כימות ואפיון גנום שלם של RNA SARS-CoV-2 בדגימות שפכים ואוויר

אפידמיולוגיה מבוססת שפכים משמשת כיום כהשלמה לאסטרטגיות בקרת COVID-19 ברחבי העולם על ידי איתור RNA נגיפי בדגימות שפכים וזיהוי התפרצויות פוטנציאליות. טכניקה זו מספקת תמונת מצב כלל אוכלוסייתית של שכיחות COVID-19 בקהילה שלנו, הכוללת מקרים א-סימפטומטיים. דגימת אוויר היא גם תוספת חשובה לפרוטוקול זה.

אבחון קליני הוא עדיין הדרך המדויקת ביותר לנהל התפרצויות מחלות ומגפות. עם זאת, טכניקה זו עדיין שימושית כהשלמה לה. שיטה זו כוללת שלבים רבים ונקודות קריטיות.

הדגמה חזותית היא חיונית, שכן היא תאפשר למעבדות שאינן בקיאות כל כך בביולוגיה מולקולרית לשכפל את ההליך. כדי להתחיל, לאסוף ליטר אחד של דגימת שפכים מרוכבים 24 שעות ביממה. ספייק 20 מיקרוליטר של mengovirus לתוך 70 מיליליטר של הדגימה.

לאחר צנטריפוגה של הדגימה ב 700G במשך 10 דקות, לרכז את supernatant שנוצר באמצעות מכשיר אולטרה סינון צנטריפוגלי עם חיתוך של 10 קילודלטון על ידי צנטריפוגה. הצהירו את התרכיז על ידי צנטריפוגה ב-700G למשך 40 דקות, והיפוך המיקום של מכשיר האולטרה-סינון. השתמש בתרכיז שהתקבל למיצוי RNA.

כדי לאסוף את דגימות האוויר, הניחו חרוט סטרילי בדוגם האוויר לפני תחילת האיסוף. לאחר סיום הדגימה, חלצו RNA מה-PBS השטוף של החרוט באמצעות ערכת מיצוי RNA נגיפית מסחרית או בשיטה פנימית. הכינו את תערובת האב לתגובה עבור כל מטרה, מנגו-וירוס, SARS-CoV-2, N1 ו-N2 גנים במכסה מנוע נקי בחדר ההתקנה של המגיב.

ערבבו את תערובת הפריימרס-בדיקה והאנזים על ידי היפוך חמש פעמים או מערבולות פולסים. שומרים את צינורות המיקרוצנטריפוגות במדף קר, מוציאים 15 מיקרוליטר מהתערובת לצינורות PCR רצועה או צלחת PCR 96 באר המונחת על מדף קירור. מכסים את הצלחת ומעבירים אותה לאזור הטיפול בחומצות גרעין.

מערבלים בעדינות אליציטוט של הרנ"א המופק למשך חמש שניות. פיפטה חמישה מיקרוליטרים של RNA לתערובת התגובה לעשות 25 מיקרוליטר ולהתחיל את RT-qPCR. בצלחת PCR, פיפטה 16 מיקרוליטר של כל דגימה למיקומה על הצלחת, ולהוסיף ארבעה מיקרוליטרים של חמש פעמים שעתוק לאחור או תערובת מאסטר RT.

לאחר מכן התחל את תגובת ה- PCR. לאחר מכן, הכינו 10 דילולים מיקרומולאריים של כל ערכת פריימר ואת תערובת המאסטר עבור כל סט פריימרים. בצלחת PCR חדשה, פיפטה 20 מיקרוליטר של תערובת המאסטר, ולאחר מכן חמישה מיקרוליטרים של דגימת RT לכל תערובת.

לאחר כיסוי הצלחת, התחל את תגובת ה- PCR. ברגע שה-PCR מתגבר, סובבו את הצלחת ב-1000 גרם למשך 15 עד 30 שניות. לטיהור PCR, הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב מבוסס חרוזים לכל באר וערבב על ידי פיפטינג כדי להמשיך עם ההפרדה המגנטית.

הסירו את הצלחת מהמעמד המגנטי. השהה כל גלולה עם 15 מיקרוליטר מים בדרגת PCR ודגר על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. הניחו את הצלחת בחזרה על המעמד המגנטי והניחו לחרוזים לגלול במשך שתי דקות.

לאחר מכן יש בזהירות פיפטה של 15 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מכל דגימה לצלחת PCR חדשה. לאחר מכן, להכנת הספרייה, הוסיפו 1.75 מיקרוליטר של חיץ תגובה מערכת הכנת ספריית הדנ"א ו-0.75 מיקרוליטר של תערובת אנזימים לכל דגימה. סובבו לזמן קצר את הצלחת המכוסה וסובבו מטה ב-1000G למשך 15 עד 30 שניות.

דוגרים במשך חמש דקות ב-21 מעלות צלזיוס וחמש דקות ב-65 מעלות צלזיוס. פיפטה שלושה מיקרוליטרים של מים בדרגת PCR עבור כל דגימה לצלחת PCR חדשה. הוסף 0.75 מיקרוליטר של הדגימות המוכנות ו -1.25 מיקרוליטר של ברקודים להכנת רצף הספרייה.

לאחר מכן להוסיף חמישה מיקרוליטרים של T4 DNA ליגאז מאסטר לערבב היטב על ידי pipetting. לאחר סיבוב הצלחת בצנטריפוגה, דוגרים על הצלחת ב-21 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, וב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר איגום כל הדגימות, להוסיף 192 מיקרוליטר של מגיב מבוסס חרוזים לבריכה לטיהור PCR.

מערבבים היטב על ידי פיפטינג ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי. חכו שהסופרנאטנט יתנקה וייווצר כדור חרוז.

הסר את הסופרנאטנט ואת הצינור מהמעמד המגנטי. מוסיפים 700 מיקרוליטר של חיץ השבר הקצר או SFB ומערבבים על ידי פיפט. הניחו את הצינור בחזרה על המעמד המגנטי והמתינו עד שהגלולה תיווצר והנוזל יתנקה.

השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפט. מוסיפים 35 מיקרוליטר מים בדרגת PCR לצינור, מערבבים על ידי צנרת ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. הניחו את הצינור על המעמד המגנטי והניחו לחרוזים להתנקות ולנוזל להתנקות.

פיפטה 35 מיקרוליטר של supernatant לצינור חדש. לאחר מכן, הכינו את תערובת תגובת הקשירה של המתאם כמתואר בכתב היד של הטקסט, ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. ערבבו 20 מיקרוליטר של מגיב מבוסס חרוזים לתערובת תגובת הקשירה לטיהור PCR, ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

מניחים את הצינור על המעמד המגנטי ומחכים שגלולת החרוז תיווצר והסופרנאטנט יהפוך לחסר צבע. בזהירות להשליך את supernatant על ידי pipetting. ערבבו 125 מיקרוליטר SFB לתוך הצינור והניחו אותו בחזרה על המעמד המגנטי כדי להפריד בין החרוזים.

כאשר הנוזל הופך צלול, השליכו את הסופרנאטנט וחזרו על הוספת SFB כפי שהודגם קודם לכן. השאירו את הצינור על המעמד המגנטי פתוח למשך 30 שניות. מוסיפים 15 מיקרוליטר של חיץ elution ומערבבים היטב על ידי pipetting.

לאחר סיבוב קצר למטה ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, מניחים על המעמד המגנטי למשך שתי דקות. פיפטה 15 מיקרוליטר של supernatant לתוך צינור קישור נמוך חדש כדי למדוד את הריכוז עם ערכת כימות DNA פלואורומטרית. לאחר מכן, הכנס את תא הזרימה למכשיר ריצוף ה- DNA וה- RNA בזמן אמת.

הכנס את קצה פיפטה 1, 000 מיקרוליטר להגדיר 200 מיקרוליטר לתוך היציאה priming. סובב את גלגל הגדרת עוצמת הקול כדי להגביר את עוצמת הקול עד שתראה את הנוזל בקצה, ולאחר מכן השליך את הקצה. הוסיפו 800 מיקרוליטר של תערובת הפריימינג ליציאת הפריימינג ללא בועות והמתינו חמש דקות.

פיפטה 200 מיקרוליטר של הספרייה מתערבבים לתוך יציאת הפריימינג. סגור את יציאת הכיסוי ואת יציאת הפריימינג. התחל את ניסוי הריצוף בתוכנה ובחר Base Calling On.שיטה זו זיהתה וכימה RNA SARS-CoV-2 בדגימות שפכים ואוויר.

לדגימות השפכים הייתה סטיית תקן מ-1.91% ל-13.98% בקרב הטריפליקטים, והן נעו בין 3.05 כפול 10 לשלוש עד 2.83 כפול 10 לשמונת עותקי הגן לליטר. דגימות האוויר נעו בין 6.17 כפול 10 לשלוש עד 5.48 כפול 10 עד תשע, כאשר סטיית התקן בכפילויות נעה בין 0.54% ל -10.95% כמתואר בפרוטוקול זה, הדגימות רוצפו, ודוגמה לשלוש תוצאות מדגם מרוצפות מסוכמת כאן. בכל שלוש הדגימות, השושלת BA.5.

x הוקצה כנפוץ ביותר על ידי הכלי Freyja. ריכוז דגימות השפכים הוא שלב מכריע שכן RNA נגיפי נמצא בריכוזים נמוכים במי שפכים. ולכן שלב זה הוא בסיסי לזיהוי וכימות מדויקים.

הליך זה יכול להיות מותאם באמצעות פריימרים שונים בפרוטוקול RT-qPCR כדי לשמש כדי לזהות ולכמת גורמים זיהומיים אחרים. הטכניקה כימתה במדויק את SARS-CoV-2 בדגימות שפכים ואוויר. פתוגנים שונים ניתן לזהות ולכמת ממקומות שונים.