Name: ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למדו את שיטת שיקוע חלב דל שומן לריכוז נגיפי RNA מדגימות מים ושפכים סביבתיים. שיטה זו יעילה, זולה ונוחה לשימוש בהשוואה לאולטרה-סינון, ומאפשרת חילוץ חומצות נוקליאיניות לניתוח מולקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NSERC Alliance Covid-19 Grant (פרס מס '431401363, 2020-2021, ד"ר יואן ואויגווארי-דיאז). MUD רוצה להודות לתוכנית מענקי המחקר של האוניברסיטה (פרס מס '325201). הן JF והן JZA נתמכים על ידי תוכנית ההכשרה לתואר שני בניתוח מחלות חזותי ואוטומטי (VADA). KY ו-JF קיבלו שניהם מלגות מתוכנית Mitacs Accelerate. MUD וחברי המעבדה שלו (KY, JF, JZA) נתמכים על ידי NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ומענק החוקר החדש של מחקר מניטובה (No 5385). תודה מיוחדת לעיר ויניפג, מניטובה. מחקר זה נערך באוניברסיטת מניטובה. ברצוננו להכיר בכך שהקמפוסים של אוניברסיטת מניטובה ממוקמים על האדמות המקוריות של עמי אנישינבג, קרי, אוג'י-קרי, דקוטה ודיין ועל מולדת אומת מטיס.

1. השוואה בין אולטרה-סינון סדרתי לבין פלוקולציית חלב דל שומן לריכוז וירוסים בדגימות שפכים
<ol><li>הכנת דוגמאות<ol><li>יש לאסוף 2 ליטר של דגימות שפכים מרוכבים (משפיעים) ביחס זרימה של 24 שעות. דגימות נאספו משלושת מתקני טיהור השפכים הגדולים בוויניפג, קנדה, במהלך הקיץ והסתיו של 2020 (טבלה 1).</li>
		<li>העבירו את הדגימות למעבדה בבקבוקים חסיני אור בארגז קרח ועבדו אותן תוך 24 שעות. איסוף נתונים פיסיקליים-כימיים וביולוגיים של שפכים.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקות ריכוז וירוסים הערה: שיטת אולטרה-סינון רציפה ושיטת פלוקולציה אורגנית, כלומר פלוקולציית חלב דל שומן (SMF), יושמו כדי להעריך את יעילות ההתאוששות הכוללת של כל שיטה באמצעות RNA משוריין כוירוס בדיקה23. חוקרים אחרים השתמשו גם ב-RNA משוריין כנגיף בקרה להערכת התאוששות שיטות ריכוז לנגיפים עוטפים, כמו המשפחה Coronaviridae22,24,25,26.<ol><li>להוספת RNA משוריין, הגדר את נפחי בדיקת השפכים לשיטות אולטרה-סינון ו-SMF כ-140 מ"ל ו-500 מ"ל, בהתאמה. באמצעות פיפטור, ספייק 5 x 104 עותקים של RNA משוריין לשש דגימות שפכים מתוקים שנאספו בתאריך אחד ושש דגימות שפכים מתוקים בתאריך אחר, עבור כל שיטת אולטרה-סינון; יתר על כן, ספייק שש דגימות שפכים מאוחסנות (ב -4 מעלות צלזיוס) שנאספו בתאריך שלישי, מאוחר יותר, ועובדו ימים לאחר מכן עבור SMF. הערה: כל אחת משש ערכות הדגימות שנאספו בתאריכים שונים הורכבה משתי דגימות מכל אחד משלושת WWTPs. במחקר שלנו, הקבוצה הראשונה של דגימות שפכים מתוקים נאספה ב-8 ביולי 2020, השנייה ב-30 בספטמבר 2020, ודגימות השפכים יאוחסנו עבור SMF ב-14 באוקטובר 2020.</li>
		<li>יש לערבב במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לחסן וליצור הומוגניות של הרנ"א המשוריין בדגימות באמצעות מערבל מגנטי.</li>
		<li>הסר את כל החלקיקים או התאים הגדולים מ- 0.2 מיקרומטר ובצע אולטרה-סינון.<ol><li>סננו את דגימות השפכים הקוצניים (120 מ"ל מכל דגימה של 140 מ"ל) דרך בד גבינה וקשירה דלת חלבון, 0.45 מיקרומטר ו-0.2 מיקרומטר, מסנני דיסק ממברנות בקוטר 47 מ"מ, בהתאמה, כדי להסיר חלקיקים גדולים, משקעים, איקריוטים וחיידקים27. עבד את הדגימות המסוננות באמצעות שיטות אולטרה-סינון המתוארות להלן. הערה: דגימות השפכים שנאספו ב-8ביולי וב-30 בספטמבר שימשו לשיטותאולטרה-סינון עם 3,000 x g ו-7,500 x g, בהתאמה.</li>
			<li>עבור אולטרה-סינון רציף ב-3,000 x g (UF-3k x g), רכז סך של 120 מ"ל של דגימת הבדיקה שנאספה בתאריך הראשון ב-3,000 x g למשך 30 דקות על-ידי טעינת 60 מ"ל של הדגימה פעמיים לכ-5 מ"ל באמצעות התקן צנטריפוגלי מסוג A, 30-kDa. לאחר מכן, רכז את נפח 5 מ"ל ב- 3,000 x גרם למשך 30 דקות באמצעות התקן צנטריפוגלי מסוג B, 30-kDa, ל- 500-1,200 μL.</li>
			<li>עבור אולטרה-סינון רציף ב-7,500 x גרם (UF-7.5k x g), שנה את מהירות הצנטריפוגה עבור המכשיר הצנטריפוגלי של המותג B מ-3,000 x g ל-7,500 x g כדי לקבל נפחים סופיים קטנים יותר, בהתאם להמלצות היצרן, ולשמור על מהירות הצנטריפוגה של המכשיר הצנטריפוגלי של המותג A זהה. הערה: הבדיקות בוצעו עם הדגימות שנאספו ב-30 בספטמבר.</li>
		</ol></li>
		<li>עבור SMF, בצע את השלבים המפורטים להלן.</li>
		<li>יש להקפיץ את דגימות השפכים (500 מ"ל כל אחת) לריכוז ישיר באמצעות פרוטוקול SMF16,18, ללא סינון מוקדם עם בד גבינה ומסנני דיסק קשירה דלת חלבון, כמתואר להלן.</li>
		<li>יש להמיס 0.5 גרם אבקת חלב דל שומן ב-50 מ"ל מי ים סינתטיים לקבלת תמיסת חלב דל שומן במינון 1% (w/v) ולהתאים בזהירות את רמת החומציות של התמיסה ל-3.5 באמצעות 1 N HCl. הערה: החמצה גורמת לנגיפים להצטבר ולזרז מחוץ למים עקב השינוי בנקודה האיזואלקטרית שלהם16 ומשפרת את המסיסות של אבקת חלב28.</li>
		<li>הוסף 5 מ"ל של תמיסת חלב דל שומן ל 500 מ"ל של דגימות שפכים גולמיים כדי לקבל ריכוז סופי של חלב דל שומן של 0.01% (w / v).</li>
		<li>מערבבים את הדגימות במשך 8 שעות במהירות בינונית ומאפשרים לפלוקים שנוצרו להסתפק בעוד 8 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר את supernatants בזהירות באמצעות פיפטות סרולוגיות מבלי להפריע flocs התיישבו. העבר נפח סופי של 50 מ"ל המכיל את flocs לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות ב 8,000 x גרם במשך 30 דקות ב 8 ° C.</li>
		<li>יש לגרד בזהירות את הכדוריות באמצעות מרית מעוקרת, ולהשהות מחדש את הכדוריות הנותרות בצינורות ב-250 μL של חיץ נתרן פוספט 0.2 M (pH 7.5) לאחר הסרת הסופרנאטנט. העבירו את הכדוריות המרוטשות והתלויות מחדש לאותם צינורות מיני-צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>ביצוע מיצוי RNA נגיפי מתרכיזים נגיפיים של דגימות שפכים ומבחני יעילות התאוששות באמצעות ערכת מיצוי RNA עם יחס של 25:24:1 של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל ו-β-מרקפטואתנול, בהתאם להוראות היצרן, כדי לשפר את יעילות המיצוי. לבסוף, לטשטש את הרנ"א ב 50 μL של חיץ אלוציה.</li>
	<li>ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR)<ol><li>כימות RNA משוריין באמצעות דילול פי עשרה (7.8 x 10,4 עד 7.8 עותקי גנים) של DNA סינתטי חד-גדילי או מבנה gBlock. ראו טבלה 2 עבור הפריימרים וערכות הגשושיות המזהות ומכמתות את הרנ"א המשוריין.</li>
		<li>תכננו ערכות פריימר וגשושית באמצעות כלי תכנון פריימר29 וכוונו לאזור של 95 bp (מבנה gBlock) בתוך גנום ה-RNA המשוריין.</li>
		<li>השג עקומות כיול עבור כל ריצת RT-qPCR. כלול בקרות שליליות בכל הפעלת qPCR. הפעל תקנים, דוגמאות ופקדים שאינם פקדים שאינם תבניות בשלושה שולשים.</li>
		<li>הכינו כל תערובת RT-qPCR של 10 μL בסדר הבא: 2.5 μL של תערובת מאסטר 4x, 400 ננומטר של כל פריימר, בדיקה של 200 ננומטר ו-2.5 מיקרוליטר של תבנית, כמו גם מים מזוקקים טהורים במיוחד ללא DNAse/RNAse.</li>
		<li>בצע תגובות מחזור תרמיות ב- 50 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן 45 מחזורים של 95 ° C עבור 10 שניות ו- 60 ° C במשך 30 שניות במערכת PCR בזמן אמת. אם ה- CT היה <40, שקול את הדגימה RNA משוריין חיובי.</li>
		<li>בצע בדיקות qPCR ו- RT-qPCR באמצעות אלבומין בסרום בקר עם דגימות ביוב גולמיות כדי להעריך את האפשרות של מעכבים או מזהמים כגון חומצות הומיות24. לא נצפו הבדלים משמעותיים בין דגימות עם ובלי האנזים.</li>
	</ol></li>
	<li>חישוב הריכוזים מהעקומה הסטנדרטית. חשב את אחוז יעילות ההתאוששות על ידי חלוקת הריכוז המשוחזר בריכוז הקוצני.</li>
	<li>שנה מספרי העתקי גנים באמצעות הפונקציה log10 לניתוח. הפעל מודל ליניארי כללי באמצעות כלי ניתוח סטטיסטי על נתוני qPCR. יישם את הבדיקה של טוקי כדי לזהות הבדלים בין השיטות והטיפולים. קח ערך p של 0.05 כדי להיות רמת מובהקות מינימלית עבור המבחן.</li>
</ol>2. סינון וריכוז נגיפי DNA ו-RNA לאפידמיולוגיה מבוססת מים
<ol><li>לאיסוף מים עיליים סביבתיים, אספו 10 ליטר של דגימות מים עיליים סביבתיים והשתמשו ב-10 ליטר של דגימות מים שעברו דה-יוניזציה לבקרת רקע. אחסנו את כל הדגימות בחדר בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד תוך 24 שעות לאחר איסוף הדגימות.</li>
	<li>בצע ריכוז של וירוסים מדגימות סביבתיות עם SMF באמצעות השלבים המתוארים להלן.<ol><li>בצע סינון קפסולות ואקום באמצעות קפסולות דגימת מי תהום בקיבולת גבוהה ומסנני דיסק ממברנה בגדלים 0.45 מיקרומטר, 0.2 מיקרומטר ו- 0.1 מיקרומטר כדי למזער רעש במהלך ריצוף מטאגנומי, משברים גדולים יותר כגון מיקרו-איקריוטים וחיידקים ועד קטנים יותר כגון וירוסים.</li>
		<li>הכינו תמיסת חלב דל שומן בנפח 1% לפי נפח ב-1.32 ליטר מי ים סינתטיים עם 13.2 גרם אבקת חלב דל שומן. התאם את ה- pH של מתלה זה ל- 3.5 באמצעות 1 N HCl.</li>
	</ol></li>
	<li>התאימו את רמת החומציות של דגימות המים העיליים הסביבתיים ל-3.5 באמצעות 1 N HCl.</li>
	<li>העבירו 100 מ"ל של תמיסת חלב דל שומן חומצי מראש לדגימות מים סביבתיות של 10 ליטר חומצה (pH 3.5) (ריכוז חלב דל שומן סופי של 0.01% [w/v]).</li>
	<li>בעזרת מערבל מגנטי ומוט ערבוב מגנטי, ערבבו את הדגימות במשך 8 שעות בטמפרטורת החדר ואפשרו לפלוקים לשקוע על ידי כוח הכבידה במשך 8 שעות נוספות. מבלי להפריע לפלוקים, הסירו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות משאבת ואקום.</li>
	<li>Aliquot ולאזן את שאר flocs על פי המשקל בצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ולסובב אותם למטה ב 8,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט והמיסו את הגלולה המתקבלת (המכילה באופן תיאורטי וירוסים בעלי עניין) ב-200 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט 0.2 M.</li>
	<li>טפל בכדורית המומסת עם DNase I ו- RNase A, בהתאם להוראות היצרן, כדי לסלק DNA ו- RNA חופשיים נוכחים שעשויים להיות מואצים יחד בגלל הערכה המשמשת למיצוי חומצות גרעין. בטל את ההפעלה של DNase I ו- RNase A בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>יש לחלץ את סך חומצות הגרעין מהגלולה המומסת באמצעות ערכת מיצוי DNA/RNA, בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>כמת את הכמות הכוללת של DNA ו- RNA שחולצו מדגימות קולחים באמצעות פלואורומטר. דגימות עם ריכוזים >1 ng/μL נחשבות אופטימליות לכימות וריצוף DNA.</li>
	<li>בצע ניתוח qPCR כדי להתמקד וירוסים אנטריים מעניינים וריצוף תפוקה גבוהה כדי לזהות את מבנה הקהילה הנגיפית.</li>
</ol>3. משקעים ישירים וריכוז של שברים מיקרוביאליים לאפידמיולוגיה מבוססת מים
<ol><li>אספו 2 ליטר דגימות מים מנתיבי מים מוגנים ומושפעים. אם הדגימה מכילה כמות ניכרת של פסולת, השתמש בבד גבינה כדי להסיר אותם. הערה: מומלץ מאוד לאסוף עותק ביולוגי לכל דגימה.</li>
	<li>הכינו תמיסת חלב דל שומן 1% (w/v) על ידי המסת 4.4 גרם אבקת חלב דל שומן ב-440 מ"ל מי ים סינתטיים. כוונן את ה- pH של מתלה זה ל- 3.5 עם 1 N HCl.</li>
	<li>התאימו את רמת החומציות של דגימות המים המתוקים ל-3.5 באמצעות 1 N HCl.</li>
	<li>הוסף 20 מ"ל של תמיסת חלב דל שומן לדגימות 2 ליטר מים מתוקים שהותאמו בעבר ל- pH (ריכוז חלב דל שומן סופי של 0.01% [w/v]). ערבבו את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 8 שעות.</li>
	<li>אפשרו לפלוקים לשקוע בכוח הכבידה למשך 8 שעות נוספות. בזהירות להסיר את supernatants עם משאבה פריסטלטית. מעבירים את הפלוקים המשוקעים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומסובבים אותם במהירות של 8,000 x גרם למשך 30 דקות.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הכדוריות עם 200 μL של חיץ נתרן פוספט 0.2 M. אחסן את הדגימות ב -20 ° C או המשך לבחור ~ 0.5 גרם של floc עבור מיצוי DNA מיקרוביאלי באמצעות ערכת בידוד חומצות גרעין לפי בחירה, בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>לקבוע את ריכוז חומצת הגרעין DNA ואת טוהר עם פלואורומטר רגישות גבוהה. דגימות עם ריכוזים >1 ng/μL צריכות להיות אופטימליות לכימות וריצוף DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wastewater-based+epidemiology+for+community+monitoring+of+SARS-CoV-2%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Environmental+Au%22%5BJournal%5D)">Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges.</a> ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).</li>
<li>Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+concentration-The+critical+step+in+implementing+the+wastewater+based+epidemiology+for+the+COVID-19+pandemic%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review.</a> The Science of The Total Environment. 747, 141245(2020).</li>
<li>Bi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+household+transmission+of+SARS-CoV-2+from+a+population-based+serological+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey.</a> Nature Communications. 12, 3643(2021).</li>
<li>Day, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covid-19%3A+identifying+and+isolating+asymptomatic+people+helped+eliminate+virus+in+Italian+village%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village.</a> British Medical Journal. 368, 1165(2020).</li>
<li>Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19%3A+in+the+footsteps+of+Ernest+Shackleton%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton.</a> Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).</li>
<li>Bivins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wastewater-based+epidemiology%3A+global+collaborative+to+maximize+contributions+in+the+fight+against+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19.</a> Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).</li>
<li>Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+SARS-Coronavirus-2+RNA+in+sewage+and+correlation+with+reported+COVID-19+prevalence+in+the+early+stage+of+the+epidemic+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands.</a> Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).</li>
<li>Thompson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+waves%3A+Wastewater+surveillance+of+SARS-CoV-2+for+population-based+health+management%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management.</a> Water Research. 184, 116181(2020).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+RNA+concentrations+in+wastewater+foreshadow+dynamics+and+clinical+presentation+of+new+COVID-19+cases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases.</a> The Science of the Total Environment. 805, 150121(2022).</li>
<li>Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+measuring+the+recovery+of+SARS-CoV-2+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater.</a> Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).</li>
<li>Chik, A. H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+approaches+to+quantify+SARS-CoV-2+in+wastewater+using+RT-qPCR%3A+Results+and+implications+from+a+collaborative+inter-laboratory+study+in+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada.</a> Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).</li>
<li>Hjelmsø, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+the+concentration+and+extraction+of+viruses+from+sewage+in+the+context+of+metagenomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing.</a> PLoS One. 12 (1), e0170199(2017).</li>
<li>Philo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+SARS-CoV-2+wastewater+concentration+methods+for+environmental+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance.</a> The Science of the Total Environment. 760, 144215(2021).</li>
<li>Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+concentration+methods+for+quantitative+detection+of+sewage-associated+viral+markers+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+the+concentration+of+viruses+from+urban+sewage+using+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR.</a> Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).</li>
<li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses%2C+bacteria+and+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li>
<li>Assis, A. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+skimmed-milk+flocculation+method+for+recovery+of+adenovirus+from+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge.</a> The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).</li>
<li>Goncharova, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+quantitative+RT-PCR+assay+with+armored+RNA+controls+for+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).</li>
<li>Yu, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+armored+RNA+as+a+control+for+multiplex+real-time+reverse+transcription-PCR+detection+of+influenza+virus+and+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).</li>
<li>Alygizakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methodologies+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater%3A+Protocols+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives.</a> Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125(2021).</li>
<li>Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+human+enteric+viruses+as+alternative+indicators+of+fecal+pollution+to+evaluate+wastewater+treatment+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes.</a> PeerJ. 10, e12957(2022).</li>
<li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+surveillance+in+Southeastern+Virginia+using+wastewater-based+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology.</a> Water Research. 186, 116296(2020).</li>
<li>Hietala, S. K., Crossley, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armored+RNA+as+virus+surrogate+in+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+proficiency+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).</li>
<li>Uyaguari-Diaz, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+method+for+amplicon-based+and+metagenomic+characterization+of+viruses%2C+bacteria%2C+and+eukaryotes+in+freshwater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples.</a> Microbiome. 4 (1), 20(2016).</li>
<li>Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+change+in+pH+of+skim+milk+and+ultrafiltered%2Fdiafiltered+retentates+on+milk+protein+concentrate+%28MPC70%29+powder+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties.</a> Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).</li>
<li>Geneious. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.geneious.com">https://www.geneious.com</a> (2021).</li>
<li>Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivability%2C+partitioning%2C+and+recovery+of+enveloped+viruses+in+untreated+municipal+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater.</a> Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).</li>
<li>Philo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+the+skimmed+milk+pellet+extraction+protocol+for+SARS-CoV-2+wastewater+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance.</a> Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).</li>
<li>Monteiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+SARS-CoV-2+from+large+volumes+of+raw+wastewater+is+enhanced+with+the+inuvai+R180+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journalof+Environmental+Management%22%5BJournal%5D)">Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system.</a> Journalof Environmental Management. 304, 114296(2022).</li>
<li>Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+throughout+wastewater+treatment+plants+and+a+modeling+approach+to+understand+COVID-19+infection+dynamics+in+Winnipeg%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada.</a> The Science of The Total Environment. 825, 153906(2022).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

אחד השלבים הקריטיים במחקר זה הוא חיסול חלקיקים מוצקים על ידי יישום שלב סינון מקדים עם מסנני קרום 0.2 מיקרומטר ו- 0.45 מיקרומטר. בהתחשב בחלוקה של וירוסים לחלקיקים מוצקים, במיוחד וירוסים עטופים, סינון מוקדם יכול לגרום לאובדן משמעותי בהתאוששות הנגיפים30. בעוד שלב טרום סינון עבור שיטות אולטרה-סינון הוא כמעט תמיד הכרחי עבור דגימות סביבתיות ומי שפכים כדי למנוע סתימה של התקני אולטרה-סינון, סינון מקדים עבור SMF עשוי להידרש בהתאם לסוג הניתוח במורד הזרם. עבור מחקרי PCR ממוקדים, ייתכן שלא יהיה צורך בסינון מו...

קביעת הריכוז האפקטיבי של מיקרואורגניזמים בדגימות פני השטח והשפכים לצורך ניתוח קהילות מיקרוביאליות ומחקרים אפידמיולוגיים, היא אחד הצעדים החשובים לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות 1,2. מגפת הקורונה, גילתה את החשיבות של שיפור שיטות הריכוז. נגיף הקורונה פרץ בסוף 2019 ונכון למרץ 2023 עדיין מהווה איום על בריאות האדם, חיי החברה והכלכלה. אסטרטגיות מעקב ובקרה יעילות להקלת ההשפעות של התפרצויות COVID-19 בקהילות הפכו לנושא מחקר חשוב, שכן גלים ווריאנטים חדשים של COVID-19 צצים בנוסף להעברה והתפשטות המהירה של הנגיף, כמו גם מקרים אסימפטומטיים לא מדווחים ולא מאובחנים 3,4,5. השימוש באפידמיולוגיה מבוססת שפכים עבור COVID-19 על ידי ארגוני חברה אזרחית, סוכנויות ממשלתיות ושירותים ציבוריים או פרטיים סייע לספק מידע מהיר הקשור להתפרצות ולמתן את ההשפעות של התפרצויות COVID-19 6,7,8,9. עם זאת, ריכוז SARS-CoV-2, נגיף RNA עטוף, בדגימות שפכים עדיין מציב אתגרים10. לדוגמה, אחד האתגרים האלה הוא חלוקה של SARS-CoV-2 במוצקי שפכים, אשר עשוי להשפיע על התאוששות כאשר מוצקים מסולקים במהלך ריכוז11. אם זה המקרה, מוקד הכימות/הערכה צריך להיות הן בפאזה מוצקה והן בפאזה מימית של דגימות מים סביבתיות, ולא בפאזה המימית בלבד. יתר על כן, ניתן לשנות את בחירת שיטת הריכוז בהתבסס על בדיקות וניתוחים במורד הזרם. ריכוז חלקיקי הנגיף והפתוגנים מדגימות סביבתיות הפך לנושא מחקר דחוף עם התפתחויות בתחומי הריצוף והמיקרוביום.
שיטות שונות לריכוז וירוסים יושמו בתחום ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים. כמה שיטות נפוצות הן סינון, חלב דל שומן flocculation (SMF), ספיחה / elution, ופוליאתילן גליקול משקעים12-17. ביניהם, SMF נחשב שיטה זולה ויעילה, נבדק בהצלחה ויישם עבור שחזור וירוסים, כולל SARS-CoV-2, משפכים ומים עיליים12,15,16,18. נוהל SMF הוא גישה חדשה יחסית שזכתה להכרה גוברת בקרב מחקרים סביבתיים רבים כמתודולוגיה מתאימה לשחזור בו זמנית של מגוון רחב של מיקרואורגניזמים כגון וירוסים, חיידקים ופרוטוזואנים מכל סוגי דגימות המים, כלומר דגימות בוצה, שפכים גולמיים, שפכים וקולחים19. בהשוואה למתודולוגיות ידועות אחרות לשחזור וירוסים מדגימות סביבתיות כגון אולטרה-סינון והדבקת גליצין-אלקליין, גישה מבוססת ליופיליזציה, או אולטרה-צנטריפוגה ופליטת גליצין-אלקליין, SMF דווח כשיטה היעילה ביותר עם שיעורי התאוששות וזיהוי נגיפיים גבוהים יותר18,20. במחקר הנוכחי, השתמשנו ב-RNA משוריין כנגיף בדיקה כדי להעריך את יעילות ההתאוששות של שיטות ריכוז הנגיף, כולל בדיקות להערכת התאוששות SARS-CoV-221,22.
כאן, בדקנו דגימות שפכים ומים סביבתיים כדי להדגים את התועלת של SMF ושיטת אולטרה-סינון רציפה לריכוז שברים מיקרוביאליים עבור תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR), מטגנומיקה מבוססת רצפים וריצוף אמפליקון עמוק. SMF היא שיטה זולה יחסית ואופטימלית לנפח גדול יותר של דגימות בהשוואה לשיטות אולטרה-סינון. הרעיון להשתמש בשיטת אולטרה-סינון רציפה נבע מהצורך להקטין את הנפח הסופי של תרכיזי הנגיפים בתקופת הקורונה, כאשר אספקת מכשירי האולטרה-סינון הנפוצים הייתה מוגבלת, והיה צורך בפיתוח שיטות חלופיות לריכוז הנגיף.

<table><tbody><tr><td>0.2 M מאגר נתרן פוספט עם pH 7.5</td><td>אלפא Aesar</td><td>J62041AP</td><td>פישר סיינטיפיק, פייר לון, ניו ג'רזי, ארה"ב</td></tr><tr><td>0.2 &mu; מסנני דיסק ממברנה 47 מ"מ Supor-200</td><td>VWR</td><td>66234</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>0.45 &mu; m 47 מ"מ Supor-200 מסנני דיסק ממברנה</td><td>VWR</td><td>60043</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>4444432 Life Technologies, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב</td></tr><tr><td>RNA משוריין Quant IPC-1 בקרת עיבוד</td><td>Asuragen</td><td>49650</td><td>Asuragen, אוסטין, טקסס, ארה"ב</td></tr><tr><td>מותג A, מכשיר צנטריפוגלי Jumbosep, 30-kDa</td><td>Pall&nbsp;</td><td>OD030C65</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>Brand B, מכשיר צנטריפוגלי מתקדם Microsep, 30 kDa</td><td>Pall</td><td>MCP010C46</td><td>Pall Corporation, אן ארבור,</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה MI (50 מ"ל)&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050PK</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Dyna Mag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>GWV קפסולות דגימת מי תהום בקיבולת גבוהה - 0.45 ומיקרו; m</td><td>Pall</td><td>12179</td><td>Pall Corporation, אן ארבור, MI</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית, תמיסה סטנדרטית 1N</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC124210025</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, ארה"ב</td></tr><tr><td>MagMAX Microbiome ערכת בידוד חומצות גרעין אולטרה</td><td>ביו-מערכות יישומיות</td><td>A42358</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Promega</td><td>P1197</td><td>Promega Corporation, Fitchburg, WI, ארה"</td></tr><tr><td>ב משאבה פריסטלטית</td><td>Masterflex, מכשיר Cole-Parmer</td><td>7553-20</td><td>Thermo Fisher מד</td></tr><tr><td>pH מדעי&nbsp;</td><td>מכשיר דנבר</td><td>RK-59503-25</td><td>קול-פארמר. מוצר זה הופסק פנול</td></tr><tr><td>: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל 25: 24: 1</td><td>Invitrogen</td><td>15593031</td><td>פישר סיינטיפיק, פייר לון, ניו ג'רזי, ארה"ב</td></tr><tr><td>פריימרים וערכות בדיקה</td><td>IDT</td><td></td><td>Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, ארה"ב</td></tr><tr><td>Qiagen All-prep DNA/RNA ערכת מיקרוביום כוח</td><td>Qiagen Qiagen</td><td></td><td>Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, ארה"ב</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 PCR בזמן אמת מערכת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A34322</td><td>Life Technologies, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב</td></tr><tr><td>ערכת בדיקה של Qubit 1X dsDNA רגישות גבוהה (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Qubit 4 פלואורומטר, עם WiFi</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Qubit RNA ערכת בדיקה רגישות גבוהה (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Invitrogen</td><td>EN0531</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>RNeasy Powerערכת מיקרוביום</td><td>Qiagen</td><td>26000-50</td><td>Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, ארה"ב</td></tr><tr><td>אבקת חלב רזה</td><td>Difco (BD Life Sciences)DF0032173</td><td></td> <td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, ארה"ב</td></tr><tr><td>מאגר נתרן פוספט</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>Alfa Aesar, אוטווה, ON, קנדה</td></tr><tr><td>מי ים סינתטיים</td><td>VWR&nbsp;</td><td>RC8363-1</td><td>RICCA חברת כימיקלים</td></tr> DNA <tr><td>סינטטי חד-גדילי gBlock</td><td>IDT</td><td></td><td>Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, ארה"ב</td></tr><tr><td>VacuCap 90 מכשירי סינון ואקום - 0.1 ומיקרו; מ', 90 מ"מ, Pall</td><td></td><td>4621</td><td>Pall Corporation, אן ארבור, MI</td></tr><tr><td>VacuCap 90 התקני סינון ואקום - 0.2 ומיקרו; m, 90 מ"מ,</td><td>Pall</td><td>4622</td><td>Pall Corporation, אן ארבור, MI</td></tr> <tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>Fisher Scientific, פייר לון, ניו ג'רזי, ארה"ב</td></tr></tbody></table>

ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון

Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration

אפידמיולוגיה מבוססת מים ושפכים התפתחה כשיטות חלופיות לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות. ההתאוששות של שברים מיקרוביאליים, כולל וירוסים, חיידקים ומיקרו-איקריוטים מדגימות שפכים ומים סביבתיים היא אחד הצעדים המאתגרים בגישות אלה. במחקר זה, התמקדנו ביעילות ההתאוששות של שיטות אולטרה-סינון רציפות ופלוקולציית חלב דל שומן (SMF) באמצעות RNA משוריין כנגיף בדיקה, המשמש גם כבקרה על ידי כמה מחקרים אחרים. סינון מקדים עם מסנני דיסק ממברנות 0.45 מיקרומטר ו- 0.2 מיקרומטר יושמו כדי לחסל חלקיקים מוצקים לפני אולטרה-סינון כדי למנוע סתימה של מכשירי אולטרה-סינון. דגימות הבדיקה, שעובדו בשיטת אולטרה-סינון רציף, צוננו בשתי מהירויות שונות. מהירות מוגברת הביאה לשיעורי התאוששות וחיוביות נמוכים יותר של RNA משוריין. מצד שני, SMF הביא להתאוששות עקבית יחסית ושיעורי חיוביות של RNA משוריין. בדיקות נוספות שנערכו עם דגימות מים סביבתיות הדגימו את התועלת של SMF לריכוז שברים מיקרוביאליים אחרים. חלוקת הנגיפים לחלקיקים מוצקים עשויה להשפיע על שיעורי ההתאוששות הכוללים, בהתחשב בשלב הסינון המוקדם המיושם לפני אולטרה-סינון של דגימות שפכים. SMF עם קדם-סינון הפגין ביצועים טובים יותר כאשר יושם על דגימות מים סביבתיים עקב ריכוזים מוצקים נמוכים יותר בדגימות ולכן שיעורי חלוקה נמוכים יותר למוצקים. במחקר הנוכחי עלה הרעיון להשתמש בשיטת אולטרה-סינון רציפה מתוך הצורך להקטין את הנפח הסופי של תרכיזי הנגיפים בתקופת הקורונה, כאשר אספקת מכשירי האולטרה-סינון הנפוצים הייתה מוגבלת, והיה צורך בפיתוח שיטות חלופיות לריכוז הנגיף.

הערכת שיטות ריכוז RNA נגיפי כל שש הדגימות שעובדו עם UF-3k x g היו חיוביות והביאו להתאוששות של 13.38% ± 8.14% (איור 1). רק דגימה אחת הייתה חיובית כאשר הדגימות עובדו עם UF-7.5k x g. כל הדגימות שעובדו עם SMF היו חיוביות והביאו להתאוששות של 15.27% ± 2.65% (איור 1). שיעורי ההתאוששות הממוצעים של UF-3K x g ו- SMF היו גבוהים באופן משמעותי ועקבי (p &lt; 0.0001) מאשר UF-7.5K x g. מצד שני, לא היה הבדל משמעותי...

ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים הוא משימה מאתגרת, המתבצעת בעיקר לזיהוי וכימות נגיפים. בעוד מספר שיטות ריכוז וירוסים פותחו ונבדקו, אנו מדגימים כאן את היעילות של ultrafiltration ו flocculation חלב דל שומן עבור וירוסים RNA עם סוגי דגימה שונים.

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The ...

אפידמיולוגיה מבוססת מים ושפכים התפתחה כשיטה חלופית לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות. שיטת פלוקולציית חלב דל שומן מייצגת גישה חלופית לריכוז חיידקים. שיטת פלוקולציית חלב דל שומן מייצגת שיטה רב-תכליתית, זולה וקלה לריכוז שברים מיקרוביאליים ללא הבדלים משמעותיים בהשוואה לגישות סינון אולטרה או סינון זרימה משיק.גישה זו משמשת למטגנומיקה או מחקרי PCR ממוקדים. לאחר ריכוז השברים המיקרוביאליים, ניתן לבצע מיצוי חומצות גרעין באמצעות ערכות מיצוי מסחריות או פרוטוקול פנימי. שיטת החלב הרזה קלה יחסית לכמויות גדולות או קטנות של דגימות מים או שפכים.כחלק משיטה זו יש לכלול בקרת רקע עם מי Milli-Q. מי שידגימו את ההליך יהיו קאדיר ינאק, ג'אנל פרנסיס וג'וסלין זמבראנו-אלווראדו, סטודנטים לתואר שני במעבדה של מיגל אויאגוארי. כדי להתחיל, לאסוף שני ליטרים של דגימות שפכים גולמיים מרוכבים פרופורציונליים זרימה של 24 שעות.העבירו את הדגימות למעבדה בבקבוקים חסיני אור בארגז קרח ועבדו אותן תוך 24 שעות. קבל את נתוני מאפייני השפכים מהצוות הטכני של מכון טיהור השפכים. עבור כל שיטת סינון אולטרה, יש לזנק חמש פעמים 10 לעותק הרביעי של RNA משוריין ל-140 מיליליטר מכל אחת משש דגימות שפכים מתוקים שנאספו בתאריך אחד ושש דגימות שפכים מתוקים בתאריך אחר.הומוגניזציה של RNA משוריין בדגימה על ידי ערבוב במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס על ערבוב מגנטי. עבור חלב דל שומן flocculation או SMF, להכין 1% תמיסת חלב דל שומן על ידי המסת 0.5 גרם של אבקת חלב דל שומן ב 50 מיליליטר של מי ים סינתטיים. התאימו את רמת החומציות של SMF ל-3.5 באמצעות חומצה הידרוכלורית רגילה אחת.הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת חלב דל שומן ל 500 מיליליטר של דגימת שפכים גולמיים. מערבבים את הדגימה במשך שמונה שעות ומניחים ללהקות שנוצרו להסתפק בשמונה שעות נוספות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה סרולוגית מבלי להפריע לעדרים המיושבים.מעבירים נפח סופי של 50 מיליליטר המכיל את הצאן לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 8, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים את הסופרנאטנט ומגרדים בזהירות את הגלולה בעזרת מרית מעוקרת. השהה מחדש את הגלולה הנותרת ב 250 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט מולארי 0.2.מעבירים את הכדוריות המרוטשות והתלויות מחדש לאותו צינור צנטריפוגה מיני של 1.5 מיליליטר. ביצוע מיצוי RNA נגיפי מתרכיזים נגיפיים של דגימות שפכים ומבחני יעילות התאוששות באמצעות ערכת מיצוי RNA עם יחס של 25:24:2:1 בין פנול לכלורופורם לאלכוהול איזואמיל ובטא מרקפטואתנול בהתאם להוראות היצרן. לבסוף, לטשטש את הרנ"א ב 50 מיקרוליטר של חיץ אלוציה.עבור ניתוח RT-qPCR, כמת RNA משוריין באמצעות דילולים פי עשרה של DNA סינתטי חד-גדילי או מבנה gBlock. השג עקומות כיול עבור כל ריצת RT-qPCR. כלול בקרות שליליות והפעל את הדגימות בשלשה.אספו 10 ליטר דגימת מים עיליים סביבתיים. כלול 10 ליטר מים נטולי יונים, לשליטה ברקע. בצע סינון קפסולות ואקום באמצעות מסנני דיסק ממברנה בגדלים 0.45, 0.2 ו- 0.1 מיקרון כדי למזער רעש במהלך ריצוף מטגנומי.לאחר הסינון, התאימו את רמת החומציות של דגימת המים ל-3.5 באמצעות חומצה הידרוכלורית רגילה אחת. הכינו תמיסת חלב דל שומן 1% מראש והתאימו את ה- pH ל -3.5. הוסף 100 מיליליטר של תמיסת חלב דל שומן חומצי ל -10 ליטר דגימת מים סביבתיים חומציים.ערבבו את הדגימה במשך שמונה שעות בטמפרטורת החדר על שייקר מגנטי ואפשרו ללהקות לשקוע באמצעות כוח הכבידה למשך שמונה שעות נוספות. לאחר השיקוע, מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות משאבת ואקום מבלי להפריע ללהקות. יש לאזן את שאר הצאן בהתאם למשקל בצינור צנטריפוגה 50 מ"מ וצנטריפוגה.מוציאים את הסופרנאטנט וממיסים את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט מולארי 0.2. טפל בכדוריות המומסות עם DNase I ו- RNase A בהתאם להוראות היצרן לסילוק DNA ו- RNA חופשיים המואצים בתהליך המיצוי. לאחר הדגירה, יש להשבית את DNase I ו-RNase A.לחלץ חומצות גרעין מהגלולה המומסת באמצעות ערכת מיצוי DNA או RNA.כמת את הכמות הכוללת של DNA או RNA שחולץ מדגימת המים העיליים הסביבתית באמצעות פלואורומטר. בצע ניתוח qPCR כדי להתמקד וירוסים אנטריים מעניינים וריצוף Illumina כדי לזהות את מבנה הקהילה הנגיפית. אספו שני ליטרים של דגימות מים מנתיבי מים מוגנים ומושפעים.אם הדגימה מכילה פסולת ניכרת, השתמש בבד גבינה כדי להסיר אותם. הוסף 20 מיליליטר של תמיסת חלב דל שומן 1% לדגימת המים המתוקים של שני ליטר שהותאמו בעבר ל- pH. ערבבו את הדגימה במשך שמונה שעות בטמפרטורת החדר ואפשרו ללהקות לשקוע בכוח הכבידה במשך שמונה שעות נוספות.לאחר השיקוע, הסר בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות משאבה פריסטלטית. מעבירים את להקות המשקע לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר וצנטריפוגות אותם ב 8, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הכדוריות ב-200 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט מולארי 0.2.בחר כ -0.5 גרם של הלהקה למיצוי DNA באמצעות ערכת בידוד חומצות גרעין לפי בחירת הוראות היצרן. לקבוע את ריכוז ה- DNA ואת טוהר באמצעות fluorometer. כל שש הדגימות שעובדו עם סינון אולטרה ב -3, 000 גרם היו חיוביות.לעומת זאת, רק דגימה אחת הייתה חיובית כאשר הדגימות עובדו עם סינון אולטרה ב 7, 500 G.כל הדגימות שעובדו עם SMF היו חיוביות והביאו להתאוששות טובה יותר. שיעורי ההתאוששות הממוצעים של 3, 000 G ו- SMF היו גבוהים באופן משמעותי ועקבי מאשר סינון אולטרה ב 7, 500 G.פרמטרים של איכות מים בדגימות מושפעות וחומצות גרעין שהופקו מדגימות מים סביבתיות שנאספו בוויניפג על פני שלוש עונות מסוכמים כאן. דגימות שנאספו בחודשים אפריל עד אוקטובר 2022 ממי נהר אסיניבואין הניבו את ריכוז הדנ"א הגבוה ביותר מיער 1 והריכוז הנמוך ביותר נמצא באתר חקלאי שלוש.חשוב מאוד להשתמש בריכוז הנכון של חלב דל שומן ולהחמיץ, את הדגימה לפני השימוש. טכניקה זו יכולה לספק סריקה מהירה של פתוגנים מיקרוביאליים שונים הנמצאים בדגימות סביבתיות כגון מים ושפכים. שינויים נוספים יכולים להיות מיושמים באמצעות מטריצות מוצקות כגון אדמה או משקעים.

concentration-virus-particles-from-environmental-water-wastewater

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

שיעור התחלופה של וירוסים במערכות ימיים מים מתוקים ניתן לאמוד על ידי ירידה וטכניקה הישנותם. הנתונים לאפשר לחוקרים להסיק ששיעורי התמותה וירוס בתיווך של חיידקים במערכות מים.

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

צמר זכוכית מסננים שימשו לרכז וירוסים waterborne על ידי מספר קבוצות מחקר ברחבי העולם. כאן אנו מצביעים על גישה פשוטה לבניית צמר זכוכית מסננים ולהפגין המסננים הם גם יעילים ריכוז waterborne ויראליים, גורמי מחלה חיידקיים protozoan.

צמר זכוכית מסננים וירוסים waterborne ריכוז פתוגנים zoonotic חקלאיים

פותחה גישה לזיהוי תנאי ריכוז נגיפי אופטימליים עבור דגימות מים בנפח קטן באמצעות קוצים של אדנו-וירוס אנושי. הטכניקות המתוארות כאן משמשות לזיהוי פרמטרי ריכוז עבור מטרות נגיפיות אחרות, ומיושמות על ניסויים בריכוז נגיפי בקנה מידה גדול.

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

שיטת EPA 1615 משתמשת במסנן אלקטרו-פוזיטיבי כדי לרכז אנטרו-וירוסים ונורו-וירוסים במי הסביבה ובמי השתייה. כתב יד זה מתאר את הליך איסוף הדגימות לניתוחי שיטה 1615.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

כאן אנו מציגים נוהל למדידת סך כל הנגיפים הניתנים לתרבית באמצעות קו תאי הכליה של הקוף הירוק של באפלו. הנוהל מספק כלי סטנדרטי למדידת הופעת נגיפים זיהומיים במי הסביבה ובמי השתייה.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

אנו מתארים כאן את ההתקדמות האחרונה בבידוד ויראלי לאפיון גנוטיפים חדשים של Faustovirus, שושלת חדשה הקשורה לאספרווירוס של נגיפי ענק. ניתן ליישם פרוטוקול זה על בידוד תפוקה גבוהה של וירוסים, במיוחד נגיפי ענק המדביקים אמבה.

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

כאן אנו מציגים את VirWaTest, המהווה שיטה פשוטה, במחיר סביר ונייד לריכוז ואיתור של וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.

וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

כאן, אנו מתארים שיטות דגימה מהאזורים האופוטיים של מערכות אקולוגיות ימיות ומים מתוקים כדי לבודד ציאנופגים (והמארחים שלהם) ותהליכים שלאחר הדגימה המעשירים גנוטיפים בודדים ומאפיינים את דינמיקת האינטראקציה בין וירוס למארח.

דגימה סביבתית של מיקרובים פוטוסינתטיים ווירוסיהם: מהשדה למעבדה

למדו את שיטת שיקוע חלב דל שומן לריכוז נגיפי RNA מדגימות מים ושפכים סביבתיים. שיטה זו יעילה, זולה ונוחה לשימוש בהשוואה לאולטרה-סינון, ומאפשרת חילוץ חומצות נוקליאיניות לניתוח מולקולרי.

ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון

גלה סרטונים נוספים