פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

פרוטוקול זה הוא הראשון המתאר כיצד לעבד ולהעריך את גודל העכבר עבור פתולוגיות RP באמצעות אלקטרונים העברת אור ומיקרוסקופ קונפוקלי. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הכללת הערכות כמותיות של פתולוגיות RP, תוך שימוש בשלוש טכניקות הדמיה אלה להשוואות סטטיסטיות. הטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה עשויות גם לעזור להרחיב את הידע שלנו על מסלולים מולקולריים החשובים לבריאות RPE.

אנשים שלא ניתחו בעבר את גודל העכבר עשויים להיאבק עם פרוטוקול זה. אנו מציעים לאנשים אלה להתאמן עם כמה עכברים כדי לשלוט בטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה. כדי להתחיל, להכין מערכת זילוח הזנת כוח הכבידה על כרית סופגת עבור זילוח הלב במכסה אדים.

יוצקים 40 מיליליטר של חיץ קבוע מוכן טרי לתוך חבית מזרק של מערכת זילוח. סובב את השסתום במקביל לקו הצינור כדי לאפשר למאגר לזרום דרך קו הצינור. שוטפים את הקו עד שכל בועות האוויר מוסרות מהקו.

לאחר מכן סובב את השסתום בניצב לקו הצינור כדי לעצור את החיץ מלזרום לקו הצינור. כדי לבצע זילוח לב, להעביר את העכבר המתת חסד למגש רדוד ליד מערכת זילוח. כשהבטן פונה כלפי מעלה.

רססו את הבטן באתנול 70%, ולאחר מכן צרו חתך נחות של חמישה סנטימטרים באמצעות מספריים ומלקחיים מעוקלים דרך העור ודופן הבטן בצד שמאל של העכבר מתחת לכלוב הצלעות. המשך לבצע חתך מדיאלי של שלושה סנטימטרים דרך העור ודופן הבטן בחלק העליון של החתך הנחות. בצע עוד חתך נחות של חמישה סנטימטרים בקצה החיתוך המדיאלי דרך העור ודופן הבטן בצד הימני הרחוק ביותר של העכבר מתחת לכלוב הצלעות.

בצע חתך מדיאלי נוסף של שלושה סנטימטרים כדי להסיר את דש עור הבטן עם מלקחיים מעוקלים. לאחר מכן, לחתוך דרך הסרעפת ואת עצם החזה כדי לחשוף את הלב. הכנס את מחט המד לחדר השמאלי של הלב וסובב את המסתם.

חותכים את האטריום הימני עם מספריים מעוקלים כדי לאפשר לדם וקיבוע לצאת מהלב. אפשרו ל-10 מיליליטר של חיץ מקבע לחורר את העכבר למשך דקה או שתיים, או עד שהכבד הופך חיוור בצבעו ולא זורם דם מהאטריום הימני. לאחר השלמת הזילוח, סובב את השסתום בניצב לקו הצינור כדי לעצור את זרימת החיץ.

כדי לגרעין את העיניים, הסר את העכבר מהמגש הרדוד והנח אותו על התחתונים הסופגים במכסה אדים. לאחר מכן כוונו את ראש העכבר כאשר עין שמאל פונה לנסיין והעין הימנית מחוץ לטווח הראייה. הוסף הערות לצד העליון של העין עם צבע סימון רקמות.

דחפו בעדינות כלפי מטה סביב ארובת העין עם האגודל והאצבע המורה לבליטת העין מארובת העין. לאחר מכן באמצעות מספריים מעוקלים, להחזיק את העין עם הלהב בזווית של 30 מעלות מארובת העין לחתוך סביב העין. הסר את גלגל העין מהראש בעזרת מלקחיים מעוקלים והנח אותו על כרית תחתונה סופגת.

ניקבו את הקרנית עם להב אזמל מספר 11 והכניסו את העין עם מלקחיים מעוקלים לתוך צינור מיקרו של שני מיליליטר המכיל שני מיליליטר של חיץ קיבוע. לאחר ניקוי שתי העיניים, יש לדגור עליהן בחיץ מקובע למשך הלילה על שייקר בחדר של ארבע מעלות במהירות של 75 סל"ד. למחרת, החליפו את החיץ המקובע בשני מיליליטר PBS ודגרו במשך 10 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר וב-75 סל"ד.

לאחר מכן, כדי ליצור מקטעים אחוריים, הניחו את העין בתוך צלחת פטרי מלאה PBS תחת מיקרוסקופ מנתח. הרימו בעדינות את כל השומן והשריר מגלגל העין בעזרת מלקחיים עדינים. חותכים בזהירות את השומן והשריר עם מספריים מנתחים מיקרו בכיוון מקביל לגלגל העין עד שגלגל העין מקבל צבע כחלחל-שחור אחיד מניחים מלקחיים עדינים באתר ניקוב הקרנית וחותכים סביב היקף הקרנית החל מאתר הניקוב עם מספריים לניתוח מיקרו כדי להסיר את הקרנית והקשתית מגלגל העין.

לאחר מכן בעזרת מלקחיים עדינים, הסר בעדינות את העדשה מגלגל העין כדי להניב את המקטע האחורי. הכניסו את המקטע האחורי לצינור המכיל שני מיליליטר PBS, ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס במקרר עד לשימוש. מעבירים את העין לצלחת פטרי המכילה PBS ומסירים את הקרנית והקשתית כפי שהודגם בה.

משוך את העדשה עם מלקחיים עדינים. לאחר מכן באמצעות שני מלקחיים עדינים, להפריד בעדינות את הרשתית העצבית מן המקטע האחורי. חותכים בזהירות את הרשתית העצבית בראש עצב הראייה להסרה מכוס העין האחורית.

הכניסו את העין למיקרו צינורית של שני מיליליטר המכילה חמישה מיקרוליטרים של PBS. כדי לתקן כוסות עיניים אחוריות, להוסיף 500 מיקרוליטר מתנול לרקמה ולדגור על שייקר ב 75 סל"ד, במשך חמש דקות. חזור על קיבוע מתנול שלוש פעמים עם הדגירה הסופית במשך שעתיים.

לאחר הקיבוע, לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם PBS, לפני שתמשיך צביעה immunofluorescence ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. עכברי TMEM 135 TG בני ארבעה חודשים, הראו ירידה משמעותית בעובי אפיתל פיגמנטלי ברשתית או RPE במרחק של 600 ו-900 מיקרומטר מעצבים הראייה, יחסית לעכברי בר תואמי גיל. חושבו תקריות של פתולוגיות RPE כולל microvascuolization, macrovacuolization והגירה של עכברי WT ו- TMEM 135 TG בני 325 יום.

התדירות הממוצעת של מיקרו-ווקואוליזציה של RPE הייתה נמוכה יותר בסוג הבר בהשוואה לעכברי TMEM 135 TG. לא זוהו מקרווקוליזציה של RPE ונדידה בסוג בר בהשוואה לערכים הממוצעים שנצפו בעכברי TMEM 135 TG. במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת נצפו משקעים למינריים בסיסיים ברשתית בת 24 חודשים שנעדרו ברשתית בת חודשיים.

ניתוח התדרים המצטברים של גובה המרבצים הלמינריים הבסיסיים, הצביע על תזוזה ימינה של הקו עבור בן 24 חודשים, בהשוואה לגיל חודשיים, מה שמדגים עלייה בפיקדונות בעכברים בני 24 חודשים. תצפית זו נתמכה על ידי גבהים ממוצעים גדולים יותר ברשתית בת 24 חודשים. RPE בעכברי TMEM 135 TG בני ארבעה חודשים היה דיסמורפי.

ה-RPE ברשתיות TMEM 135 TG גדולות יותר וצפופות פחות מרשתיות בר תואמות גיל. כמו כן, נצפו יותר תאי RPE מרובי גרעינים ברשתית TG, בהשוואה לבקרות. בעקבות פרוטוקול זה, חוקרים יכולים להעריך מסלולים ספציפיים באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית בעכברים, מה שיכול לתרום להבנתנו כיצד פתולוגיות RP אלה מתפתחות בעכברים.

פרוטוקול זה יסייע לתקנן פנוטיפ RP בעכברים, אשר יתרגם ממצאים ממחקרי עכברים למודלים אחרים של AMD ויסייע בהבנתנו את הפתוביולוגיה של AMD.