאחר השלמת ההתקנה, שטפו את המיקרו-ערוץ ב-70% אתנול ואז שטפו את תמיסת ה-BSA של 0.5% כדי להסיר את האתנול בתאים קודמים. חזור על השטיפה שלוש פעמים כדי להבטיח שטיפה מלאה מכיוון שתאים שנחשפו בעבר לשדה DEP יגיבו באופן שונה מתאים טריים ועלולים לשבש את איסוף הנתונים.

הסר את הפתרון 0.5% BSA עם פיפטה. לאחר מכן, הגדר את מחולל הפונקציה למתח ולתדר הרצויים. בזהירות להוסיף 70 מיקרוליטר של השעיית התא מוכן לתוך microchannel המכשיר באמצעות קצה פיפטה קטן יותר, להטות אותו מעט בחור לכיוון microchannel כדי למנוע שפיכה בשל דקיקות של microchannel.

נגב את פתרון הגישה באמצעות מגבוני נייר לשימוש חד-פעמי והשלך אותם לפסולת מסוכנת ביולוגית. לאחר מכן, הקרן את מעגלי הגיאומטריה האלקטרו הווירטואלית הרצויה, יהלומים, כוכבים או קווים מקבילים על שבב LiDEP. בתוכנת המיקרוסקופ הדיגיטלי, הגדר את אורך הווידאו לשלוש דקות.

כוונו טיימר מעבדה לשתי דקות ו-30 שניות. ברגע שהתאים נייחים במיקרו-ערוץ של שבב LiDEP, לחץ על התחל בתוכנת המיקרוסקופ הדיגיטלי כדי להתחיל בתהליך הקלטת הווידאו. לאחר 10 שניות, לחץ על לחצן ההפעלה של פלט ערוץ מחולל הפונקציה כדי להפעיל את השדה החשמלי AC ולחץ על התחל עבור הטיימר.

נטר את התנהגות DEP התא באמצעות המיקרוסקופ הדיגיטלי ומנע רעידות או תזוזה סביב המתקן. לאחר הפעלת הטיימר, לחץ על לחצן ההפעלה של פלט ערוץ מחולל הפונקציות, אשר מכבה את יציאת הערוץ והשדה החשמלי AC אינו מסופק עוד דרך האלקטרודות. עצור את הקלטת הווידאו לאחר שלוש דקות ושמור אותו לניתוח עתידי.

פיפטה את התאים מחוץ לקצה היציאה של שבב LiDEP על ידי דחיפה איטית של 60 מיקרוליטר של חיץ DEP עם 0.5% BSA לתוך המיקרו-ערוץ ובו זמנית איסוף החוצה את השקע. המשך עד שיהיו מעט תאים או ללא תאים במיקרו-ערוץ וחזור על ה- DEP עם כל התדרים כפי שהודגם. נקבעו תגובות ה-DEP מבחינת מהירות ה-HMSCs ואחוזי הכדאיות שלהם.

המדידות של תגובות DEP חיוביות במתח חמש, 10, amd 20 משיא לשיא או VPP הראו כי התאים נעו במהירות ממוצעת של 0.025, 0.036 ו- 0.051 מיקרומטר לשנייה בהתאמה. ממצאי הכדאיות של HMSCs לאחר שהתנסו בכוח DEP הראו כי המתחים הגבוהים יותר הביאו בדרך כלל לכדאיות תאים נמוכה יותר, כאשר 57% מהתאים היו בני קיימא ב -20 VPP. אלקטרודות בצבעי לבן, צהוב, אדום וכחול נבחרו למחקר זה, אך ההארה דרך שבב העומק LiDEP הושפעה מהשכבה המוליכה של התמונה, שהייתה בעלת צבע כתום אדום.

לפיכך, האלקטרודה הלבנה המוקרנת נראתה צהובה עם פנים לבן, האלקטרודה האדומה נראתה כתומה עם קו מתאר אדום, והאלקטרודה הכחולה נראתה ירוקה בהירה. תופעה זו מצביעה על כך שלצהוב ולבן היה שדה DEP החזק ביותר בעוד שכחול ואדום היו חלשים יותר. תגובות ה-DEP של HMCs נמדדו באמצעות LiDEP בשלושה אנלייזרים לעומק של 10 VPP.

עם LiDEP, חלה דעיכה בתגובת DEP החיובית מ-30 קילוהרץ ל-20 מגה-הרץ. משלושת המנתחים, התאים גדלו ב- DEP החיובי מ -37 ל -255 קילוהרץ וירדו ב- DEP חיובי מ -1, 772 קילוהרץ ל -20 מגה-הרץ. שני מרכיבים חשובים בשיטה זו הם מקור אור חזק וחיבור חשמלי מוצק כדי להבטיח את ייצור השדה החשמלי ומניפולציה של התא.

ראינו תאים מסתובבים בתגובה לאלקטרודות וירטואליות. לפיכך, סיבוב אלקטרו הוא שיטת ניתוח תאים נוספת שניתן לבצע. סיבוב אלקטרו יספק מידע על הטרוגניות HMSCs ותת-אוכלוסיות נדירות.