הרכבת ליפוזום בסיוע אוקטאנול על שבב לביו-הנדסה

OLA היא פלטפורמה מיקרופלואידית רב-תכליתית שימושית לקהילת הביולוגיה הסינתטית. בפרט, כדי להנדס ביולוגית תאים מלאכותיים. ליפוזומים מבוססי OLA יכולים לעזור לנו להבין את עקרונות הארגון העצמי בביולוגיה ולבנות מכלולים המחקים תאים.

OLA מייצרת ליפוזומים חד-מפוזרים, חד-למינריים, בגודל התא באופן בתפוקה גבוהה וביעילות אנקפסולציה מעולה. זה דורש כמויות מדגם קטנות מאוד, בסדר גודל של 50 מיקרוליטר, ואת הליפוזומים שנוצרו זמינים מיד לניסויים נוספים על שבב. OLA שימושי לחקר תגובות ביולוגיות בתוך מיקרו-כליאה, דינמיקה של שלפוחיות ועיבויים ביומולקולריים והאינטראקציות שלהם עם ממברנות.

OLA יושמה גם כפלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לבדיקת תרופות, למשל, כדי לבדוק את החדירות והפעילות הממברנית של מיקרוביאליים. פונקציונליות פני השטח, שהיא טיפול PV, היא שלב קריטי עבור הפרוטוקול ויש לבצע אותה בזהירות כדי למנוע את פתרון ה- PV לכניסה למים הפנימיים ולתעלות אורגניות נושאות שומנים. כמו כן, ערוץ הפוסט-פרודקשן צריך להיות ארוך מספיק כדי שההפרדה של כיסי אוקטאנול תיצור ליפוזומים.

קטן גנאר, דוקטורנט מהמעבדה שלי, יעזור לצ'אנג צ'ן להדגים את ההליך. כדי להתחיל, קחו פרוסת סיליקון נקייה בקוטר ארבעה אינץ' ונקו אותה עוד יותר באמצעות אוויר בלחץ כדי להסיר חלקיקי אבק. הרכיבו את הפרוסת על מעיל מסתובב ושחררו בעדינות כחמישה מיליליטר של התנגדות אור שלילית במרכז הוופל.

כדי לקבל שכבת photoresist בעובי 10 מיקרומטר, הגדר את הגדרות מעיל הסחיטה על 500 סל"ד למשך 30 שניות עם תאוצה של 100 RRP לשנייה לפיזור ראשוני, ואחריו סיבוב של 60 שניות ב -3, 000 סל"ד עם תאוצה של 500 סל"ד לשנייה. לאחר מכן, סובבו את הפרוסה. אופים את רקיק על צלחת חימום במשך שתי דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס.

לאחר שהפרוסה מתקררת, הרכיבו את הפרוסות בתא ההדפסה של מכונת הליתוגרפיה האופטית הימנית הישירה והזינו את מכלול הליפוזום בסיוע אוקטאנול או עיצוב OLA, לתוך התוכנה. לאחר הדפסת העיצוב, אפו את הוופל בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן ב-95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. כדי לשטוף את photoresist uncured, לטבול את רקיק בכוס זכוכית המכילה את הפתרון מפתח עד photoresist uncured מוסר במלואו.

אפו קשה את הוופל בחום של 150 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להבטיח שהעיצוב המודפס מחובר היטב למשטח הוופל ולא יורד בתהליך הייצור במורד הזרם. כדי להכין את המכשיר microfluidic, מניחים את רקיק המאסטר על חתיכה מרובעת של אלומיניום לעטוף את רדיד אלומיניום סביב רקיק, יצירת מבנה דמוי היטב. יוצקים בעדינות את תערובת PDMS על רקיק המאסטר.

דוגרים על ההרכבה בתנור בחום של 70 מעלות למשך שעתיים לפחות. הוציאו את רקיק המאסטר מהתנור ותנו לו להתקרר. כדי להסיר את הפולידימתילסילוקסאן המוצק, או בלוק PDMS, הסר את רדיד האלומיניום ולאחר מכן קלף בזהירות את בלוק PDMS מקצה רקיק.

קח מחליק כיסוי זכוכית שקוף, שפך כ -0.5 מיליליטר PDMS למרכז מגלשת הזכוכית, ופרש אותו על פני החלקת הכיסוי על ידי הטייה עדינה של מגלשת הזכוכית, הבטחת כיסוי מלא של מגלשת הזכוכית עם PDMS. הרכיבו את מגלשת הזכוכית על מעיל הסיבוב. ודא שהוא ממוקם במיקום מרכזי כך שמרכז המגלשה יחפוף למרכז פיר הלחץ.

לאחר מכן סובב את מגלשת הזכוכית במהירות של 500 סל"ד למשך 15 שניות בהפרש של 100 סל"ד לשנייה ו-1,000 סל"ד למשך 30 שניות בהפרש של 500 סל"ד לשנייה. הניחו את מגלשת הזכוכית המצופה PDM כשהצד המצופה פונה כלפי מעלה על משטח מוגבה כמו גוש PDMS בצלחת פטרי מכוסה. אופים אותו בחום של 70 מעלות במשך שעתיים.

הניחו את בלוק ה-PDMS כאשר התעלות החרוטות פונות כלפי מעלה ואת הזכוכית המצופה ב-PDM החליקו כאשר הצד המצופה פונה כלפי מעלה בתא הוואקום של שואב הפלזמה. הפעל את הוואקום וחשף את התוכן לפלסמת אוויר בתדר רדיו של 12 מגה-הרץ למשך 15 שניות כדי להפעיל את המשטחים. פלזמה חמצן ניתן לראות בצורה של גוון ורדרד.

מיד לאחר טיפול הפלזמה, הניחו את מגלשת הזכוכית המצופה PDMS על משטח נקי כאשר צד ה-PDMS פונה כלפי מעלה. הניחו בעדינות את בלוק ה-PDMS כאשר התבנית המיקרופלואידית פונה כעת לכיוון שקופית הזכוכית המצופה ב-PDMS, ומאפשרת להם להיקשר. אופים את המכשירים המלוכדים בחום של 70 מעלות במשך שעתיים.

יש לפזר 200 מיקרוליטר של 5% אלכוהול פוליוויניל, או תמיסת OVA, לתוך צינור של 1.5 מיליליטר ולחבר אותו למעמד המאגר המיקרופלואידי. הכנס את הצינור כך שקצה אחד שקוע בתמיסת PVA והקצה השני מחובר לכניסה של התעלה המימית החיצונית של המכשיר המיקרופלואידי. הגדל את הלחץ של הפאזה המימית החיצונית ל -100 מיליבר כדי להזרים את תמיסת PVA בתעלות המימיות החיצוניות.

הגדל את הלחצים של הפאזה המימית הפנימית והאורגנית נושאת השומנים ל-120 מיליבר כדי למנוע זרימה חוזרת של תמיסת PVA בתוך תעלות אלה. הזרימו את תמיסת ה-PVA באופן זה במשך כחמש דקות, תוך הבטחת תפקוד מלא של תעלת היציאה. הגדל את הלחץ בתעלות האורגניות והמיימיות הפנימיות נושאות השומנים לשני פסים כדי להסיר את תמיסת ה- PVA, ונתק מיד את הצינורית מהכניסה המימית החיצונית.

במקביל, השתמש בצינור המחובר לתעלת לחץ שלילי כדי להסיר עודפי PVA מתעלת היציאה. אפו את המכשיר בחום של 120 מעלות במשך 15 דקות ותנו לו להתקרר לפני השימוש. ניתן לאחסן את המכשיר בתנאי סביבה למשך חודש אחד לפחות.

מחלקים את התמיסות לשלושה צינורות 1.5 מיליליטר ומרכיבים אותם. חברו אותם לשבב המיקרופלואידי שטופל ב-PVA והפעילו לחץ חיובי על שלושת הערוצים, כ-100 מיליבר בתעלות האורגניות המימיות והליפידיות הפנימיות וכ-200 מיליבר בתעלה המימית החיצונית. ברגע שכל שלושת השלבים מתחילים לזרום יחד בצומת, יש לוודא שמתחיל ייצור תחליב כפול ולהתאים את הלחץ בהתאם לאיכותו.

ככל שטיפות התחליב הכפול זורמות, האוקטאנול כל הכיסים הופכים בולטים יותר ויותר ולבסוף נצבטים ויוצרים ליפוזומים. תמונת שדה בהיר של הדור המהיר של טיפות תחליב כפול מוצגת כאן. תעלת השומנים הפלואורסצנטית מראה היווצרות אוקטאנול בכל כיס עקב הרטבה חלקית.

התעלה המימית הפנימית מראה את האנקפסולציה של חלבון פלואורסצנטי צהוב. הרטבת כיס האוקטאנול בתעלת היציאה היוצרת ליפוזום מוצגת באיור זה. תמונה זו מייצגת את הסכמה של המעבר תלוי ה- pH של התמיסה ההומוגנית של פוליליזין ו- ATP העטופים בליפוזום לפוליליזין ATP coacervates מופרד פאזה.

הסביבה החומצית הראשונית בליפוזום הופכת את המטען המולקולרי של ATP לנייטרלי, ומעכבת את הקרישה ההדדית. כאשר ה- pH בתוך הליפוזומים מתאזן עם עליית ה- pH המיושמת חיצונית, ATP מקבל מטען שלילי, מה שגורם לקרישה הדדית. ההתפלגות המרחבית של פוליליזין והממברנה ותמונות הזמן של היווצרות פוליליזין ATP coacervates בתוך הליפוזומים מוצגים באיור זה.

המהדורה החיצונית של חיץ בסיסי מעלה את רמת ה- pH בתוך הליפוזומים במהלך דקות ויוזמת קו-סרבציה. T שווה אפס דקות מתייחס לזמן שלפני התרחשות אירוע הקרישה הראשון. תוך כדי הדגמת הליך, חיוני להתאים בסבלנות את לחץ הערוץ על מנת ליצור ייצור תחליב כפול קבוע.

OLA והווריאציות שלו שימשו במחקרים מגוונים, למשל, גדילה וחלוקה של ליפוזומים המבינים את הדינמיקה של עיבויים ביומולקולריים, ביטוי תאי של חלבון, כמו גם אנקפסולציה של חיידקים. אז במקביל, אנחנו מאמינים ש-OLA היא פלטפורמה רב-תכליתית לביולוגיה סינתטית.