מודל עכברי של פיברוזיס כרוני בכבד לחקר אטרזיה של המרה

השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי ליצור מודל עכבר עקבי יותר עם השינויים הפתולוגיים של אטרזיה המרה. טכניקה זו יכולה לדמות את הסימפטומים של אטרזיה מרה חריפה וכרונית, אשר מועילה למחקר עתידי של מנגנוני המחלה. לאחר השימוש בנוגדנים, זמן ההישרדות של העכברים התארך והתסמינים הוקלו, מה שמרמז על ההשפעה הטיפולית של נוגדנים על אטרזיה של המרה.

לאחר חלוקת עכברי היילודים לקבוצות שונות, כמתואר בכתב היד, יש לטפל בכל עכבר בזריקה תוך-צפקית של חמישה מיקרוגרם נוגדנים נגד Ly6G ארבע שעות לפני הזרקת rhesus rotavirus או RRV כדי לרוקן תאים חיוביים ל-Gr1. בתוך 24 שעות לאחר הלידה, intraperitoneally להזריק את העכבר יילוד עם 20 מיקרוליטר של rhesus rotavirus או מלוחים. לאחר הזרקת RRV, לנהל 20 מיקרוגרם של נוגדן anti-Ly6G לתוך הבטן של העכבר.

בדוק ותעד את המראה, המשקל וההישרדות של כל העכברים מדי יום. להזרקה intraperitoneal, לחשוף את הבטן של העכבר הצעיר על ידי צביטת עור הצוואר עם האצבע המורה ואת האגודל של יד אחת בעדינות מחזיק את הרגליים האחוריות של העכבר עם אצבע הטבעת ואת אצבע הזנב. הרימו את מחט המזרק בשיפוע כלפי מעלה והכניסו את המחט לירך האמצעית של רגל ימין אחורית של העכבר בזווית של 15 מעלות עם העור.

תוך כדי הזזת המחט לאורך השביל התת עורי עד שהיא מגיעה לקצה הקוסטלי הימני של העכבר, כוונו את המחט מטה לתוך חלל הבטן והזריקו את הנוזל מתחת לכבד של העכבר. משוך את המחט החוצה מיד לאחר ההזרקה. יש לצפות לדימום או דליפה באתר ההזרקה.

לאחר הרדמת העכבר ביום ה -12, לנתח אותו תחת מיקרוסקופ. הכנס מזרק אינסולין של מיליליטר לחדר השמאלי של הלב כדי לאסוף דם. צנטריפוגו את הדם ב-400 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, והפרידו את הסרום למדידות תפקודי כבד.

נתחו את כבד העכבר והטחול מהרקמות הסובבות אותו באמצעות מספריים ופינצטה. צלם את המראה הכללי של הכבד וצינור המרה. לאחר הרדמה בשאיפה, יש לחשוף את הכבד, כיס המרה וצינורות המרה החוץ-כבדיים בעזרת מספריים וצמר גפן.

תחת מיקרוסקופ יציבה, הזריקו חמישה עד 10 מיקרוליטרים של הצבע הפלואורסצנטי רודאמין 123 לכיס המרה עם מזרק אינסולין של מיליליטר וצלמו. טבלו רקמת כבד עכבר טרי ב-10% פורמלין למשך 24 שעות. לאחר שהרקמה מוטמעת בפרפין, השתמשו במיקרוטום פרפין כדי לחתוך את גוש הפרפין למקטעים בעובי של ארבעה מיקרומטרים, והניחו שני מקטעים עוקבים על אותה שקופית.

לאחר מכן הכניסו את הפרוסות למדף חיתוך, הסירו את השעווה מקסילן, והלחינו אותן ברצף באתנול מוחלט, 95% אתנול, 80% אתנול, 70% אתנול ומים מזוקקים במשך חמש דקות כל אחת. מכתימים את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך חמש דקות, ומשרים אותם בחומצה הידרוכלורית 1% ו-75% אלכוהול למשך חמש שניות. לאחר שטיפת החלקים במים נקיים, הכתימו אותם בתמיסת אאוסין למשך דקה.

הכינו את חלקי הרקמה לצביעה, כפי שהודגם קודם לכן, ובצעו תיקון אנטיגן עם חיץ Tris-EDTA. מחממים את החלקים במיקרוגל ב-95 מעלות למשך 10 דקות, ואז מוציאים ומקררים אותם באופן טבעי לטמפרטורת החדר. כדי להסיר פרוקסידז אנדוגני, הניחו את חלקי הרקמה במי חמצן 3% למשך 10 דקות, וטפלו בפרוסות עם סרום עיזים 5% כדי לחסום קשירה לא ספציפית.

לאחר מכן, הוסיפו נוגדן חד-שבטי ראשוני נגד עכבר Cytokeratin 19 או נוגדן חד-שבטי F4/80 נגד עכבר לחלקים, ודגרו במשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לדגור על החלקים עם נוגדנים משניים מתאימים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש 3, 3-prime-diaminobenzidine כסוכן כרומוגני כדי לבחון את התגובה הכרומוגנית תחת המיקרוסקופ.

התבוננו בפרוסות תחת מיקרוסקופ 40x כדי לקבל תמונות ולנתח אותן לפי הצורך. לאחר הכנת חלקי הרקמה ומוכתמים בהמטוקסילין, כסו כל רקמה ב-50 מיקרוליטר של תמיסת צבע אדום סיריוס בטמפרטורת החדר למשך שעה. יבשו את המגלשות באופן טבעי בטמפרטורת החדר במשך ארבע שעות, הוסיפו טיפת מסטיק ניטרלי לכל מגלשה, והשתמשו בהחלקת כיסוי כדי לכסות את הרקמה כדי למנוע בועות.

השאירו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי למצק את המסטיק הניטרלי. התבונן בפרטי שקיעת הקולגן באמצעות מיקרוסקופ אור ניגודיות מקוטב. בחרו שדה ראייה ברור ומתאים, והתאימו את הבהירות והאיזון הלבן של שדה הראייה של המיקרוסקופ.

קבל תמונות ונתח אותן לפי הצורך תחת מיקרוסקופ 40x. לאחר הזרקת RRV, זמן ההישרדות החציוני בקבוצת RRV היה 13 ימים. רוב העכברים שטופלו בנוגדן פיתחו צהבת קלה ולא נצפתה ירידה במשקל.

הכבדים של עכברי BA הראו נגעים נמקיים ומקטע חוץ-כבד של אטרזיה של צינור המרה. גודל הכבד קטן יותר מהביקורת. ניתוח היסטולוגי הראה כי טיפול במינון נמוך נגד Ly6G הפחית את דלקת הוורידים הפורטליים.

הצטברות תאים דלקתיים עדיין נצפתה בפרוסות רקמת הכבד ביום 42. ביום ה-12 נצפתה עלייה קלה בשקיעת הקולגן באזור הפורטל. ביום ה-42 ביטוי הקולגן עלה משמעותית, ונצפתה שקיעת קולגן משמעותית ברקמת BA.

התאים החיוביים ל-CK19 נצפו ביום ה-12. ביום ה-42, מספר התאים החיוביים ל-CK19 עלה, אך היו מעט צינורות מרה בוגרים. צינור המרה החוץ-כבד בעכברי BA כרוניים היה חסום והיו לו חדירות דלקתיות של מיקרופאגים.

רמות ALT ו-ALP בכבד היו גבוהות יותר בקבוצת BA כרונית מאשר בקבוצת הביקורת הרגילה. רמות הבילירובין הכולל, הבילירובין הישיר והבילירובין העקיף עלו, מה שמצביע על כך שתפקוד הכבד הופחת משמעותית בשלב הפיברוזיס הכרוני של BA. הזריקה צריכה להיעשות בזהירות כדי לא לנקב את כבד העכבר. לאחר ההזרקה, אנחנו צריכים לקחת בערך 10 שניות כדי לבחון את מצב העכבר ולנקות את הדם מן הפצע.