הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

תעלות יונים אינן סטטיות בקרומים ביולוגיים. כאן אנו מציגים גישה אופטית של מולקולה בודדת לפענוח הקשר בין דיפוזיית הממברנה הצידית לבין תפקוד תעלת היונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות הוא שאין צורך בתיוג פלואורסצנטי של חלבונים העלולים להפריע לתנועתם הצידית ולתפקודם.

השיטה יכולה להיות מיושמת על כל תעלת חלבון ממברנה שבה דיפוזיה חופשית או מוגבלת חשובה לארגון ולתפקוד. כדי להתחיל, להעביר 380 מיקרוליטר של תמיסת מלאי DPhPC לתוך בקבוקון זכוכית, ולכסות את תמיסת מלאי השומנים עם גז ארגון או חנקן כדי למנוע חמצון השומנים. השתמשו בזרימת הגז הנמוכה ביותר האפשרית כדי למנוע אידוי של הממס האורגני שבו מומסים השומנים, או התזת תרסיסי הממס מהבקבוקון.

יבשו את דגימת השומנים תחת זרם של חנקן והסירו את הממס האורגני שנותר מדגימת השומנים תחת ואקום באמצעות משאבת ואקום נטולת שמן למשך הלילה. ממיסים את שכבת השומנים בתמיסת שמן סיליקון הקסדקני על ידי הוספת נפחים שווים של שמן הקסדקן וסיליקון באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד לריכוז שומנים סופי של 9.5 מיליגרם למיליליטר. הכניסו חלק מכיסויי הזכוכית למחזיק כיסויי נירוסטה ונקו אותם בכוס זכוכית למשך כ-10 דקות עם אצטון בחומר ניקוי אולטרסוני.

שטפו את הכיסויים במים כפולים שעברו דה-יוניזציה וייבשו אותם תחת זרם של חנקן. יתר על כן, לנקות hydrophylize כיסוי להחליק ב פלזמה שואב עם חמצן במשך חמש דקות. הרכיבו כיסוי שטופל בפלזמה על מעיל מסתובב וציפו את הכיסוי בסרט עבה תת-מיקרומטר של אגרוז על ידי הוספה איטית של 140 מיקרוליטר של אגרוז נמס נמוך 0.75% מחומם עם פיפטה של 200 מיקרוליטר ב -3, 000 סל"ד למשך 30 שניות.

חברו מיד את הכיסוי המצופה בספין עם השכבה הדקה של הידרוג'ל האגרוז לחלק התחתון של תא PMMA. ודא כי הידרוג'ל agarose מצביע כלפי מעלה. קבע את קצוות הכיסוי למכשיר PMMA במיקרו-מכונה באמצעות סרט הדבקה שקוף, והנח את המכשיר על פלטה חמה המחוממת ל-35 מעלות צלזיוס.

בזהירות לשפוך 200 מיקרוליטר של 2.5% תמיסת agarose לתוך הכניסה של החדר מבלי ליצור בועות אוויר. כסו מיד את הבארות של תא PMMA בכ -60 מיקרוליטר של תמיסת שמן השומנים כדי ליזום היווצרות חד-שכבתית שומנים בממשק שמן האגרוז כדי למנוע התייבשות של האגרוז המצופה ספין בבארות של תא PMMA. הניחו את המכשיר על פלטה חמה בחום של 35 מעלות למשך כשעתיים.

הניחו כ-20 מיקרוליטר של תמיסת שמן סיליקון הקסדקן ליפידי בכל אחת מכמה בארות מיקרו-מפוברקות בתא דגירה טיפתי. הכינו מחט זכוכית מיקרוקפילרית בקוטר פתיחת קצה של כ-20 מיקרומטר באמצעות מושך מיקרופיפטה אנכי או אופקי. מלאו את המחט בכחמישה מיקרוליטרים של תמיסת הזרקה מימית המכילה HEPES 8.8 מילימולרי, שבעה מיקרומולרים של צבע פלואורסצנטי, Fluo-8, 400 מיקרומולרי EDTA, 1.32 אשלגן כלורי מולארי וקומפלקס ליבת TOM 30 ננו-מולרית או לחילופין 20 ננו-מולארי OMPF.

הרכיבו את המחט עם תמיסת ההזרקה המימית על ננו-מזרק מונע פיאזו והזריקו 100 עד 200 ננוליטר של טיפות מימיות לתוך הבארות בתא הדגירה של הטיפות המלא בתמיסת שמן סיליקון הקסדקני שומנים באמצעות ננו-מזרק. אפשר היווצרות חד-שכבה ליפידית בממשק שמן הטיפות למשך כשעתיים על ידי שמירה על תאי הדגירה PMMA וטיפות על פלטה חמה מחוממת ל-35 מעלות צלזיוס. העבר ידנית טיפות מימיות בודדות מהבארות של תא הדגירה של הטיפות לתוך הבארות של תא PMMA באמצעות פיפטה מיקרוליטר חד-ערוצית עם קצה פוליפרופילן חד פעמי של 10 מיקרוליטר.

אפשרו לטיפות לשקוע על החד-שכבות השומניות בממשקי שמן ההידרוג'ל וליצור דו-שכבה ליפידית בין הטיפות לבין האגרוז הידרוג'ל. הרכיבו את תא ה-PMMA עם הממברנות הדו-שכבתיות של ממשק הטיפות או DIB על מחזיק הדגימה של מיקרוסקופ אור הפוך, והעריכו את היווצרות הממברנה באמצעות יעד ניגודיות אפנון הופמן 10x. אם נוצרו ממברנות DIB, הרכיבו את תא ה-PMMA על מחזיק הדגימה של מיקרוסקופ TIRF המצויד במקור אור קונבנציונלי להארה אפיפלואורסצנטית, לייזר 488 ננומטר ומצלמת CCD עם תאורה אחורית המכפילה אלקטרונים כדי להשיג גודל פיקסל של כ-0.16 מיקרומטר.

מקד את הקצה של קרום DIB עם יעד הגדלה של פי 10 תחת תאורה אפיפלואורסצנטית עם מקור אור בעוצמה גבוהה באמצעות ערכת מסנן GFP. מיקוד עדין באותו קצה של קרום DIB בהגדלה גבוהה עם 100x NA 1.49 שמן אפוכרומטי TIRF מטרה, שוב תחת תאורה אפיפלואורסצנטית עם מקור אור בעוצמה גבוהה באמצעות סט מסנן GFP. שנה את הגדרת המסנן מ- GFP לערכת המסננים TIRF בעלת ארבעת תחומי הפסים, הפעל את הלייזר בגודל 488 ננומטר והגדר את עוצמת הלייזר על עדשת המטרה.

כדי להמחיש ערוצי יונים בודדים, כוונן את זווית ה-TIRF ואת הרווח של מצלמת EM CCD כך שתעלות היונים הפתוחות בקרום DIB יופיעו ככתמים פלואורסצנטיים בעלי ניגודיות גבוהה על רקע כהה, ויחס האות לרקע יגיע למקסימום. יש לוודא שהכתמים המתאימים לשטף יוני הסידן דרך תעלות יונים בודדות נשארים בפוקוס ובעלי צורה עגולה בעוצמה גבוהה במרכז ויורדת בהדרגה לכיוון הפריפריה. בדקו שהכתמים הפלואורסצנטיים נמצאים בפוקוס כדי לוודא שתעלות היונים נוצרו מחדש בקרומי DIB והן נעות לרוחב במישור הממברנה.

לבסוף, להקליט סדרה של תמונות ממברנה המאפשר מעקב נאות של המיקום וניטור של המצב הפתוח-סגור של תעלות יונים בודדות. כדי לקבוע את סוג הניידות הרוחבית ואת מצב פעילות הערוץ, לרכוש מסלולים ארוכים מספיק מדגם היטב. מבנה Cryo EM של Neurospora crassa TOM-CC מוצג כאן.

מיטוכונדריה מכתם N.crassa המכיל TOM 22 עם תג 6-His היו מסיסים ב-DDM ונחשפו לכרומטוגרפיית זיקה של ניקל NTA וכרומטוגרפיית החלפת אניון. SDS-PAGE של מבנה גבישי TOM-CC מבודד ו-SDS-PAGE של E.coli OMPF מטוהר המשמש להשוואה מוצגים כאן. עקבות המשרעת הפלואורסצנטית במסלול המתאים של TOM-CC מצביעות על כך שפעילות הערוץ הפתוח-סגור של TOM-CC מתואמת עם ניידות הממברנה הצידית של המתחם.

מעקב המשרעת מציג שלושה מצבי חדירות: מצב פתוח לחלוטין המתאים לערוצים נעים, מצב חדירות ביניים ומצב ערוץ סגור המתאים לערוצים שאינם נעים. TOM-CC במצב הביניים מתנדנד סביב מיקומו הממוצע בכפלוס/מינוס 60 ננומטר. עקבות המשרעת הפלואורסצנטית במסלול המתאים של OMPF מוצגות כאן.

OMPF חושף רק רמת עוצמה אחת בהשוואה ל- TOM-CC, ללא קשר אם הוא בתנועה או לכוד. קטעי המסלול המתאימים לפרקי הזמן של מולקולות לכודות מסומנים באפור. דבר אחד חשוב לשים לב אליו הוא ששיטה זו מנתחת חלבוני ממברנה בודדים בסביבת ממברנה שלמה.

הדינמיקה של חלבוני הממברנה תישאר אופק למחקרים מדעיים בעתיד הנראה לעין. אנו מצפים שהשיטה שלנו תתרום לתחום זה באופן משמעותי.