ATAC-Seq ספציפי לאדיפוציט עם רקמות שומן באמצעות מיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות

ATAC-seq היא טכניקה רבת עוצמה להבנת מנגנוני ויסות ביטוי גנים. עם זאת, רקמת השומן קשה להשתמש בטכניקה זו בגלל תכולת השומנים הגדולה שלה, זיהום מיטוכונדריאלי גבוה, והטרוגניות תאית. בפרוטוקול זה, ריצוף ATAC ספציפי לאדיפוציט בוצע באמצעות מיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות, המפיק נתונים באיכות גבוהה עם זיהום DNA מיטוכונדריאלי מינימלי.

שיטה זו יכולה לשמש גם ברקמות אחרות שבהן קווי עכבר Cre ספציפיים לסוג התא זמינים עם תיוג גרעיני קווי כתב טרנסגניים. התחל את בידוד הגרעין על ידי קירור הזכוכית להקפיץ הומוגנייזרים על קרח עם אחת Dounce לכל דגימה. לאחר מכן, הוסף 7 מיליליטר של תערובת NPB לכל Dounce זכוכית.

לאחר מכן, מניחים 50 עד 100 מיליגרם של רקמת שומן קפואה בכוס Dounce, ולחתוך אותו לכמה חתיכות קטנות יותר באמצעות זוג מספריים ארוך. שבץ 10 פעמים עם מזיק רופף עבור כל הדגימות, ולאחר מכן 10 פעמים עם מזיק הדוק. סנן את התוכן דרך מסננת של 100 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר לפני העברת ההומוגנטים המסוננים לצינור 15 מיליליטר לצנטריפוגה.

לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS-N על ידי הקשה עדינה אך יסודית באצבעות. לאחר מכן, סנן את המתלה דרך מסננת 40 מיקרומטר לתוך צינור 50 מיליליטר ושטוף את המסננת עם 250 מיקרוליטר של PBS-N. העבר את התרחיף הגרעיני המסונן למיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות או לצינור FACS באמצעות מיקרופיפטה.

הכן את צינור האיסוף על ידי הוספת 500 מיקרוליטר PBS-N לצינור החדש של 1.5 מיליליטר, והפוך אותו מספר פעמים כדי להרטיב את כל המשטחים הפנימיים עם החיץ. סובבו בקצרה את הצינורות כדי להוריד את כל הנוזלים לפני שהניחו אותם על קרח עד למיון. עבור FACS, השתמש ב- FSC-A/FSC-H GATING עבור סינגלטים וב- FSC-A/SSC-A להסרת פסולת קטנה או גדולה.

שער לאוכלוסיית גרעיני האדיפוציט החיוביים mCherry/GFP, ולאסוף 10, 000 גרעינים בכל שפופרת איסוף שהוכנה קודם לכן. להכנת גרעין לאחר המיון, הוסף 500 מיקרוליטר של PBS-N לכל צינור איסוף וערבב אותו על ידי היפוך הצינור מספר פעמים לפני צנטריפוגה של צינורות האיסוף ב 200 G למשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר לחלוטין את הסופרנטנט.

כדי להכין 25 מיקרוליטר של תערובת האב Tn5, ערבבו 12.5 מיקרוליטר של חיץ DNA או חיץ TD עם תיוג 2x, 1.25 מיקרוליטר של טרנספוזאז Tn5 או אנזים TDE I, ו-11.25 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר Tn5 לכל גלולת גרעין והשהה אותה מחדש על ידי פיפטינג עדין. דוגרים ב-600 סל"ד למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באמצעות מערבל תרמי.

הוסף 25 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז ל -25 מיקרוליטר של תערובת תרחיף הגרעין Tn5 מה שהופך את הנפח הסופי של 50 מיקרוליטר. לאחר מכן, להוסיף 250 מיקרוליטר של PB חיץ ו 5 מיקרוליטר של 3 M נתרן אצטט עם pH 5.2. לאחר העברת התערובת לעמוד שסופק עם הערכה התייחסות, צנטריפוגה אותו ב 17, 900 גרם במשך 1 דקה בטמפרטורת החדר.

לאחר השלכת הזרימה, החזירו עמודת ספין לאותו צינור איסוף. הוסף 750 מיקרוליטר של PE חיץ המכיל אתנול מוחלט לצינור. צנטריפוגו את העמודה, השליכו את הזרימה והחזירו את עמוד הסחרור לאותו צינור איסוף.

צנטריפוגה את הצינור, ולהשליך את צינור האיסוף עם הזרימה. כדי להגביר את מקטעי הדנ"א שהועתקו, הכינו את תערובת האב PCR מבלי להוסיף Ad2 ייחודי. n פריימר ברקוד.

הפעל את ה- PCR. הפעל את ה- PCR הכמותי או qPCR. בדוק את עקומות ההגברה וזהה את מספר מחזורי ה- PCR הנוספים הדרושים על ידי הערכת מספר המחזורים שהגיע לכ- 35% מהמקסימום.

השתמש בחישובים כדי להפעיל את ה- PCR עבור 45 המיקרוליטרים הנותרים של תגובת ה- PCR. באמצעות ההליכים המוקדמים יותר, לנטרל את מקטעי ה- DNA המוגברים עם 20 מיקרוליטר של EB חיץ. העבר את ה- DNA המדולל לצינור PCR חדש והתאם את עוצמת הקול ל- 100 מיקרוליטר על ידי הוספת 80 מיקרוליטר של EB חיץ. לאחר מכן, מוסיפים 55 מיקרוליטר של חרוזי SPRI ומערבבים על ידי pipetting. לאחר 5 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, יש להפריד אותו על מעמד מגנטי קטן למשך 5 דקות.

לאחר שתסיים, להעביר 150 מיקרוליטר של supernatant לצינור PCR חדש, להוסיף 95 מיקרוליטר של חרוזי SPRI, ולערבב על ידי pipetting. דוגרים על התגובה במשך 5 דקות לפני הפרדת החרוזים על המעמד המגנטי הקטן. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות ושטפו את החרוזים במשך דקה אחת באמצעות 200 מיקרוליטר של 70% אתנול.

חזרו על שתי שטיפות נוספות. לאחר השטיפה הסופית, צנטריפוגה את הצינורות ב 1000 G במשך 1 דקה. פיפטה החוצה את יתרת האתנול ולייבש את הגלולה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות על מכונת PCR עם מכסה פתוח.

לאחר הייבוש, להשהות את הגלולה ב 20 מיקרוליטר של EB חיץ על ידי pipetting ולדגור את הצינור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הפרידו את החרוזים למשך 5 דקות על המעמד המגנטי הקטן לפני העברת 18 מיקרוליטר של הסופרנאטנט המכיל את הספרייה הסופית לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. גרעיני האדיפוציט המסומנים ב-mCherry וב-GFP נבדלו מגרעיני התאים האחרים שבודדו מרקמות השומן של עכבר Adipoq-NuTRAP.

בהתאם לסוג מחסן השומן, ההבדל הוא של כ 50% ב- eWAT, 30% ב- iWAT ו- 65% ב- BAT נצפו בשברי האדיפוציט. הדגימות שדרשו יותר מ-15 מחזורי PCR הצביעו על דגימות באיכות נמוכה. ניתוח התפלגות הגודל של ספריות ATAC-seq הדגים פסגות מרובות המתאימות לאזור נטול הנוקלאוזומים, או NFR, ומונו, די ורב-נוקלאוזומים עם גדלים ממוצעים של כ-500 עד 800 זוגות בסיסים.

דגימות באיכות ירודה הראו בדרך כלל בעיקר NFR ללא פסגות נוקלאוזומליות או מעטות. בדיקות האיכות של ניתוח qRT-PCR הראו העשרה של פי 10 עד פי 20 עם היסודות הגנומיים החיוביים ליד גנים של סמן אדיפוציט כגון Adipoq, Fabp4, Plin1 ו- Pnpla2, בעוד שלא הודגמה העשרה עם הבקרה השלילית. ההעשרה עם הגן התרמוגני Ucp1 נצפתה במיוחד ב- BAT.

הקריאות במיטוכונדריה היו פחות מ-2% והשבר מתחת לפסגות היה בערך 18%עד 44%פסגות חזקות מרובות עם יחסי אות לרעש גבוהים התגלו ליד גנים של סמן אדיפוציט כגון Adipoq, Fabp4 ו-Plin1 מכל מחסני השומן. פסגות ATAC-seq חזקות נצפו בסמן האדיפוציט החום Ucp1 locus בדגימת BAT. הגורם הקריטי ביותר לפרוטוקול זה הוא איכות הגרעין.

חשוב להשתמש בדגימות רקמה איכותיות ולטפל בעדינות בגרעינים לאורך כל הניסוי, במיוחד במהלך השעיה לאחר צנטריפוגה ומיון. חשוב לזכור שהפרוטוקול הזה מסתמך על עכברי כתב טרנסגניים עם תיוג גרעיני. עכברי NuTRAP שימשו כאן, אך ניתן להשתמש בכל מערכת דומה.

בעזרת נתוני FACS שלנו, ניתן לבצע ניתוח חישובי מרובה כדי למצוא גורמי שעתוק מרכזיים המווסתים ביטוי גנים בסביבות ביולוגיות.