פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) מרקמות הצמח. PSI יחד עם PSII אחראי על המרת אור לאנרגיה כימית בפוטו-אוטוטרופים חמצניים ויש לו יעילות קוונטית של ~1, מה שהופך אותו ליעד לחקר העברת אנרגיה מונעת אור.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) מרקמות הצמח. PSI יחד עם PSII אחראי על המרת אור לאנרגיה כימית בפוטו-אוטוטרופים חמצניים ויש לו יעילות קוונטית של ~1, מה שהופך אותו ליעד לחקר העברת אנרגיה מונעת אור.
שיטה זו משמשת לבידוד מערכת פוטו-סיסטם I (PSI) יחד עם קומפלקס קצירת האור I (LHCI), האנטנה המקורית שלה, מצמחים. PSI-LHCI הוא קומפלקס חלבון ממברנה גדול המתאם מאות גורמי קצירת אור והובלת אלקטרונים והיא מערכת קצירת האור היעילה ביותר שנמצאת בטבע. פוטונים הנספגים על ידי ארבעת חלבוני האנטנה של LHCA המרכיבים את LHCI מועברים באמצעות אינטראקציה אקסיטונית למרכז תגובת הליבה של PSI ומשמשים כדי להקל על הפרדת מטען מונעת אור על פני קרום התילקואיד, ומספקים כוח ואנרגיה מפחיתים לקיבוע פחמן באורגניזמים פוטו-אוטוטרופיים. היעילות הקוונטית הגבוהה של PSI הופכת את המתחם הזה למודל מצוין לחקר העברת אנרגיה מונעת אור. בפרוטוקול זה, רקמת הצמח הומוגנית מכנית, והכלורופלסטים מופרדים מהפסולת התאית בתפזורת על ידי סינון וצנטריפוגה. לאחר מכן הכלורופלסטים המבודדים עוברים ליזה אוסמוטית, וממברנות התילקואיד משוחזרות באמצעות צנטריפוגה ומסיסות באמצעות חומר הניקוי n-dodecyl-beta-maltoside. החומר המסיס נטען על עמוד חילופי אניונים כדי לאסוף את רוב הקומפלקסים המכילים כלורופיל. קומפלקסים גדולים יותר משקעים מהתמיסה, מושעים מחדש בנפח קטן ונטענים על שיפועי סוכרוז כדי להפריד בין הקומפלקסים העיקריים המכילים כלורופיל. שברי שיפוע הסוכרוז המתקבלים מאופיינים לזיהוי רצועת העניין המכילה PSI-LHCI. פרוטוקול זה דומה מאוד לפרוטוקול המשמש להתגבשות PSI-LHCI של הצמח עם כמה פישוטים ומסתמך על שיטות שפותחו במהלך השנים במעבדתו של נתן נלסון.
פוטוסינתזה חמצנית היא אחת התגובות הכימיות החשובות ביותר על הפלנטה שלנו. המרת האור לאנרגיה כימית מתרחשת במרכזי התגובה של שתי מערכות פוטו, מערכת פוטו-סיסטם I (PSI) ופוטו-סיסטם II (PSII)1 (איור 1A). PSI הוא קומפלקס פיגמנט-חלבון גדול ושמור מאוד שהתפתח לפני למעלה מ-3.5 מיליארד שנים 2,3. קומפלקס זה, המכיל כ-100 מולקולות כלורופיל וכ-20 קרוטנואידים, מקל על העברת אלקטרונים על פני קרום התילקואיד מפלסטוציאנין לפרדוקסין המשמש כמקבל האלקטרונים הסופי של שרשרת הובלת האלקטרונים הפוטוסינתטית 1,4,5<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. הכנת ממברנות תילקואיד מעלי תרד
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול זה משמש לבידוד ואפיון PSI-LHCI פעיל מרקמות הצמח במשך שלושה ימים. PSI-LHCI מטוהר על ידי בידוד תחילה של ממברנות תילקואיד צמחיות אשר לאחר מכן מסיסות באמצעות β-DDM. תשואות אופייניות משלב הכנת הממברנה הן 200 מ"ג כלורופיל מ -500 גרם עלים. זה יכול להשתנות בהתאם לחומר הראשוני בו נעשה שימוש.
הימים השני והשלישי של הניסוי משתמשים בכרומטוגרפיה של חילופי אניונים ובצנטריפוגה של שיפוע סוכרוז כדי להפריד את קומפלקסי החלבון השונים בתוך קרום התילקואיד. לאחר המסה ואולטרה-צנטריפוגה, כדור קטן כהה ובלתי מסי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטהר את קומפלקס PSI-LHCI מרקמות הצמח במצבו הפעיל. כאן נעשה שימוש בעלי תרד, אך ניתן ליישם שיטות אלה על תכשירים מצמחים שונים23,40. בכל המקרים, יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע פרוטוקול זה כדי להגן על המתחם מפני נזק. הכנה זו צריכה להיעשות בחושך או תחת אור ירוק, על קרח עם מאגרים מקוררים מראש, ויש לבצע את כל שלבי ההשעיה מחדש בעדינות.
במהלך בידוד תילקואיד, צנטריפוגה יעילה וזהירה ושלבי השע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
י.מ. מכיר בתמיכת הקרן הלאומית למדע תחת פרס מס' 2034021 ומשרד האנרגיה של ארה"ב, משרד המדע, המשרד למדעי האנרגיה הבסיסיים, המחלקה למדעי הכימיה, מדעי הגיאוגרפיה ומדעי הביולוגיה תחת פרס מס. דה-SC0022956. C.G. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מס' 00036806.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור בז 15 מ"ל | VWR | 62406-200 | משמש לאחסון תילקואידים |
| ביו ראד Econo-Column 1.5 X 30 ס"מ | biorad | 7374153 | |
| בד גבינה בדרגה 50, 100% כותנה | Arkwright LLC | B07D1FZZMB | ממוטות זכוכית של אמזון |
| Millipore Sigma | BR135825 | כל מוט דומה יספיק | |
| בלנדר ויטמיקס בפרופיל נמוך 64 אונקיות | Vitamix | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| צינורות צנטריפוגה פוליאלומר פתוחים | Seton Scientific | 5030 | |
| Optima XE Ultracentrifuge | beckman coulter | A94471 | |
| פוליאתילן גליקול 6,000 | Hampton Research | HR2-533 | |
| מטחנת רקמות פוטר-אלבהיין, 30 מ"ל. | WHEATON | 358049 | |
| סוכרוז | סיגמא-אולדריץ' | S7903 | |
| SW 40 Ti | בקמן קולטר | 331301 | |
| TOYOPEARL DEAE-650C | Tosoh Bioscience | 7988 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| β-DDM | Glycon - Biochemicals GmbH | D97002 | מאוחסן כ-10% מלאי ב-20 מעלות; ג |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב