ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

פרוטוקול זה מאפשר לזהות שותפים קושרי חלבונים של רצף RNA ידוע על ידי משיכתם מטה מתמצית תאית באמצעות אוליגונוקלאוטידים של RNA ביוטינילציה. בהשוואה לשיטות הדורשות דטרגנטים או טמפרטורות גבוהות כדי לנתק את החלבונים מהרנ"א, פרוטוקולים אלה משתמשים במקום זאת בתנאים קלים מאוד המאפשרים גם לשמר קומפלקסים חלבוניים פוטנציאליים. מי שידגים את ההליך יהיה יעקב רופרט, דוקטורנט בהנחייתי.

התחל את קציר החלבון הכולל על ידי הסרת המדיום מהבארות של צלחת התא HEK 293T, ושטוף את הבארות של שש צלחות באר עם מיליליטר אחד של PBS. השליכו PBS והעבירו את הצלחות לקרח, לפני הוספת 200 מיקרוליטר חיץ ליזה לכל באר. נתקו ושברו את התאים באמצעות מגרד תאים לפני העברת תמצית התא שמקורה בשתי בארות לאותו צינור 1.5 מיליליטר.

לאחר 30 דקות של דגירה על קרח וצנטריפוגה, מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מקורר מראש. לאחר מכן, לחשב את נפח תמצית חלבון המתאים 1.5 מיליגרם של חלבונים. לאחר מכן הביאו את כל הדגימות לנפח סופי של 600 מיקרוליטר באמצעות חיץ ליזיס.

יש לשמור את הדגימות על קרח עד לשימוש. כדי להכין את החרוזים, מערבבים אותם במאגר האחסון על ידי הזזת הצינור. לאחר חישוב 100 מיקרוליטר של מדיום slurry לכל דגימה, מקם את הנפח המחושב של slurry לתוך מדף מגנטי.

כדי לשטוף את החרוזים, הסר את תמיסת האחסון, ושטוף את החרוזים על ידי הוספת מיליליטר אחד של חיץ ליזיס והיפוכו באופן ידני. לאחר מכן הסירו את המאגר באמצעות המדף המגנטי וחזרו על שלב הכביסה. לחרוזים, הוסיפו נפח של חיץ ליזיס השווה לנפח הראשוני של מדיום הסלארי, וערבבו אותו על ידי הזזת הצינור לפני חלוקת התווך באופן אחיד לצינורות של 1.5 מיליליטר כמו הדגימות.

לחסימת חרוזים, הסירו את החיץ באמצעות המדף המגנטי והוסיפו 600 מיקרוליטר של 0.25 מיליגרם למיליליטר של תמיסת שמרים TRNA שהוכנה במאגר ליזיס. דוגרים עליו במשך שעה בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב. הסר את תמיסת TRNA באמצעות המדף המגנטי לפני הוספת 600 מיקרוליטר של חיץ ליזיס, ושטוף אותו על ידי ערבוב ידני.

חזרו על שלב הכביסה והשליכו את החוצץ. עבור כל צינור המכיל את 100 המיקרוליטרים הראשונים של מדיום slurry, להכין 200 מיקרוגרם של אוליגונוקלאוטיד RNA ב 600 מיקרוליטר של חיץ ליזיס. מוסיפים את האוליגו לחרוזים ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר תוך כדי סיבוב.

מוציאים את התמיסה מהחרוזים ושוטפים פעמיים עם 600 מיקרוליטר של חיץ ליזיס על ידי סיבוב הצינורות במשך חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. מחק את המאגר. עבור קשירת חלבון על חרוזים, להפריד 5% או 30 מיקרוליטר של נפח מתמיסת חלבון 600 מיקרוליטר ולשמור אותו כקלט או IN לניתוח נוסף.

מוסיפים את תערובת החלבונים הנותרת לכל שפופרת של חרוזים עמוסים, ודגרים בסיבובים איטיים במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. הסר את מקטע החלבון הלא קשור מהחרוזים באמצעות המדף המגנטי. חסוך 5% או 30 מיקרוליטר מנפחו ותייג אותו זורם דרכו או FT. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ כביסה 1 לחרוזים, ומסובבים אותו במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

יש להשליך את המאגר ולחזור על שטיפה זו פעם אחת. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ כביסה 2 לחרוזים. ואחרי שדגרו בארבע מעלות צלזיוס על מסובב במשך חמש דקות, השליכו את הסופרנטנט.

להדבקת הקלסרים הספציפיים, הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ אלוציה 1 לחרוזים. לאחר ערבוב ידני על ידי הבהוב, לדגור אותו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מכניסים את הצינורות למיקסר תרמי ומנערים נמרצות במשך חמש דקות בחום של 95 מעלות.

לאחר מכן הניחו את הצינור במדף המגנטי ואספו את החלק המדולל לתוך צינור נקי. לאחר שתסיים, סובב במהירות את החרוזים עם צנטריפוגת ספסל כדי למקסם את ההתאוששות של הפולט. וחסוך 5% או חמישה מיקרוליטרים מנפח eluate או EL הכולל לניתוחים נוספים.

החלבונים המדוללים זוהו על ידי ספקטרומטריית מסות. שרטוט החלבונים המועשרים משמעותית בחלקת הר געש גילה כי תכולת החלבונים הכוללת והחלבונים המועשרים שנשללו מהרנ"א הייתה גבוהה משמעותית מהרנ"א, דבר המצביע על כך שרנ"א יכול ליצור מספר גבוה יותר של אינטראקציות ספציפיות. כדוגמאות להסכמה בין התוצאות הצפויות והמתקבלות, ציוני האינטראקציה עבור פלוס RNA ומינוס RNA עם חלבונים מפרוטאום אנושי הראו כי HNRNPH3 נחזה להיקשר פלוס RNA באופן סלקטיבי, ו- PCBP2 לקיים אינטראקציה ספציפית עם RNA.

בנוסף, החלבון RBM41 נחזה להיות מופקר עבור שני אוליגונוקלאוטידים RNA. ניתוח ספקטרוסקופיית המסה של דגימות בדיקת משיכת חלבונים אישר את נוכחותם של HNRNPH3 ב- RNA ו- PCBP2 ב- RNA מינוס. בעוד RBM41 נמצא אינטראקציה עם שניהם.

כתם מערבי שימש כדי לזהות את נוכחותו של TDP-43 בתוצאות ובשלבי אופטימיזציה של פרוטוקולים. ב- RNA, TDP-43 נצפה בדגימת הקלט וב- eluate, מה שמצביע על נוכחותו מההתחלה. TDP-43 נשמר על ידי RNA במהלך שלבי השטיפה ונמהל בסוף עם חיץ מלח גבוה.

על ידי מיפוי אינטראקציות RNA חלבוניות, שיטה זו יכולה לחשוף רשתות מקרומולקולריות מאחורי מסלולים פיזיולוגיים רבים. לדוגמה, ויסות שעתוק או מנגנונים פתולוגיים כולל סרטן וניוון עצבי.