ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר של סאו פאולו [מספרי מענק FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); ועל ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV).

אין להצהיר על ניגוד עניינים.

לפיתוח טכניקת מהדק המדבקים של התא כולו הייתה השפעה משמעותית על הקהילה המדעית, והיא נחשבה לבעלת חשיבות עליונה לפיתוח המחקר המדעי ואפשרה מספר תגליות. השפעתה על המדע הספיקה כדי להגיע לשיאה בפרס נובל לרפואה בשנת 1991, שכן תגלית זו פתחה את הדלת להבנה טובה יותר של האופן שבו תעלות יונים מתפקדות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כמו גם זיהוי מטרות פוטנציאליות לחומרים טיפוליים 11,39,40,41 . בתחום הרפואה, א...

הודג'קין והאקסלי ערכו את התיעוד התוך-תאי הראשון של פוטנציאל פעולה שתואר במספר מחקרים מדעיים. הקלטה זו בוצעה על אקסון הדיונון, בעל קוטר גדול (~500 מיקרומטר), המאפשר למקם מיקרואלקטרודה בתוך האקסון. עבודה זו סיפקה אפשרויות גדולות למחקר מדעי, שמאוחר יותר הגיע לשיאו ביצירת מצב מהדק מתח, ששימש לחקר הבסיס היוני של יצירת פוטנציאל פעולה 1,2,3,4,5,6,7,8. במהלך השנים, הטכניקה שופרה, והיא הפכה להיות מיושמת באופן נרחב במחקר מדעי 6,9. המצאת טכניקת מהדק הטלאים, שהתרחשה בסוף שנות השבעים באמצעות מחקרים שיזמו ארווין נהר וברט סאקמן, אפשרה לחוקרים להקליט תעלות יונים בודדות ופוטנציאלים או זרמים של קרום תוך תאי כמעט בכל סוג של תא באמצעות אלקטרודה אחת בלבד 9,10,11,12. הקלטות מהדק טלאי יכולות להתבצע על מגוון תכשירי רקמות, כגון תאים בתרבית או פרוסות רקמה, במצב מהדק מתח (החזקת קרום התא במתח מוגדר המאפשר הקלטה, למשל, של זרמים תלויי מתח וזרמים סינפטיים) או במצב מהדק זרם (המאפשר הקלטה, למשל, של שינויים בפוטנציאל קרום המנוחה המושרה על ידי זרמי יונים, פוטנציאלי פעולה, ותדירות פוטנציאל פוסט-סינפטי).
השימוש בטכניקת מהדק הטלאי איפשר מספר תגליות בולטות. ואכן, הממצאים הראשוניים על התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעינים הפריוונטריקולריים האנטרו-ונטרליים (AVPV/PeNKisspeptin), הידוע גם בשם האזור הפרי-חדרי הרוסטרלי של החדר השלישי (RP3V), וגרעין הארקואט של ההיפותלמוס (ARHkisspeptin)13,14,15 הם בעלי עניין מיוחד. בשנת 2010, Ducret et al. ביצעו את ההקלטות הראשונות של נוירונים AVPV/PeNKisspeptinבעכברים באמצעות כלי אלקטרופיזיולוגי אחר, טכניקת מהדק טלאי תאים רופפים. מחקרים אלה סיפקו תיאור חשמלי של נוירוניקיספטין AVPV/PeN והראו כי דפוסי הירי שלהם תלויים במחזור הייחום16. בשנת 2011, Qiu et al. השתמשו בטכניקת מהדק טלאי התא כולו כדי להדגים כי נוירוניקיספפטין ARH מבטאים זרמי קוצב לב אנדוגניים17. לאחר מכן, גוטש ועמיתיו הראו כי נוירוני קיספפטין מפגינים פעילות ספונטנית ומבטאים הן זרמי סידן מסוג H (קוצב לב) והן זרמי סידן מסוג T, דבר המצביע על כך שנוירוניקיספפטין ARH חולקים תכונות אלקטרופיזיולוגיות עם נוירוני קוצב אחרים של מערכת העצבים המרכזית18. בנוסף, הוכח כי נוירוניקיספפטין ARH מפגינים קצבי ירי דימורפיים מינית וכי נוירוניקיספטין AVPV/PeN מפגינים פוטנציאל קרום מנוחה בימודאלי (RMP) המושפע מתעלות אשלגן רגישות ל-ATP (KATP)19,20. יתר על כן, נקבע כי סטרואידים גונדל משפיעים באופן חיובי על הפעילות החשמלית הספונטנית של נוירוני קיספפטין בעכברים 19,20,21. העבודות הראשונות החוקרות את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירוני קיספפטין מוזכרות 16,17,18,19,20. מאז, מחקרים רבים השתמשו בטכניקת מהדק טלאי של כל התא כדי להדגים אילו גורמים/נוירומודולטורים מספיקים כדי לווסת את הפעילות החשמלית של נוירוני קיספפטין (איור 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
בהתחשב בחשיבותה של טכניקה זו לחקר תאי עצב הדרושים להתרבות, בין סוגי תאים אחרים שאינם מכוסים כאן, מאמר זה מתאר את השלבים הבסיסיים לפיתוח טכניקת מהדק טלאי התא כולו, כגון הכנת התמיסות, ניתוח וחיתוך המוח, וביצוע אטימת קרום התא להקלטות. יתר על כן, נדונים נושאים רלוונטיים לגבי הטכניקה, כגון יתרונותיה, מגבלות טכניות ומשתנים חשובים שיש לשלוט בהם לביצוע ניסויי אופטימלי.

<table><tbody><tr><td><חזק>תרכובות עבור aCSF, תמיסות פנימיות וחיתוך</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונות</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich/שונות</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונות</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich/שונות</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich/שונים</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich/שונים</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma Aldrich/שונים</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich/שונים</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/שונים</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>סיגמא אולדריץ'/230391</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא אולדריץ'/שונות</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ' / שונים</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO<תת>3< / תת></td><td>סיגמא אולדריץ' / שונים</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>חומצה חנקתית</td><td>סיגמא אולדריץ' / שונים</td><td>225711</td><td>זהירות</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ' / שונים</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד< / חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחן אוויר</td><td>TMC</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>מגבר</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>מחשב</td><td>מגוון-DIGIDATA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1440 מערכת רכישת נתונים ברעש נמוך</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>DD1440</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית דיגיטלית</td><td>Ismatec</td><td>ISM833C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>כלוב פאראדיי</td><td>TMC</td><td>81-333-03</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת הדמיה</td><td>Leica</td><td>DFC 365 FX</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>סאטר מכשירים</td><td>Roe-200</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>DM6000 FS</td><td></td></tr><tr><td>אוסטאוטום</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/שונים</td><td>128</td><td></td></tr><tr><td>תא התאוששות</td><td>וורנר אינסטרומנטס / מכשירי הרווארד</td><td></td> <td>- ניתן לייצר בתוך</td></tr><tr><td>הבית תא הקלטה</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>640277</td><td></td></tr><tr><td>מרית</td><td>פישר סיינטיפיק / שונים</td><td>FISH-14-375-10; דג-21-401-20</td><td></td></tr><tr><td>ויברטום&nbsp;</td><td>אמבט מים Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק / מגוון</td><td>איזוטמפ</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תוכנה ומערכות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 10 תוכנה</td><td>התקנים מולקולריים-קומנדר</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>תוכנה LAS X מערכת שדה רחב</td><td>Leica-Image</td><td></td> <td>קליטה וניתוח</td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>Commander תוכנה</td></tr><tr><td>PCLAMP 10 תוכנה עבור WINDOWS</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Pclamp 10 אלקטרודה סטנדרטית</td><td></td></tr><tr><td><חזקה>כלים</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl, גלולה, 1.0 מ"מ</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>64-1309</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים המוסטטיים מעוקלים</td><td></td> דבק ציאנואקרילט <td>שונים-LOCTITE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>/שונים</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לעריפת ראשים</td><td></td> <td>שונים-נייר</td><td></td></tr> <tr><td>סינון</td><td></td> <td>שונים-נימי</td><td></td></tr> <tr><td>זכוכית (מיקרופיפטה)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/שונים</td><td>65-66</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה מזכוכית פסטר&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'/מגוון</td><td>CLS7095B9-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td></td> <td>שונות-צינורות</td><td></td></tr> <tr><td>פוליאתילן&nbsp;</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>64-0756</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח לדיסקציה של המוח</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-1</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח לוויברטום</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-9</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/different</td><td>71-72, 48,49; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פטמת סיליקון</td><td>מגוונת-עוגן</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>פרוסה&nbsp;</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>64-0246</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מזרק</td><td>Merck Millipore Ltda</td><td>SLGVR13SL</td><td>Millex-GV 0.22 &mu; מ</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/different</td><td>131, 1518</td><td></td></tr></tbody></table>

נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

קיספפטינים חיוניים להבשלת ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדל (HPG) ולפוריות. נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעין הפריוונטריקולרי האנטרו-ונטרלי ובגרעין הפריוונטריקולרי הרוסטרלי, כמו גם בגרעין ארקואט של ההיפותלמוס, מקרינים לנוירונים משחררי הורמונים גונדוטרופינים (GnRH), בין תאים אחרים. מחקרים קודמים הראו כי איתות קיספפטין מתרחש דרך קולטן Kiss1 (Kiss1r), מה שבסופו של דבר מעורר פעילות נוירונים GnRH. בבני אדם ובמודלים ניסיוניים של בעלי חיים, קיספפטין מספיקים לגרימת הפרשת GnRH, וכתוצאה מכך, שחרור הורמון מחלמן (LH) והורמון ממריץ זקיקים (FSH). מאחר שקיספפטינים ממלאים תפקיד חיוני בתפקודי הרבייה, חוקרים עובדים כדי להעריך כיצד הפעילות הפנימית של נוירוני קיספפטין היפותלמיים תורמת לפעולות הקשורות לרבייה ולזהות את המוליכים העצביים/נוירומודולטורים העיקריים המסוגלים לשנות תכונות אלה. טכניקת הידוק המדבקים של כל התא הפכה לכלי רב ערך לחקר פעילות נוירוני קיספפטין בתאי מכרסמים. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לחוקרים להקליט ולמדוד זרמים יוניים מעוררים ומעכבים ספונטניים, פוטנציאל קרום מנוחה, ירי פוטנציאלי פעולה ותכונות אלקטרופיזיולוגיות אחרות של קרום התא. במחקר הנוכחי נסקרים היבטים מכריעים של טכניקת מהדק טלאי של כל התא, הידועה כמדידות אלקטרופיזיולוגיות המגדירות נוירונים קיספפטין היפותלמיים, ודיון בסוגיות רלוונטיות לגבי הטכניקה.

כדי לחקור את ההשפעות האפשריות של הורמון גדילה רקומביננטי אנושי (hGH) על הפעילות של נוירוני קיספפטין היפותלמיים, ביצענו רישומי מהדק טלאי של תאים שלמים בפרוסות מוח והערכנו אם הורמון זה גורם לשינויים חריפים בפעילות של תאי עצב מסוג AVPV/PeNקיספפטין ו-ARHקיספפטין. במחקר זה נעשה שימוש בנקבת Kiss1-Cre/GFP בוגרת (שלב הדיזטרוס) ובעכברים זכרים36. בעלי חיים שלמים בגונדה נבחרו לניסויים, שכן המאפיינים של נוירוני קיספפטין ההיפותלמיים שלהם עשויים להשתנות בהתאם לרמות סטרואידים מין<sup class=...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מהדק טלאי של תאים שלמים על פרוסות מוח המכילות נוירוני קיספפטין, המודולטור העיקרי של תאי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). על ידי הוספת ידע על פעילות נוירוני קיספפטין, כלי אלקטרופיזיולוגי זה שימש בסיס להתקדמות משמעותית בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה במהלך 20 השנים האחרונות.

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

על ידי מדידת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של קרום התא, ניתן לפתור את שאלת המוכיחות העיקריות המווסתות את הפעילות החשמלית של התא. רישום מהדק טלאי של תא שלם היא טכניקה היקפית לחקר זרמים יוניים בתאים בודדים וחקרה את התגובה התאית לגירויים שונים. הביצועים הטובים ביותר על הקלטות מראש של מהדק טלאי תא שלם יושגו לאחר תרגול ולימוד רב.כדי להתחיל דיסקציה מוחית, בצע חתך באמצעות מספריים כירורגיים בעור בחלק העליון של גולגולת החיה הערופה מקודל לרוסטרל והסר את הקרקפת. לאחר מכן, לחתוך את הצלחת inter parietal לאורך תפר sagittal עם מספריים הקשתית ולהסיר את עצם העורף. החליקו את האוסטאוטום מתחת לעצם הקודקוד ומשכו אותו החוצה בעדינות עד שהמוח נחשף.לאחר חשיפת המוח, הפוך את הראש. הורידו בעדינות את המוח כדי לדמיין את העצב הטריגמינלי בכל צד. ואז לחתוך את העצב trigeminal באמצעות מספריים מעוקל Castroviejo.לאחר הדמיה של ההיפותלמוס, זהה את עצב הראייה וחתך אותו בעדינות. לאחר מכן, לחתוך את החלק הקדמי הרחוק של האונה הקדמית. מוציאים את המוח ומיד טובלים אותו בתמיסת החיתוך עד לקבלת הפרוסות.כדי לחתוך את דגימות המוח, הניחו את המוח על נייר סינון כדי לייבש את התמיסה העודפת. לאחר מכן, עם סכין גילוח חיתוך חד, לבצע חתך קורונלי המפריד את גזע המוח עם המוח הקטן משאר הרקמה. לאחר מכן, הדביקו את החלק הקאודל של המוח לבסיס הוויברטומה ומלאו את תא מכשיר החיתוך בתמיסת החיתוך או בתמיסת aCSF מקוררת לאפס עד שתי מעלות צלזיוס.ארזו קרח יבש סביב תא הוויברטום כדי לשמור על תמיסת החיתוך קרה במהלך ההליך. הכנס את סכין הגילוח לוויברטום והגדר את פרמטרי החיתוך של המכשיר, כגון מהירות לשלוש, תדר לתשעה והזנה ל -250 מיקרומטר. במהלך הליך חיתוך הרקמה מעבירים את הפרוסות באמצעות פיפטת העברה אקרילית לתא ההתאוששות וממתינים 60 דקות לשחזור הרקמה לאחר רכישת הפרוסה.לפני תחילת איטום התא והקלטתו, הפעל את המיקרוסקופ, המגבר, הדיגיטציה והמיקרו מניפולטור. בנה את תא ההקלטה המחובר למיקרוסקופ עם תמיסת aCSF. השתמש במשאבת זילוח כדי לחורר כל הזמן את aCSF בשני מיליליטר לדקה.בדוק את הגדרות התוכנה וצור פרוטוקולים ספציפיים להקלטות בהתאם לסוג הניסוי. מעבירים פרוסת מוח מעניינת אחת בכל פעם לתא ההקלטה באמצעות פיפטת העברה אקרילית. החזיקו את הפרוסה עם עיגון פרוסה כדי שלא תזוז במהלך זילוח aCSF.מקמו את הפרוסה במרכז תא ההקלטה באמצעות עדשת המטרה בהספק נמוך של המיקרוסקופ, 10X או 20X. מיקום הפרוסה הוא קריטי כדי לאפשר תצוגה טובה של האזור הרצוי מתחת למיקרוסקופ ולהגיע באופן מושלם למיקרופיפטה הקולטת. לאחר איתור אזור העניין יש להעביר את עדשת האובייקט לעדשה בעוצמה גבוהה, 63X ולהתמקד ברמת הרקמה, תוך התבוננות בחלבון הפלואורסצנטי האנדוגני ובצורות התאים באזור היעד כדי לאתר את תאי הקיספפטין על פני השטח של פרוסת המוח.כאשר תא יעד אפשרי ממוקם, סמן אותו על מסך המחשב באמצעות סמן העכבר או על ידי ציור פורמט כמו ריבוע מעל אזור העניין. סימן המסך של המחשב מסייע להנחות את מיקום פיפטת ההקלטה אל התא. לאחר קביעת המיקום המדויק של תא המטרה, הרימו את המטרה והכניסו את מיקרופיפטת ההקלטה המלאה בתמיסה הפנימית במחזיק האלקטרודה, תוך הבטחת התמיסה הפנימית במגע עם אלקטרודת הכסף.יש להפעיל לחץ חיובי לפני השקעת המיקרופיפטה בתמיסת aCSF באמצעות מזרק מלא אוויר של מיליליטר עד שלושה מיליליטר המחובר למחזיק המיקרופיפטה דרך צינור פוליאתילן כדי למנוע כניסת פסולת למיקרופיפטה. באמצעות מיקרו מניפולטור להנחות את micropipette מתחת למרכז המטרה. הזז את לחצני המיקרו מניפולטור כדי להנחות את ציר XYZ של המיקרופיפטה לכיוון התא המעניין.כוונן את המיקוד כדי לראות את קצה המיקרופיפטה ולקרב את הפוקוס, אך לא קרוב מדי לפרוסה. הפחיתו את מהירות המיקרו מניפולטור והורידו לאט לאט את המיקרופיפטה למישור המיקוד, וודאו שקצה המיקרופיפטה לא חודר בפתאומיות לפרוסה, אלא יורד לאט עד שהוא נוגע בפני השטח של התא או באזור המטרה. הפעלת לחץ חיובי קל עם מזרק מלא אוויר של מיליליטר עד שלושה מיליליטר כדי לפנות פסולת מנתיב הגישה.הזז לאט את מניפולטור המיקרו על ציר XYZ כדי לקרב את קצה המיקרופיפטה ולגעת בתא היעד מה שגורם לגומה על ידי הלחץ המופעל. לאחר הקמת הגומה בעזרת מצב מהדק מתח בתוכנה, יש להחיל יניקה קצרה חלשה דרך הפה למשך שנייה עד שתיים דרך הצינור המחובר למחזיק המיקרופיפטה כדי ליצור את האטימה בין המיקרופיפטה לתא. אם האטם נשאר יציב מכנית ללא הפרעות רעש למשך כדקה, כוונו את מתח האחיזה לפוטנציאל המנוחה הפיזיולוגי הקרוב ביותר של התא המעניין.עבור kisspeptin נוירונים היפותלמוס מינוס 50 מיליוולט מומלץ. לאחר מכן, יש למרוח יניקה קצרה דרך הפה כדי לשבור את קרום הפלזמה בקצה המיקרופיפטה האטומה לתא כך שהקרום הקרוע לא יסתום את המיקרופיפטה או ימשוך חלק גדול מהקרום או את התא. ניתן להשיג תצורה נאותה של תאים שלמים על ידי ביצוע יניקה בכוח מספיק.בדוק את מדריך הגדרות המערכת שבו נעשה שימוש. לאחר שבירת קרום התא, הפעל את אפשרות התא כולו במצב מהדק מתח ולחץ על הפקודה האוטומטית המפנה לכרטיסיית התא כולה. עמידות סדרת התא וקיבול התא כולו מחושבים באופן אוטומטי ומוצגים באופן מיידי על ידי התוכנה.לאחר מכן, בדוק את פרמטרי כדאיות התא בתוכנה כמתואר בכתב היד של הטקסט. עקוב אחר התנגדות הסדרה וקיבול המצב היציב של התא במהלך הניסויים. לאחר שתצורת התא כולה מושגת כראוי, מדוד זרמים סינפטיים במצב מהדק מתח.רשום את השינויים בפוטנציאל קרום המנוחה ואת השינויים הפוטנציאליים של קרום המנוחה המושרה במצב המהדק הנוכחי. ההשפעות האפשריות של הורמון גדילה רקומביננטי אנושי על פעילותם של נוירוני קיספפטין היפותלמיים נחקרו בעזרת רישומי מהדק טלאי של תאים שלמים. מתן הורמון גדילה רקומביננטי אנושי, HGH ב 20 מיקרוגרם לגרם גרם גרם היפרפולריזציה משמעותית של פוטנציאל קרום המנוחה ב -5 מתוך 12 נוירוני קיספפטין AVPV / PeN ו -9 מתוך 14 נוירוני קיספפטין ARH רשומים.הנוירונים AVPV/PeN kisspeptin ו-ARH kisspeptin היפרפולריזציה שינו באופן משמעותי את פוטנציאל קרום המנוחה בהשוואה לתאים שאינם מגיבים. ההשפעות על פוטנציאל הממברנה במנוחה במהלך יישום HGH באו בעקבות הפחתה משמעותית של התנגדות הקלט של התא כולו של כ 0.9 עד 0.7 gigaohms על AVPV / PeN kisspeptin neurons ו 1.7 עד 1.0 gigaohms על נוירונים kisspeptin RH. במהלך קווי המוח המושלמים המבוצעים באמצעות ג'יגזיאל זהיר והאזור בתא באמצעות פרמטרים של חוף נדרשים כדי להשיג את ההקלטות הטובות ביותר של כל התא.ניתן לאסוף את תמיסת המיקרופיפטה של התא המוקלט ולהשתמש בה עבור RTPCR של תא בודד המאפשר אפיון מולקולרי של תא מבודד. טכניקת מהדק טלאי של תאים שלמים בשילוב עם שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטית מהווה פריצת דרך בהבנת הרבייה המאפשרת הגדרה של נוירוני קיספפטין תכונות מוגברות, והם מודולטורים עיקריים.

hypothalamic-kisspeptin-neurons-as-target-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

הסרטון מדגים שיטה לחקור את ההתרגשות של תאים עצביים המבטאים חלבון פלואורסצנטי באמצעות מהדק זרם טלאי שלם. במצב מהדק הנוכחי, פוטנציאלי פעולה המעידים על רגישות עצבית נוצרים.

חקר ההתרגשות של תאי עצב פלואורסצנטיים באמצעות מהדק טלאי של תא שלם

הסרטון מדגים פרוטוקול לחקר אינטראקציות סינפטיות ותגובות עצביות בפרוסת מוח של עכבר נגוע בהיפוקמפוס. היא כוללת הארת נוירונים חושיים ארוכי טווח כדי להפעיל פוטנציאלי פעולה ורישום הפוטנציאלים הפוסט-סינפטיים המעוררים המתקבלים בתא העצב המוקלט באמצעות טכניקת מהדק טלאי של התא כולו.

פוטו-טימולציה והקלטות מהדק טלאי של תא שלם של תאי עצב בפרוסות היפוקמפוס עכבר

סרטון זה מדגים את השימוש בטכניקת מהדק טלאי תא שלם למדידת תגובות בתאי עצב קיספפטין מפרוסות היפותלמוס של עכבר. התהליך כולל השגת תצורת תא שלם ורישום שינויים פוטנציאליים בממברנה הנגרמים על ידי הורמון הבדיקה באמצעות מצב מהדק זרם.

קביעת השפעת הורמון גדילה לבדיקה על נוירונים של קיספפטין באמצעות מהדק תיקון של תא שלם

סרטון זה מדגים את ההליך לביצוע רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתאי עצב מסוג substantia gelatinosa (SG) של פרוסות חוט השדרה, תוך שימוש בטכניקות של מהדק טלאי של תאים שלמים כדי לנתח דפוסי ירי של נוירונים. שיטה זו מאפשרת לחקור תגובות עצביות לגירויים בנוירוני SG של חוט השדרה.

רישום מהדק טלאי של תא שלם בנוירון ג'לטינוזה מהותי של פרוסת חוט השדרה

סרטון הפרוטוקול מתאר הקמת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירוני החישה של איבר הוומרונסאל (VNO) בעכברים. פרוסת VNO קורונלית עם נוירונים חושיים המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוקמת במערך הקלטה. תא עצב מסומן מתוקן עם פיפטת הקלטה בתצורה של תא שלם לרישום אלקטרופיזיולוגי בתגובה לגירויים כימיים.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מנוירונים חושיים Vomeronasal

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקודית הריבוי סינפטית באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה.

הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

למדו את שיטת ההקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים לחקר פעילות נוירוני קיספפטין היפותלמיים. טכניקה זו מאפשרת מדידה מדויקת של זרמי יונים ומאפיינים חשמליים בתאים בודדים, ותורמת להבנת מנגנוני הנוירואנדוקרינולוגיה והביולוגיה הרבייה.

נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים

גלה סרטונים נוספים