Name: בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה מסוג חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: חקור מנגנון סיגנל Notch באבות גליה רדיאלית של דגי זברה באמצעות שיטת ספיגת נוגדנים לדימות אנדוציטוזה של ליגנד DeltaD. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תהליכי חלוקה א-סימטרית במוח המתפתח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט נתמך על ידי NIH R01NS120218, פרס זרעי מרי אן קודה-קימבל של UCSF לחדשנות, וצ'אן צוקרברג Biohub.

השתמשנו בקו מסוג AB פראי וקו מהונדס Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] לצורך המחקר. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו, ארה"ב (מספר אישור: AN179000).
1. הכנת עוברים של דגי זברה
<ol><li>הציבו מכלי חציית דגים בשעות אחר הצהריים לפני השעה 17:00, עם נקבת דג בר אחת ודגי Tg זכר אחד [ef1a:Myr-Tdtomato] על ידי שימוש במחיצות כדי להפריד ביניהם בכל מכל.</li>
	<li>הסר את המחיצות לפני השעה 11:00 מכל מכלי המעבר למחרת בבוקר. שמור על שקט ואל תפריע לדגים בזמן שהם מזדווגים. ההשרצה מתרחשת בדרך כלל תוך 30 דקות לאחר הסרת החוצצים. הביציות המופרות נשארות בתחתית המיכל.<ol><li>לאסוף ביצים מופרות מן המיכלים עם מסנן רשת. מעבירים את הביציות על ידי שטיפתן לצלחת פטרי מלאה במי ביצים ובוחנים את העוברים תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 10 עד פי 20.</li>
	</ol></li>
	<li>העבירו את העוברים המופרים לצלחת פטרי נקייה המכילה כ-20 מ"ל של תווך עובר (100 מ"ל של תמיסת מלאי פי 1,000 מכילה 29.4 גרם NaCl, 1.27 גרם KCl, 4.85 גרם CaCl 2.2H 2 O ו-8.13 גרם MgSO4.7H 2O) עם פיפטות פסטר מזכוכית גדולה. שמור את העוברים ב 28 ° C. שמור 50 עוברים מופרים לכל צלחת פטרי עם 30 מ"ל של עובר בינוני ב 28.5 ° C. הערה: זוג דגים אחד מייצר בדרך כלל 100-300 עוברים, ושיעור ההפריה וההישרדות של עוברים בריאים הוא מעל 95% עבור כל הזדווגות.</li>
	<li>למחרת בבוקר, הוציאו את העוברים מהאינקובטור בשעה 8:00 בבוקר, כאשר העוברים הגיעו לשלב התפתחותי של ~18-20 שעות לאחר ההפריה (hpf). צפו בהם תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהגדלה של פי 20, תוך שימוש באור לבן בהתחלה. בשלב זה, עוברי דגי הזברה נמצאים בשלב 20 הסומיט.<ol><li>השליכו עוברים מתים עכורים או קרועים מתחת למיקרוסקופ באמצעות פיפטה מזכוכית.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעל את מנורת הפלואורסצנט ובחר את הגדרת מסנן RFP של המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחר את העוברים עם פלואורסצנטיות אדומה חזקה ולהעביר אותם לצלחת חדשה עם מי ביצה.<ol><li>יש לפרק את העוברים ידנית בעזרת שני מלקחיים עדינים (קצות המלקחיים צריכים להיות חדים ולא פגומים) תחת אור לבן (טבלת חומרים).</li>
		<li>החזיקו את הכוריון עם זוג מלקחיים אחד ועשו קרע בכוריון עם המלקחיים האחרים. פתחו את הקרע בזהירות בעזרת המלקחיים, והפכו אותו לגדול מספיק כדי שהעובר יוכל לעבור דרכו על ידי דחיפת העובר בעדינות עם קצות המלקחיים האחרים.</li>
	</ol></li>
	<li>העבירו את העוברים המפרקים לצלחת פטרי חדשה עם מדיום עוברי טרי לשטיפה מהירה לפני מיקרו-הזרקה.</li>
</ol>2. הכנת מיקרו-הזרקה
<ol><li>השתמש בנימים (1.2 מ"מ OD, 0.9 מ"מ ID, עם חוט להט) למשיכת מחטי הזרקה עדינות על מושך. תכנן וייעל את תוכנית המשיכה בהתאם למדריך.</li>
	<li>פתח את קצה המחט עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו. הפוך את קוטר הקצה סביב 10 מיקרומטר, ואת זווית התחדדות סביב 30°.</li>
	<li>הצמד את הנוגדן החד-שבטי נגד Dld של העכבר עם האנטי-עכבר-IgG-Atto647N לפני ההזרקה.<ol><li>עבור כל ניסוי הזרקה, לערבב 0.5 μL של נוגדן anti-Dld (0.5 מ"ג / מ"ל) עם 2 μL של נוגדן נגד עכבר IgG-Atto647N (1 מ"ג / מ"ל) על ידי pipetting 5-10 פעמים. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות (או על קרח במשך 2-3 שעות).</li>
		<li>לאחר הדגירה, הוסף 2.5 μL של חיץ חוסם (10 מ"ג / מ"ל עכבר IgG) ו 0.5 μL של 0.5% פנול אדום לתערובת הנוגדנים, ופיפטה 10x כדי לערבב היטב, כדי לחסום נוגדנים לא מצומדים שנותרו בתערובת. הערה: עבור כל ניסוי, הכינו תערובת אחת נוספת ללא נוגדן נגד Dld והשתמשו בה כבקרה.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו אגרוז של 1% נקודת התכה נמוכה בתווך העוברי. מחממים את תערובת האגרוז ב-70 מעלות צלזיוס עד שהתערובת הופכת לשקופה.<ol><li>Aliquot פתרון agarose ב 2 מ"ל צינורות microcentrifuge. שמור את aliquots בלוק חום ב ~ 40 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לשטוף את העובר בצינור המכיל 1% נקודת התכה נמוכה למשך 3 שניות.</li>
	<li>הניחו את העובר על מכסה צלחת פטרי מפלסטיק הפוך יחד עם טיפות בודדות של אגרוז (~30-40 μL) כדי להרכיב כל עובר בנפרד על המכסה, כפי שמוצג באיור 1. הניחו את העוברים שטוחים לרוחב באגרוז ושמרו על תנוחה זו עד שהאגרוז התמצק בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הר 12 עוברים בשלוש שורות אחד אחד כמו לעיל. מכסים את כל העוברים הרכובים באגרוז עם מדיום ביצית.</li>
</ol>3. מיקרו-הזרקה
<ol><li>שים את העוברים המשובצים מתחת לסטריאומיקרוסקופ וכסה את האגרוז במי ביצה.</li>
	<li>מקמו את מזרק לחץ האוויר יחד עם מיקרומניפולטורים, ומקמו אותם קרוב למיקרוסקופים כפי שמוצג באיור 1. השתמש בבלון גז פלדה המכיל חנקן גזי (N2) בלחץ גבוה כמשאב האוויר.<ol><li>פתח את שסתום הגז רק לאחר שהעוברים הותקנו באגרוז. לאחר מכן, טען מקדימה את מחט הזכוכית המוכנה עם 2 μL של תערובת נוגדנים על המיקרומניפולטור, כפי שמוצג באיור 1, בעת שימוש במודול המילוי הקדמי של המיקרו-מזרק.</li>
		<li>כוונן את לחץ הכניסה ל~80-90 psi, ואת לחץ ההזרקה ל~20 psi.</li>
	</ol></li>
	<li>כיול נפח ההזרקה באמצעות מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ, כפי שתואר קודם15. הגדר את משך זמן הכוונון להיות בין 10 אלפיות השנייה ל- 120 אלפיות השנייה, בהתאם לגודל פתח המחט. העבר כל פעימה של הזרקה על ידי הקשה על המשוט. כוונן את נפח ההזרקה של כל מסירה ל~ 4-5 nL.</li>
	<li>יש לדחוף את קצה מחט המיקרו-הזרקה דרך לוחית הגג הגבית של המוח האחורי לנקודת הציר r0/r1, ולהזריק כ-10 nL (שתיים או שלוש פעימות) של תערובת נוגדנים מבלי לפגוע ברקמת המוח. שימו לב לזרימת נוזלים אדומים בחדר המוח. הערה: חדר המוח האחורי הוא אחורי לגבול המוח האחורי של המוח האמצעי. תערובת הנוגדנים המוזרקת המכילה פנול אדום ממלאת את חדר המוח מהמוח האחורי למוח הקדמי באופן מיידי על ידי פיזור עם נוזל מוחי שדרתי.</li>
	<li>לאחר ההזרקה, להסיר את קצה המחט מן העובר במהירות על ידי סיבוב הידית של micromanipulator. להזרקה מוצלחת, הצבע האדום של התערובת המוזרקת נשאר בחדר המוח ביציבות מבלי לדלוף לתוך האגרוז שמסביב.</li>
	<li>הזיזו את לוחית ההרכבה מתחת למיקרוסקופ כדי לאתר עובר רכוב אחר במיקום מתאים לחזרות.<ol><li>לאחר הזרקת שישה עד שמונה עוברים, מקלפים את האגרוז בסכין מיקרוכירורגית כדי לשחרר את העוברים מהאגרוז המשובץ. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת טרייה עם 30 מ"ל של תווך עובר, ומניחים אותם בטמפרטורת החדר לשלבים הבאים.</li>
	</ol></li>
</ol>4. הדמיה חיה של הרכבה וקיטועי זמן
<ol><li>לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים שנבחרו ל 10 מ"ל של מדיום העובר. הוסף 420 μL של מלאי טריקאין (4 מ"ג / מ"ל) ל 10 מ"ל של מדיום העובר כדי להרדים את העוברים.</li>
	<li>כדי להרכיב את העוברים, להכין 0.8% נקודת התכה נמוכה agarose המכיל את אותו ריכוז של tricaine בצינור. שמור את aliquots בלוק חום ב ~ 40 ° C.</li>
	<li>השתמש פיפטה זכוכית לטבול את העוברים המוזרקים באגרוז חם במשך 3 שניות. לאחר מכן, הוציאו מיד את העוברים מהאגרוז עם אותה פיפטה מזכוכית והניחו את העוברים במרכז צלחות תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ עם טיפת אגרוז מהשפופרת. הניחו על הכוס עובר אחד בלבד בכל טיפה.</li>
	<li>כוונו את העוברים בעדינות עם בדיקת סיבים או קצה העמסה כדי לשמור על הצד הגבי של המוח העוברי קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית. כוונן את תנוחת העובר בעדינות כדי להאריך את העובר מבלי לסלסל כאשר האגרוז מתמצק בהדרגה.</li>
	<li>לאחר מכן, בדקו את מיקום העובר על ידי הפיכת צלחת תחתית הזכוכית. ודא כי כל המוח הקדמי הגבי עם עוברים רכובים כראוי ניתן לראות תחת המיקרוסקופ.</li>
	<li>הוסף 2-3 מ"ל של 28.5 ° C מחומם מראש תווך עוברי המכיל tricaine כדי לכסות את העובר. הניחו את הצלחת כראוי על השלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ הקונפוקלי, כפי שמוצג באיור 1. כוונן את הטמפרטורה של תא ההדמיה להיות 28.5 ° C. העובר מוכן כעת להדמיה.</li>
	<li>בצע הדמיה חיה בהילוך מהיר עם מרווח זמן קבוע באמצעות יעד טבילה במים של 40x.<ol><li>השתמש בתוכנת בקרת הדימות והמיקרוסקופ (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.</li>
		<li>בחרו את תעלות ההדמיה של 564 ננומטר ו-647 ננומטר לצורך הדמיה של פלואורסצנטיות הממברנה של דגי זברה טרנסגניים MyR-Tdtomato ונוגדי Dld-Atto647N אנדוזומליים בתא (איור 1).</li>
		<li>הגדר את עוצמת הלייזר ל- 30% עבור שני הערוצים. השתמש בזמן חשיפה לכל מישור z של 200 אלפיות השנייה עבור כל ערוץ.</li>
		<li>עבור כל עובר דג זברה רכוב, השתמש בצעד z סורק של 1 מיקרומטר עבור 20 מישורי z בסך הכל, ובמחזור סריקה של 100 מסגרות זמן.</li>
		<li>הגדר את מרווח הזמן בין כל מחזור סריקה ל- 20 שניות ומצב הסריקה כערוץ, פרוסה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Baonza, A., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+directly+controls+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).</li>
<li>Chitnis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChitnis%2C+A+%22Developmental+Dynamics%22">Developmental Dynamics</a>. 235 (4), 886-894 (2006).</li>
<li>Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+trafficking+during+mitosis+and+notch-dependent+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+and+Subcellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).</li>
<li>Le Borgne, R., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+endocytosis+makes+delta+signal+better%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: endocytosis makes delta signal better.</a> Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).</li>
<li>Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+endocytosis+is+induced+by+ligand+and+is+required+for+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-1+signalling+requires+ligand-induced+proteolytic+release+of+intracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain.</a> Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).</li>
<li>Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Delta+and+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division.</a> Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).</li>
<li>Derivery, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+by+spindle+asymmetry+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division.</a> Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).</li>
<li>Matsuda, M., Chitnis, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Notch+determines+endocytosis+of+specific+Delta+ligands+in+zebrafish+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue.</a> Development. 136 (2), 197-206 (2009).</li>
<li>Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).</li>
<li>Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralineage+directional+Notch+signaling+regulates+self-renewal+and+differentiation+of+asymmetrically+dividing+radial+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia.</a> Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+engage+cytoplasmic+Par-3+that+recruits+dynein+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division.</a> Science Advances. 7 (24), (2021).</li>
<li>Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+analysis+for+cryosectioned+and+immunostained+tissue+samples+with+or+without+label+retention+expansion+microscopy+%28LR-ExM%29+by+JACoP%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP.</a> Bio-Protocol. 12 (5), 4336(2022).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1218(2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+the+injection+volume+for+microinjection+of+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+multicolor+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פיתחנו בדיקת ספיגת נוגדנים לתיוג והדמיה של סחר אנדוזומלי Notch/Delta באבות גליה רדיאלית של דגי זברה ביעילות גבוהה. בהשוואה לשיטות קודמות ששימשו למעקב אחר נוגדנים מסומנים נגד DeltaD בתאי SOPדרוזופילה 7,8, השיטה שלנו השתמשה במיקרו-הזרקה במקום דגירה של דגימות בנוגדן המצומד. נוגדנים מצומדים פלואורסצנטית נגד Dld הוזרקו במיקרו לחדר המוח האחורי; טכניקה זו אינה גורמת לפציעה, כפי שמעידה התפתחות תקינה והתאוששות מלאה של עוברים לאחר ההזרקה. החדרים העובריים הם רציפים, ומאפשרי...

איתות חריץ שולט בהחלטה ובדפוס של גורל התא במהלך ההתפתחות במטזואנים1, ומחקרים אחרונים הראו כי איתות Notch בחלוקת תאי גזע תלוי בעיקר בסחר אנדוציטי 2,3. Endocytosed Notch/Delta יכול להפעיל איתות Notch בגרעין ולשפר את השעתוק של גנים המטרה Notch 4,5,6. תנועה אנדוזומלית מסוג Directional Notch/Delta נצפתה לראשונה בתאי Drosophila sensory organy precursor (SOP) במהלך חלוקת התאים הא-סימטרית שלה (ACD), וכתוצאה מכך פעילות איתות Notch גבוהה יותר ב-pIIa מאשר ב-pIIb 7,8. בדיקות ספיגת נוגדנים עם נוגדנים אנטי דלתא ואנטי Notch יושמו כדי לפקח על התהליך האנדוציטי בתאי SOP מיטוטיים. אנדוזומים מסוג Notch/DeltaD נעים יחד עם חלבון קינזין מוטורי אל הציר המרכזי במהלך הציטוקינזיס, ועוברים טרנסלוקציה אסימטרית לתא pIIa עקב המערך האנטי-מקבילי של הציר המרכזי הא-סימטרי ברגע האחרון של חלוקת התא 3,8. מחקרים אלה שפכו אור על המנגנונים המולקולריים המווסתים חלוקה אסימטרית בתאי SOP דרוזופילה, אך לא ברור אם תהליכים אנדוציטיים דומים מתרחשים באבות גליה רדיאלית של בעלי חוליות (RGPs).
יתר על כן, המנגנונים המולקולריים המווסתים איתות Notch/DeltaD אסימטרי במהלך חלוקת RGP של בעלי חוליות אינם מובנים היטב. בדגי זברה, דווח כי האינטראקציה של Notch ו- Delta מקלה על אנדוציטוזה של ליגנד DeltaD9. לא ידוע אם אנדוציטוזה של DeltaD יכולה להשפיע על בחירת גורל התא של תאי בת במוח החוליות המתפתח. מחקרים אחרונים מראים כי הזרקת נוגדנים אנטי-דלתא-D מצומדים פלואורסצנטית לתוך הצינור העצבי יכולה לתייג אנדוזומי Sara באופן ספציפי בתאים נוירואפיתליאליים, ואנדוזומי אנטי-DeltaD המכילים Sara מפרידים באופן מועדף לתאי בת מתרבים10. הוצע כי איתות Notch מהאנדוזומים יכול לווסת את גורל תאי הבת. תוצאות קודמות הראו שרוב תאי RGP של דגי זברה במוח הקדמי המתפתח עוברים ACD, וקביעת גורל תאי הבת תלויה באיתות Notch/DeltaD11. על מנת להבהיר את טבעו של איתות Notch/DeltaD תוך שושלת בדגי זברה, פיתחנו את בדיקת ספיגת הנוגדנים נגד DeltaD במוח המתפתח של דגי זברה. באמצעות פרוטוקול זה, ביצענו בהצלחה תיוג חי והדמיה של סחר אנדוציטי DeltaD ב- RGPs מיטוטיים.
הנוגדן נגד DeltaD המסומן באופן פלואורסצנטי מופנם ביעילות לתוך RGPs לאורך החדר הקדמי במוח. זה הקל מאוד על גילוי הסחר הכיווני של אנדוזומי DeltaD בחלוקה אסימטרית של RGPs12,13. בהשוואה לפרוטוקולים קודמים של ספיגת נוגדנים שפותחו עבור תרביות Drosophila notum וחוט השדרה 10 של דג הזברה, פרוטוקול זה השיג תיוג אנטי-DeltaD ארוך טווח ויעיל ביותר בשכבת תאי חדר המוח, במיוחד עם פחותמ-10 nL של תערובת נוגדנים במיקרו-הזרקה. הזרקת חדר המוח האחורי נוחה מאוד ליישום בדיקת ספיגת הנוגדנים במוח המתפתח, שכן חדר המוח האחורי מורחב היטב בעוברים של דגי זברה ומתמלא בנוזל מוחי שדרתי בשלב ההתפתחות המוקדם14. על ידי הזרקת תערובת הנוגדנים לחדר המוח האחורי מבלי לפגוע ברקמות מתפתחות חיוניות, הפרוטוקול מזער ככל האפשר נזק אפשרי לאזור הדימות במוח הקדמי. המינון המופחת של הנוגדן הראשוני המוזרק מנע גם מתופעות לוואי אפשריות של הפרעה לאיתות אנדוגני של Delta-Notch in vivo. פרוטוקול זה יכול להיות משולב בקלות עם הפרעות פרמקולוגיות או גנטיות אחרות, בשימוש בשלבים התפתחותיים שונים, ואולי מותאם למוח הבוגר, כמו גם אורגנואידים מוח דו-ממדיים / תלת-ממדיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. יחד, הפרוטוקול איפשר להבין כיצד ומתי נוצרת אסימטריה באיתות Notch במהלך ACD. האתגר העיקרי ליישום מוצלח של פרוטוקול זה הוא להשיג אספקה מדויקת של ריכוזים מתאימים של הנוגדן בהתבסס על תנאי ניסוי ספציפיים.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ&nbsp;</td><td>תאגיד MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>מזרק לחץ אוויר&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר-IgG-ATTO647N&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>50185</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>נימי Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr>, <tr><td>1.2 מ"מ OD, 0.9 מ"מ ID, עם נימה</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-6</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 דיסק מסתובב/שדה רחב במהירות גבוהה</td><td>Nikin</td><td>N/A</td><td>Nikon&nbsp; מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Ti עם שדה ראייה גדול של CSU-W1</td></tr>.<tr><td>פינצטה רפואית Dumont סגנון 5</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>72877-D</td><td></td></tr><tr><td>חולץ Flaming-Brown P897</td><td>Sutter Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf KCl</td><td>Millipore</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td> מיקרומניפולטורים <td></td><td></td> Sigma-Aldrich M2773 <td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td> עכבר <td>WPI M3301R</td><td></td></tr><tr><td>נגד DLD&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB_1268496</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG חוסם מאגר מבית Zenon</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z25008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000&nbsp; &nbsp;</td><td>צייס&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>UltraPureTM נקודת התכה נמוכה אגרוז&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה מסוג חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

חלוקת תאים אסימטרית (ACD), המייצרת שני תאי בת בעלי גורלות שונים, היא בסיסית ליצירת מגוון תאי. באיברים המתפתחים הן של חסרי חוליות והן של בעלי חוליות, חלוקה א-סימטרית של אבות יוצרת בת נוץ'היי המתחדשת מעצמה ובת נוץ'לו מבדילה. במוח של דגי זברה עובריים, אבות גליה רדיאלית (RGPs) – תאי הגזע העצביים העיקריים של בעלי החוליות – עוברים לרוב ACD כדי ללדת RGP אחד ותא עצב מתמיין אחד. הבהירות האופטית והנגישות הקלה של עוברי דגי זברה הופכות אותם לאידיאליים עבור הדמיה בהילוך מהיר in vivo כדי להמחיש ישירות כיצד ומתי אסימטריה של איתות Notch נוצרת במהלך ACD. מחקרים אחרונים הראו כי אנדוציטוזה דינמית של ליגנד Notch ligand DeltaD ממלאת תפקיד מכריע בקביעת גורל התא במהלך ACD, והתהליך מווסת על ידי וסת הקוטביות השמור אבולוציונית Par-3 (הידוע גם בשם Pard3) והקומפלקס המוטורי של הדיניין. כדי להמחיש את דפוסי הסחר in vivo של אנדוזומי איתות Notch ב-RGPs מיטוטיים, פיתחנו את בדיקת ספיגת הנוגדנים הזו. באמצעות הבדיקה, חשפנו את הדינמיקה של אנדוזומים המכילים DeltaD במהלך חלוקת RGP.

באיור 2A, העוברים שהוזרקו להם Atto647N, ללא קישור עם הנוגדן הראשוני, הראו פלואורסצנטיות רקע בחדר המוח. מעט מאוד חלקיקים פלואורסצנטיים נבלעים ניתן לראות בתאים. עוברי דגי הזברה שהוזרקו נגד Dld-Atto647N הראו כמויות גדולות של חלקיקים פלואורסצנטיים מופנמים ברוב התאים במוח הקדמי המתפתח (איור 2A, פאנל ימני). לאחר התקרבות כדי להתמקד ב-RGPs מיטוטיים, כפי שמוצג באיור 2B, הצלחנו לתעד את התנועה הדינמית של אנדוזומים תוך-תאיים אנטי-Dld-Atto647N ב...

עבודה זו מפתחת בדיקת ספיגת נוגדנים להדמיית איתות תוך שושלת Notch/DeltaD בחלוקת אבות גליה רדיאלית במוח דג הזברה העוברי.

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

איתות חריץ שולט בהחלטה ובתבניות סולפט במהלך ההתפתחות במטזואנים. פיתחנו בדיקת ספיגת נוגדנים לתיוג ליגנד החריץ דלתא-D והדמיית הסחר האנדוציטי שלו באבות גליה רדיאלית במוח הקדמי של דגי הזברה המתפתחים. הזרקת חדר המוח הנסתרת של דג הזברה מאפשרת ספיגה סלקטיבית של Anti-Dld-Atto-647N על ידי אבות גליה רדיאלית מיוטית המרפדת את חדרי המוח בהתפתחות ביעילות גבוהה ובהשפעות ארוכות טווח.פרוטוקול זה יכול להיות משולב בקלות עם הפרעות פרמקולוגיות או גנטיות אחרות המשמשות בשלבי התפתחות שונים ואולי מותאם למוח הבוגר, כמו גם לאורגנואידים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שמקורם באורגנואידים דו-ממדיים או תלת-ממדיים של המוח. לאחר יצירת העוברים המופרים ודגירתם במשך 18 עד 20 שעות, הוציאו אותם מהאינקובטור. התבוננו בהם תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי באמצעות אור לבן תחילה בהגדלה של פי 20.השליכו עוברים מתים שנראים עכורים או קרועים מתחת למיקרוסקופ באמצעות פיפטה מזכוכית. לאחר מכן הפעל את מנורת הפלואורסצנט ובחר את הגדרת מסנן RFP של המיקרוסקופ. בחר את העוברים עם פלואורסצנטיות אדומה חזקה ולהעביר אותם לצלחת חדשה עם מי ביצה.כעת יש לפרק את העוברים ידנית עם שני מלקחיים עדינים תחת אור לבן. החזיקו את הכוריון עם זוג מלקחיים אחד ועשו קרע בכוריון עם המלקחיים האחרים. פתחו את הקרע בזהירות בעזרת המלקחיים והפכו אותו לגדול מספיק כדי שהעובר יוכל לעבור דרכו על ידי דחיפה עדינה של העובר עם קצות המלקחיים האחרים.העבירו את העוברים המפרקים לצלחת פטרי חדשה עם מדיום עוברי טרי לשטיפה מהירה לפני מיקרו-הזרקה. לאחר משיכת מחטי הזרקה עדינות על מושך, פתח את קצה המחט עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופונית. הפוך את הקוטר של קצה סביב 10 מיקרומטר ואת זווית taper סביב 30 מעלות.עכשיו לערבב 0.5 מיקרוליטר של נוגדן נגד Dld עם שני מיקרוליטרים של נוגדן נגד עכבר L G Atto-647N על ידי pipeting חמש עד 10 פעמים כדי להצמיד אותם לדגור בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות. בסוף הדגירה מוסיפים 2.5 מיקרוליטר של חיץ חוסם ו-0.5 מיקרוליטר של 0.5% פנול אדום לתערובת הנוגדנים ומערבבים על ידי פיפטינג כדי לחסום נוגדנים לא מצומדים שנותרו בתערובת. לאחר מכן, להכין 1% נקודת התכה נמוכה agarose בתווך העובר.מחממים את התערובת המכילה אגרוז ב-70 מעלות צלזיוס עד שהתערובת הופכת לשקופה. לאחר aliquotting תמיסת agarose, לשמור אותם בלוק חום ב 40 מעלות צלזיוס. שטפו את העובר בצינור המכיל 1% נקודת התכה נמוכה במשך שלוש שניות.הניחו את העובר על מכסה צלחת פטרי מפלסטיק הפוך עם טיפות אגרוז בודדות כדי להרכיב כל עובר בנפרד. הניחו את העוברים שטוחים לרוחב באגרוז ושמרו על תנוחה זו עד שהאגרוז התמצק בטמפרטורת החדר. מכסים את כל העוברים הרכובים באגרוז עם מדיום ביצית.הניחו את העוברים המשובצים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו וכסו את האגרוז במי ביצה. הגדר את מזרק לחץ האוויר עם מיקרו מניפולטורים, הצבת אותם קרוב למיקרוסקופ. השתמש בבלון גז פלדה המכיל חנקן גזי בלחץ גבוה כמשאב האוויר.לאחר שהעוברים הותקנו באגרוז, פתחו את שסתום הגז. בעת שימוש במודול המילוי הקדמי של מזרק המיקרו, טען את מחט הזכוכית המוכנה עם שני מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים על מניפולטור המיקרו. כעת כוונן את לחץ הכניסה ל- 80 עד 90 פאונד לאינץ 'מרובע ואת לחץ ההזרקה ל- 20 פאונד לאינץ 'מרובע.כיול נפח ההזרקה באמצעות מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ. הגדר את משך זמן הכוונון בהתאם לגודל פתח המחט בין 10 ל -120 אלפיות השנייה. הקש על המשוט כדי לספק כל פעימת הזרקה וכוונן את נפח ההזרקה של כל משלוח לארבעה עד חמישה ננוליטר.לאחר מכן יש לדחוף את קצה מחט המיקרו הזרקה דרך לוחית הגג הגבית של המוח האחורי, אחורית לנקודת הציר של רונדימיר אפס-אחד ולהזריק כ-10 ננוליטר של תערובת נוגדנים מבלי לפגוע ברקמת המוח. נצפתה זרימת נוזלים אדומים בחדר המוח. לאחר ההזרקה, הסר את קצה המחט מהעובר במהירות על ידי סיבוב הידית של מניפולטור המיקרו.להזרקה מוצלחת, הצבע האדום של התערובת המוזרקת נשאר בחדר המוח ביציבות מבלי לדלוף לתוך האגרוז שמסביב. הזיזו את לוחית ההרכבה מתחת למיקרוסקופ כדי לאתר עובר רכוב אחר במיקום מתאים לחזרות. לאחר הזרקת שישה עד שמונה עוברים, מקלפים את האגרוז בסכין מיקרוכירורגית כדי לשחרר את העוברים מהאגרוז המשובץ.מעבירים את העוברים המוזרקים במיקרו לצלחת טרייה עם 30 מיליליטר של מדיום עובר ומניחים אותם בטמפרטורת החדר לשלבים הבאים. לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים שנבחרו 10 מיליליטר של מדיום העובר. כדי להרכיב את העוברים, הכינו אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 0.8% המכיל ריכוז זהה של טריקן בצינור.השתמשו בפיפטת זכוכית כדי לטבול את העוברים המוזרקים באגרוז החם למשך שלוש שניות. לאחר מכן מיד להסיר את העוברים מן agarose עם פיפטה זכוכית זהה ומניחים את העוברים במרכז של 35 מ"מ זכוכית תחתית צלחת צלחת עם טיפה של agarose מן הצינור. כוונו את העוברים בעדינות עם בדיקת סיבים או קצה העמסה כדי לשמור על הצד הגבי של המוח העוברי קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית.סובבו את תנוחת העובר בעדינות כדי להאריך את העובר מבלי להתכרבל כאשר האגרוז מתמצק בהדרגה. לאחר מכן, בדקו את מיקום העובר על ידי הפיכת צלחת תחתית הזכוכית. ודא כי כל המוח הקדמי הגבי עם עוברים רכובים כראוי ניתן לראות תחת המיקרוסקופ.הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של 28.5 מעלות צלזיוס שחומם מראש תווך עוברי המכיל טריקן כדי לכסות את העובר. הניחו את המנה כראוי על שלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ הקונפוקלי והתאימו את טמפרטורת תא ההדמיה ל -28.5 מעלות צלזיוס. העובר מוכן כעת להדמיה.העוברים המוזרקים Atto-647N הראו פלואורסצנטיות רקע בחדר המוח. עוברי דגי הזברה שהוזרקו נגד Dld-Atto-647N הראו כמויות גדולות של חלקיקים פלואורסצנטיים מופנמים ברוב תאי המוח הקדמי המתפתח. הדמיית Time lapse הראתה תנועה של אנדוזומים תוך-תאיים Anti-Dld-Atto-647N במהלך חלוקת התא.רוב אבות הגליה הרדיאלית המיטוטית הראו הפרדה אסימטרית קדמית או אחורית של אנדוזומים אנטי-Dld-Atto-647N לשני תאי בת. הא-סימטריה התייצבה לקראת סוף האנאפאזה, וכתוצאה מכך נוצרה תורשה אסימטרית של אנדוזומי איתות חריץ על ידי תאי הבת לאחר מכן. יש לוודא שהמחט הוכנסה לחדר המותג הנסתר במקום הנכון ולבדוק אם יש דליפה לאחר מיקרו-הזרקה.בנוסף לתיוג איתות דלתא חריץ, הפרוטוקול ישים לתיוג חלבוני ממברנה אחרים או חלבונים חוץ-תאיים באמצעות אסטרטגיות דומות, אם קיים נוגדן טוב לתחום החוץ תאי.

antibody-uptake-assay-for-tracking-notchdelta-endocytosis-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

סרטון זה מדגים בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות Notch/DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה. היא כוללת הרכבה של עוברי דגי זברה דכוריוניים משובצים באגרוז, הזרקת תמיסת צבע המכוונת לליגנדות DeltaD על RGPs, והדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחלוקת תאים אסימטרית המאשרת את הפעלת האיתות Notch/DeltaD.

בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות חריץ הדמיה / DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

מתוארת טכניקה חדשה לאיתור קולטנים אנדוגניים בשפע נמוך הקיימים בעוברי דג הזברה. קראנו לו AFLIP מכיוון שהוא מורכב מתיוג זיקה של הקולטן על ידי הליגנד שלו המקושר למשקעים חיסוניים.

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

Immunolabeling שיטות כדי לנתח אוכלוסיות נפרדות של microtubules במוח דג זברה המתפתח מתוארים כאן, אשר חלים באופן נרחב לרקמות אחרות. הפרוטוקול הראשון מתאר שיטה ממוטב עבור immunolabeling microtubules יציבה ודינמית. פרוטוקול השני מספק שיטה כדי התמונה ולכמת nascent microtubules במיוחד.

השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

דגי זברה המכוונים לאלקטרופילים ומחמצנים תגובתיים (Z-REX) היא שיטה מבוססת ביולוגיה כימית לחקר איתות תגובתי של מולקולות קטנות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על דגים חיים בשלבי התפתחות שונים. כאן, אנו משלבים בדיקות סטנדרטיות בדגי זברה עם Z-REX לניתוח מסלולי איתות.

ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

חקור מנגנון סיגנל Notch באבות גליה רדיאלית של דגי זברה באמצעות שיטת ספיגת נוגדנים לדימות אנדוציטוזה של ליגנד DeltaD. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תהליכי חלוקה א-סימטרית במוח המתפתח.

בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה מסוג חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה

גלה סרטונים נוספים