Name: בידוד של תכולת אנדוטוקסין נמוכה שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בשורות תאים סרטניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: למדו שיטה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות עם תכולת אנדוטוקסין נמוכה משורות תאים סרטניים SW480 ו-SW620. הפרוטוקול מספק טכניקות אספטיות להפחתת זיהום ולהערכה מדויקת של תוצאות הניסוי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין, מענק מספר 2019/33/B/NZ5/00647. ברצוננו להודות לפרופ' תומאש גוסייבסקי ואגניישקה קרבצ'יק מהמחלקה למיקרוביולוגיה רפואית מולקולרית, המכללה הרפואית של האוניברסיטה היגלונית על עזרתם רבת הערך בזיהוי דנ"א חיידקי ברכבים חשמליים.

1. הכנת צינורות אולטרה-צנטריפוגות
<ol><li>השתמשו בצינורות סטריליים לשימוש חד פעמי. אם הדבר אינו אפשרי, עשו שימוש חוזר בצינורות האולטרה-צנטריפוגות לאחר שטיפתם בחומר ניקוי באמצעות פיפטה סטרילית של פסטר או אפליקטורים חד-פעמיים אחרים. זכרו כי צינורות אולטרה-צנטריפוגות צריכים להיות מוקדשים לסוג אחד של חומר צנטריפוגי (סופרנטנט תרבית תאים/נסיוב/פלזמה) ומינים (אדם/עכבר/וכו').</li>
	<li>לאחר שטיפת חומר ניקוי, שטפו את צינורות האולטרה-צנטריפוגות במים נטולי LPS 3x. הערה: אין להשתמש במים באיכות נמוכה.</li>
	<li>יבש את צינורות ultracentrifuge, ולאחר מכן למלא אותם עם 70% אתנול. השאירו את הצינורות עם 70% אתנול לחיטוי לילה. מוציאים את האתנול ומייבשים שוב את הצינורות.</li>
	<li>מניחים את הצינורות והפקקים באריזות סטריליזציה וסוגרים אותם היטב. השתמש בשיטת העיקור פלזמה או גז (אתילן אוקסיד)18,19. אחסנו את צינורות האולטרה-צנטריפוגות הסגורים באריזת העיקור במקום יבש, והשתמשו בהם לפני תאריך התפוגה. הערה: בצע ניטור חודשי של רמת LPS במי מלח חוצצים פוספט (PBS) והמים המשמשים לבידוד כלי רכב חשמליים. הניטור צריך לכלול גם את הצינורות (למשל, על ידי בדיקת המים [בקרת שטיפה] שאוחסנו בצינורות האולטרה-צנטריפוגות במשך הלילה בטמפרטורת החדר [RT]).</li>
</ol>2. הכנת סרום בקר עוברי דל אנדוטוקסין דל EV (EE-FBS)
<ol><li>הקפד להשתמש באנדוטוקסין FBS נמוך במיוחד (זמין מסחרית; ראה טבלת חומרים; <0.1 האיחוד האירופי/מ"ל).</li>
	<li>הניחו בקבוק של אנדוטוקסין FBS נמוך במיוחד באמבט מים ודגרו בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות. שלב זה נדרש כדי להשבית את מערכת המשלים.</li>
	<li>פיפטה FBS בלתי פעיל צינורות אולטרה צנטריפוגות וצנטריפוגה אותו ב 100,000 x גרם במשך 4 שעות ב 4 ° C. אספו את הסופרנאטנט לתוך צינורות סטריליים של 50 מ"ל, תוך הקפדה שלא יעלה על 45 מ"ל לצינור כדי למנוע זיהום המכסה והרטבת טבעת הצינור.</li>
	<li>יש לאחסן את סרום EE-FBS שהוכן באופן זה בטמפרטורה של -20°C. בדוק את ריכוז LPS ב- EE-FBS (שלב 6). ריכוז LPS צריך להיות באותה רמה כמו לפני אולטרהצנטריפוגה.</li>
</ol>3. תרבית תאים
<ol><li>עבור מחקר זה, תרבית SW480 ו SW620 שורות תאים בתווך הנשר של Dulbecco שונה (DMEM) עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז, L- גלוטמין, פירובט נתרן, וגנטמיצין (50 μL / מ"ל) בתוספת 10% EE-FBS בהתאם ב 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית בטכניקה אספטית. זרעו כמעט 4.5 x 106 תאים ו- 6.5 x 106 תאים לבקבוק עבור SW480 ו- SW620, בהתאמה.</li>
	<li>אספו את הסופרנאטנטים פעמיים בשבוע (~10 מ"ל לצלוחית) כאשר התאים מגיעים למפגש מלא (~13.5 x 10, 6 ו-20 x 10,6 תאים לבקבוק עבור SW480 ו-SW620, בהתאמה), ופצלו. ודא כי הכדאיות של תאים היא לא פחות מ 99% וכי התאים הם בתרבית ב 37 ° C באטמוספירה 5% CO2.</li>
	<li>אספו סופרנאטנטים מתרבית התאים לתוך צינורות 15 מ"ל המסומנים כראוי. צנטריפוגה את הסופרנאטנטים שנאספו ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT כדי להסיר פסולת התא.</li>
	<li>אספו את הסופרנאטנטים בזהירות, הימנעו משאיפת פסולת, הניחו בצינורות מסומנים וצנטריפוגה שוב בטמפרטורה של 3,200 x גרם למשך 12 דקות ב-4°C.</li>
	<li>אספו סופרנאטנטים משלב הצנטריפוגה השני לתוך צינורות סטריליים המסומנים ב-50 מ"ל. הימנעו מהרטבת שולי הצינורות. ודא כי נפח supernatant אינו עולה על 45 מ"ל וכי צינורות נשמרים אנכית.</li>
	<li>עטפו את מכסה הצינור בסרט סטרילי ושקוף ואחסנו סופרנאטנטים במצב אנכי בטמפרטורה של -80°C. הערה: בצע בקרה חודשית של Mycoplasma spp. וזיהום LPS בסופרנאטנטים של תרביות טריות (שלב 6). אם רמת האנדוטוקסין בסופרנאטנטים עולה על 0.05 EU/mL, יש לוודא באיזה שלב ייתכן שהתרחש זיהום ולהפעיל מחדש את התהליך מההתחלה. אם זיהום של תרבית התא על ידי Mycoplasma spp. אם זוהה, יש להפסיק את הבידוד של כלי הרכב החשמליים מסופרנאטנטים כאלה.</li>
</ol>4. בידוד כלי רכב חשמליים מסופרנאטנטים של תרביות תאים
<ol><li>הכינו מסנני מזרקים 0.22 מיקרומטר ומזרקים בנפח מתאים. הכינו שני צינורות עם סופרנאטנטים לתרבית (90 מ"ל).</li>
	<li>ממלאים את המזרק בסופרנאטנט ומחברים את המסנן למתאם המחט. מניחים את המזרק המלא עם המסנן מעל צינור 50 מ"ל. לחץ על אוגן הבוכנה ואסוף ~ 90 מ"ל של תסנין.</li>
	<li>פיפטה את המסנן (7 מ"ל) לצינורות אולטרה צנטריפוגות (להבטיח כי נפח זהה הוא pipeted לכל צינור עבור איזון תקין) וצנטריפוגה ב 100,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C. הערה: היעילות של כדורי כלי רכב חשמליים תלויה בגורמים רבים (למשל, סוג הרוטור, גורם ה-k שלו, אורך נתיב הנדידה, צמיגות התווך וכו'), שיש למטב אותם להתאוששות טובה יותר של כלי רכב חשמליים20.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה סטרילית של פסטר. אספו את הכדורים הנותרים בעזרת קצות פיפטה ארוכים ומסוננים ואגרו אותם לשני צינורות אולטרה-צנטריפוגה. מלא אותם עד 7 מ"ל עם PBS מסונן ללא אנדוטוקסין כדי לשטוף את EVs.</li>
	<li>צנטריפוגה את הכדוריות התלויות PBS ב 100,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C. הסירו לחלוטין את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סטרילית של פסטר, והוסיפו 200 מיקרוליטר של PBS מסונן ונטול אנדוטוקסין לשני הצינורות כדי להשהות מחדש את הרכבים החשמליים. מקציפים בעדינות את כדורי הרכב החשמלי כדי לאסוף את כל כלי הרכב החשמליים.</li>
	<li>העבירו את מתלי הרכב החשמלי למבחנה סטרילית בנפח 1.5 מ"ל (במידת האפשר, השתמשו במבחנה דלת קשירת חלבון). שמור על 10 μL של מתלה EV להכנת דילול לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) ולמטרות אחרות (למשל, מדידת ריכוז חלבונים).</li>
	<li>יש לדלל את כלי הרכב החשמליים ב-PBS מסונן (בקנ"מ 1:1,000) לצורך מדידות של נת"ע, בהתאם להוראות היצרן. אבטחו את צינורות הרכב החשמלי על ידי עטיפת הפקק בסרט סטרילי שקוף. אחסנו את כלי הרכב החשמליים בטמפרטורה של -80°C.</li>
</ol>5. זיהוי סמנים ספציפיים על ידי כתם מערבי
<ol><li>קבע את רמת החלבון בדגימות (למשל, על ידי בדיקת ברדפורד), והכן את הדגימות (20 מיקרוגרם) עם מאגר העמסה. הכן את מאגר ההעמסה על ידי ערבוב 5 μL של מאגר הדגימה (4x) ו- 2 μL של חומר מקטין דגימה (10x) לנפח כולל של 20 μL. דגור על הדגימות ב- 70 ° C למשך 10 דקות.</li>
	<li>הכינו ג'ל פוליאקרילאמיד עם SDS (10%-14%) והעמיסו את 20 מיקרוגרם כלי הרכב החשמליים לכל באר.</li>
	<li>הפעל את האלקטרופורזה עם חיץ ריצה (30 גרם טריס, 144 גרם גליצין, 10% SDS לכל 1 ליטר) במשך 45 דקות ב- 150 וולט.</li>
	<li>בצע העברה חצי יבשה של חלבונים מהג'ל אל קרום הפוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) במכונת העברה עם חיץ Towbin (1.51 גרם טריס, 7.2 גרם גליצין, 10% מתנול ל-0.5 ליטר) ב-25 וולט למשך שעה אחת.</li>
	<li>הניחו את הממברנה במאגר TBST (1 מ"ל טווין, 100 מ"ל מלח חוצץ טריס (TBS 10x) לכל 1 ליטר) לחסימה עם אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) במאגר TBST, ודגרו במשך שעה אחת על הנדנדה ב-RT.</li>
	<li>הוסף נוגדנים מדוללים (1:1,000), אנטיCD9 1 (שיבוט #D8O1A) או אנטי אליקס 1 (שיבוט #3A9), ב1 % BSA ודגור עם הממברנה לילה ב 4 ° C על הנדנדה. הסר נוגדנים ושטוף את הממברנה 3x עם 10 מ"ל של 1x TBST למשך 10 דקות.</li>
	<li>הוסף נוגדן נגדי עז או עז נגד עכבר (דילול: 1:2,000) נוגדן משני מצומד עם פרוקסידז חזרת, בהתאם לנוגדן העיקרי על הממברנה, ודגר במשך שעה על הנדנדה ב- RT. הסר נוגדנים ושטוף את הממברנה 3x עם 10 מ"ל של 1x TBST למשך 10 דקות.</li>
	<li>ערבבו את המצע והאלומיניום ביחס של 1:1 לקבלת תמיסה של 1 מ"ל. יוצקים את התמיסה על הממברנה. מקם את הממברנה מיד בתא המדידה של מערכת ההדמיה, בחר את מודול הכימילומינסנציה והצג פסי חלבון על המסך.</li>
</ol>6. מדידת רמת אנדוטוקסין על ידי בדיקת לימולוס אמבוציטים ליזט (LAL)
<ol><li>בצע מדידת LAL כרומוגנית של רמת האנדוטוקסין, בהתאם להמלצת היצרן. בקצרה, להשתמש בשיטה המבוססת על האינטראקציה של אנדוטוקסין עם לימולוס amebocyte lysate (LAL). מגבלת הזיהוי של שיטה זו היא 0.005 EU/mL. הערה: בדיקת LAL, למרות מגבלותיה, נותרה כיום השיטה הסטנדרטית לאיתור וכימות זיהום אנדוטוקסין בסוגים שונים של תמיסות ומוצרים אחרים המשמשים במדע או ברפואה8. הגורם המגביל של ערכה זו הוא היציבות של פתרון amebocyte lysate reconstituted, אשר יציב רק 1 שבוע ב -20 °C אם קפוא מיד לאחר reconstitution.</li>
	<li>השתמשו בדילול של פי עשרה של כלי רכב חשמליים ודגימות אחרות ובדילול של נסיוב של פי 50. לניסויים נוספים, השתמשו רק בריאגנטים בעלי אנדוטוקסין נמוך כגון EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0.005 EU/mL) וסופרנאטנטים של תרבית ללא LPS.</li>
</ol>7. איתור גן rRNA פרוקריוטי 16S בדגימות EV
<ol><li>בודדו DNA מדגימות EV. נסה לשמור על ריאגנטים ואת האתר של בידוד אספטי. למדוד את ריכוז הדנ"א ואת איכותו (למשל, באמצעות ספקטרופוטומטר).</li>
	<li>בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR), כפי שתואר קודם לכן21. הכינו ג'ל אגרוז 1.5% עם אתידיום ברומיד או ירוק SYBR כדי לדמיין את מוצרי ה-PCR באור אולטרה סגול (UV).</li>
	<li>הפעל אלקטרופורזה של סמן הדגימה והמשקל עם חיץ TRIS-אצטט-EDTA במתח של 75 וולט למשך 45 דקות. דמיינו פסי דנ"א באמצעות מערכת ההדמיה.</li>
</ol>8. קביעת ריכוז LPS יעיל לגירוי במודל מונוציטים אנושי
<ol><li>הכינו 2 x 106 מונוציטים/מ"ל של תרחיף מונוציטים בסל"ד 1640 בתוספת L-גלוטמין, גלוקוז ו-2% EE-FBS. הוסף 50 μL של המתלה לכל באר של צלחת תרבית רקמה 96 באר22.</li>
	<li>הוסף נפח מתאים של LPS או מדיום תרבית כדי לקבל את הריכוזים הסופיים הבאים: 0 pg/mL (בקרה), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL ו-100 ng/mL, בנפח כולל של 100 μL של תרחיף תאים. צור טריפליקטים מכל ריכוז LPS.</li>
	<li>תרבית את התאים במשך 18 שעות ב 37 ° C, 5% CO2. לאסוף את supernatant.</li>
	<li>סובבו את הסופרנאטנט במהירות של 2,000 x גרם למשך 5 דקות. מעבירים את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים. יש למדוד את ריכוז TNF 8,23 ו-IL-1023 בסופרנאטנטים שנאספו באמצעות ערכת הציטוקינים האנושית של מערך החרוזים הציטומטריים (CBA), בהתאם לנוהל היצרן, עם ציטומטר זרימה.</li>
</ol>

<ol><li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li>
<li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi%CE%B1+dependent+PI-3+kinase+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li>
<li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840(2014).</li>
<li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32(2013).</li>
<li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li>
<li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+activity+of+masked+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750(2017).</li>
<li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956(2018).</li>
<li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li>
<li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+%28ectosomes%29+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li>
<li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766(2020).</li>
<li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li>
<li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastics%2C+endotoxins%2C+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parenteral+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li>
<li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li>
<li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li>
<li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li>
<li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology%3A+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216(2019).</li>
<li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science%22%5BJournal%5D)">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li>
<li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li>
<li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42(2022).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858(2014).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+%27exosome-depleted+serum%27+is+utilised%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963(2021).</li>
<li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination%3A+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li>
<li>Álvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915(2017).</li>
<li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273(2018).</li>
<li>Gałuszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227(2020).</li>
<li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+polymyxins%3A+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27(2006).</li>
<li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+removal+from+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שניתן לבנות כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

בשנים האחרונות, שיטות לבידוד נכון של כלי רכב חשמליים הפכו חשובות יותר ויותר, ומאפשרות ניתוחים אמינים נוספים, למשל, בהקשר של קבלת אומיקה מהימנה ונתונים פונקציונליים24. בהתבסס על ניסיון מחקרי קודם, נראה כי לא רק סוג שיטת הבידוד, אלא גם תנאים אחרים במהלך הליך זה עשויים להיות חשובים. השימוש ב- FBS מדולדל EV מוכר באופן נרחב כהכרח25,26; עם זאת, ניטור זיהום אנדוטוקסין ברכב חשמלי מוזנח לעתים קרובות.
עם זאת, כל השיטות המ...

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), על פי המינוח MISEV 2018, הן מונח קולקטיבי המתאר תת-סוגים שונים של שלפוחיות קרומיות המופרשות על ידי תאים הממלאות תפקידים מכריעים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים 1,2. יתר על כן, כלי רכב חשמליים נראים מבטיחים כסמנים ביולוגיים חדשניים למחלות שונות, כמו גם סוכנים טיפוליים וכלי רכב לאספקת תרופות. עם זאת, מימוש מלוא הפוטנציאל שלהם הוא קשה שכן ישנם עדיין מכשולים טכניים רבים הקשורים לרכישתם3. אתגר אחד כזה הוא הבידוד של כלי רכב חשמליים נטולי אנדוטוקסין, שהוזנח במקרים רבים. אחד האנדוטוקסינים הנפוצים ביותר הוא ליפופוליסכריד (LPS), שהוא מרכיב עיקרי בדפנות תאי חיידקים גראם-שליליים ויכול לגרום לתגובה דלקתית חריפה, עקב שחרור מספר רב של ציטוקינים דלקתיים על ידי תאים שונים 4,5. LPS משרה תגובה על ידי קשירה לחלבון קושר LPS, ואחריו אינטראקציה עם קומפלקס CD14/TLR4/MD2 על תאים מיאלואידים. אינטראקציה זו מובילה להפעלה של מסלולי איתות תלויי MyD88 ו- TRIF, אשר בתורו מפעיל את הגורם הגרעיני קאפה B (NFkB). טרנסלוקציה של NFkB לגרעין יוזמת ייצור ציטוקינים6. מונוציטים ומקרופאגים רגישים מאוד ל-LPS, וחשיפתם ל-LPS גורמת לשחרור ציטוקינים וכימוקינים דלקתיים (למשל, IL-6, IL-12, CXCL8 ו-TNF-α)7,8. מבנה CD14 מאפשר קשירה של מיני LPS שונים בעלי זיקה דומה ומשמש כקולטן משותף לקולטנים דמויי אגרה אחרים (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 ו-9)6. מספר המחקרים הנערכים על ההשפעות של כלי רכב חשמליים על מונוציטים/מקרופאגים עדיין גדל ב-9,10,11. במיוחד מנקודת המבט של חקר תפקודם של מונוציטים, תת-אוכלוסיות שלהם ותאים חיסוניים אחרים, נוכחותם של אנדוטוקסין ואפילו נוכחותם המוסווית ברכבים חשמליים היא בעלת חשיבות רבה12. הזיהום המתעלם של כלי רכב חשמליים באנדוטוקסינים עלול להוביל למסקנות מטעות ולהסתיר את פעילותם הביולוגית האמיתית. במילים אחרות, עבודה עם תאים מונוציטיים דורשת ביטחון בהיעדר זיהום אנדוטוקסין13. מקורות פוטנציאליים של אנדוטוקסינים יכולים להיות מים, מדיה מסחרית וסרה, רכיבי מדיה ותוספים, כלי זכוכית מעבדה וכלי פלסטיק 5,14,15.
לכן, מחקר זה נועד לפתח פרוטוקול לבידוד של כלי רכב חשמליים בעלי אנדוטוקסין נמוך. הפרוטוקול מספק רמזים פשוטים כיצד להימנע מזיהום אנדוטוקסין במהלך בידוד כלי רכב חשמליים, במקום להסיר אנדוטוקסינים מכלי רכב חשמליים. בעבר, פרוטוקולים רבים הוצגו כיצד להסיר אנדוטוקסינים מננו-חלקיקים מהונדסים המשמשים בננו-רפואה; עם זאת, אף אחד מהם אינו שימושי עבור מבנים ביולוגיים כגון כלי רכב חשמליים. דפירוגנציה יעילה של ננו-חלקיקים יכולה להתבצע על ידי שטיפת אתנול או חומצה אצטית, חימום ב 175 ° C במשך 3 שעות, γ הקרנה, או טיפול טריטון X-100; עם זאת, נהלים אלה מובילים להשמדת כלי רכב חשמליים16,17.
הפרוטוקול המוצג הוא מחקר חלוצי המתמקד במניעת זיהומים אנדוטוקסינים ברכב חשמלי, בניגוד למחקרים קודמים על השפעת כלי רכב חשמליים על מונוציטים9. יישום העקרונות המוצעים לפרקטיקה במעבדה עשוי לסייע בהשגת תוצאות מחקר אמינות, אשר יכולות להיות חיוניות כאשר שוקלים את השימוש הפוטנציאלי של כלי רכב חשמליים כסוכנים טיפוליים במרפאה12.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Alix (3A9) עכבר mAb&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>2171</td><td></td></tr><tr><td>1250ul מסנן קצות פיפטה אוניברסליים, שקוף, פוליפרופילן, לא פירוגני</td><td>GoogLab Scientific</td><td>GBFT1250-R-NS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBA Human Th1/Th2 ערכת ציטוקינים II</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>CD9 (D8O1A) ארנב mAb</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>13174</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>17001401</tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני)&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ELX800NB, קורא מיקרופלייט אוניברסלי</td><td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי דרום אמריקה אנדוטוקסין נמוך במיוחד</td><td>&nbsp; ביו-ווסט</td><td>&nbsp; S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין, 50 מ"ג/מ"ל</td><td>&nbsp; PAN &ndash; Biotech</td><td>P06-13100</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG- HRP</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG- HRP</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF ממברנה</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1620177</tr><tr><td>LPS מסלמונלה אבורטוס אקוואי בצורת S (TLRGRADE)</td><td>&nbsp; אנזו מדעי החיים בע"מ</td><td>ALX-581-009-L002</td><td></td></tr><tr><td>מיני טרנס-בלוט תא העברה אלקטרופורטי</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1703930</tr><tr><td>ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS מאגר דגימה (4X)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>&nbsp; NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE חומר להפחתת דגימה (פי 10)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>סרט שקוף</td></tr><tr><td>מושלם 100-1000 bp סולם DNA</td><td>EURx</td><td>E3141-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39552</td><td></td></tr><tr><td>PP Oak Ridge Tube עם מכסי איטום</td><td>Thermo Scientific</td><td>3929, 03613</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>RPMI-1640 (Gibco)11875093</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystem</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES צנטריפוגה עם רוטור</td> <td>T-1270Thermo Scientific</td><td>75000100</td><td></td></tr><tr><td>תת-תא GT מערכת אלקטרופורזה אופקית</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1704401</tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>SW480 קו תאים</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי (ATCC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SW480 קו תאים</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי (ATCC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מסנן מזרק 0.22 um</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD תא העברה</td> <td>חצי יבשמעבדות ביו-ראד בע"מ&nbsp;</td><td></td><td>1703940 מכונת העברה</td></tr><tr><td>פיפטת העברה, 3.5 מ"ל</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תכולת אנדוטוקסין נמוכה שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בשורות תאים סרטניים

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן אוכלוסייה הטרוגנית של שלפוחיות ממברנות המשוחררות על ידי תאים במבחנה ו-in vivo. נוכחותם בכל מקום ותפקידם המשמעותי כנשאים של מידע ביולוגי הופכים אותם למושאי מחקר מסקרנים, הדורשים פרוטוקולים אמינים וחוזרים על עצמם לבידודם. עם זאת, מימוש מלוא הפוטנציאל שלהם הוא קשה מכיוון שעדיין ישנם מכשולים טכניים רבים הקשורים למחקר שלהם (כמו רכישה נכונה). מחקר זה מציג פרוטוקול לבידוד כלי רכב חשמליים קטנים (על פי המינוח MISEV 2018) מהתרבית של קווי תאי הגידול המבוססת על צנטריפוגה דיפרנציאלית. הפרוטוקול כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסינים במהלך בידוד של כלי רכב חשמליים וכיצד להעריך אותם כראוי. זיהום אנדוטוקסין של כלי רכב חשמליים יכול לעכב באופן משמעותי ניסויים עתידיים או אפילו להסוות את ההשפעות הביולוגיות האמיתיות שלהם. מצד שני, נוכחות התעלמות של אנדוטוקסינים עלולה להוביל למסקנות שגויות. יש לכך חשיבות מיוחדת כאשר מתייחסים לתאים של מערכת החיסון, כולל מונוציטים, מכיוון שמונוציטים מהווים אוכלוסייה רגישה במיוחד לשאריות אנדוטוקסין. לכן, מומלץ מאוד לסנן כלי רכב חשמליים לאיתור זיהום אנדוטוקסין, במיוחד כאשר עובדים עם תאים רגישים לאנדוטוקסין כגון מונוציטים, מקרופאגים, תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים או תאים דנדריטיים.

תנאי מוקדם או צעד חובה עבור פרוטוקול זה הוא אי הכללת זיהום אנדוטוקסין אפשרי מגיבים. כל הריאגנטים הנמצאים בשימוש, כגון FBS, DMEM, RPMI, PBS, ואפילו צינורות אולטרה-צנטריפוגה, חייבים להיות נטולי אנדוטוקסין (&lt;0.005 האיחוד האירופי / מ"ל). שמירה על משטר ללא זיהום אנדוטוקסין אינה קלה, שכן לדוגמה, הסרום הרגיל/סטנדרטי לתרבית תאים יכול להיות המקור העשיר שלו (0.364 EU/mL; ראה טבלה 1).
למרות שפרוטוקול זה פותח כדי לבודד כלי רכב חשמליים עם תכולת אנדוטוקסין נמוכה, חשוב לאפיין את כלי הרכב ...

הפרוטוקול המוצע כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסין במהלך בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מסופרנאטנטים של תרביות תאים, וכיצד להעריך אותן כראוי.

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

פרוטוקול זה מספק הנחיות כיצד להימנע מזיהום עם אנדוטוקסין במהלך בידוד של שלפוחיות חוץ-תאיות מסופרנאטים של תרביות תאים, וכיצד להעריך אותן כראוי. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שכל מעבדה העוסקת ברכב חשמלי עשויה להגביל את זיהום האנדוטוקסין על ידי שמירה על הליך אספטי ושימוש בציוד פשוט וזמין באופן נרחב. כל מי שמנסה טכניקה זו בפעם הראשונה צריך להתחיל עם מדיה חדשה, ריאגנטים, כלי פלסטיק אשר מסומנים נמוך אנדוטוקסין, לא פירוגני.עבור פרוטוקול זה, השתמש בריאגנטים נטולי אנדוטוקסין, מים, מדיה לתרבית, PBS מסונן, FBS אנדוטוקסין נמוך במיוחד וצינורות אולטרה-צנטריפוגה. כדי להתחיל, אספו את הסופרנאטנט מקווי תאים SW480 ו-SW620 שגודלו בעבר בתרבית לתוך צינורות 15 מיליליטר המסומנים כראוי. הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה של supernatant ב 500 x גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.מבלי להפריע לפסולת, לאסוף את supernatant לתוך צינור מסומן חדש, צנטריפוגה ב 3, 200 x גרם במשך 12 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים בזהירות 45 מיליליטר של הסופרנאטנט לתוך צינור סטרילי של 50 מיליליטר הממוקם אנכית, מבלי להרטיב את שולי הצינור. עטפו את מכסה הצינור בסרט סטרילי ושקוף, ואחסנו אותו במאונך בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לבידוד הבא של שלפוחיות חוץ-תאיות.התחילו בבידוד על ידי הכנת מסנני מזרקים, מזרקים ושפופרות בגודל 0.22 מיקרומטר המכילים כ-90 מיליליטר סופרנטנט. ממלאים מזרק בסופרנטנט, ומקבעים את המסנן למתאם המחט. מסננים את הסופרנאטנט דרך הפילטר לתוך צינור של 50 מיליליטר.פיפטה שבעה מיליליטר של תסנין לתוך צינור ultracentrifuge מוכן, וצנטריפוגה ב 100, 000 x גרם במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. השתמשו בפיפטת פסטר סטרילית כדי להשליך את הסופרנטנט. משכו את הכדוריות לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה באמצעות קצה פיפטה ארוך ומסונן.שטפו את השלפוחיות החוץ תאיות על ידי הוספת שבעה מיליליטר של PBS מסונן ללא אנדוטוקסין. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סטרילית של פסטר והשהו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS נטול אנדוטוקסין. מעבירים את התרחיף למבחנה סטרילית של 1.5 מיליליטר עם קשירת חלבון.לאחר מכן להעביר 10 מיקרוליטר של השעיה צינור חדש 1.5 מיליליטר לניתוח נוסף. עטפו את מכסה הצינור ואחסנו אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. כעת, לתוך צינור חדש, לדלל מיקרוליטר אחד של תרחיף באמצעות PBS מסונן ביחס של 1 עד 1000 לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים.כדי לבצע ניתוח ניקוי, תחילה ערבבו 20 מיקרוגרם של הדגימות עם מאגר טעינה. לדגור על הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן לטעון 20 מיקרוגרם של הדגימה לתוך כל באר של 10 עד 14% פוליאקרילאמיד ג'ל עם SDS, ולבצע אלקטרופורזה במשך 45 דקות ב 150 וולט, עם חיץ פועל.לאחר מכן, מניחים את הג'ל במכונת העברה עם חיץ Towbin, ומבצעים העברה חצי יבשה של חלבונים על קרום פוליווינילידן דיפלואוריד במתח של 25 וולט למשך שעה. חסום את הממברנה עם 1% BSA על ידי דגירה במשך שעה על נדנדה. הוסיפו נוגדנים מדוללים BSA, אנטי-CD9 או אנטי-אליקס, לממברנה, ודגרו במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על נדנדה.לאחר הסרת הנוגדנים, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של TBST במשך 10 דקות. כעת הוסיפו נוגדן משני נגד ארנב או נגד עכבר, ודגרו שוב על נדנדה למשך שעה בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הנוגדן ולשטוף את הממברנה כפי שהודגם קודם לכן.יוצקים מיליליטר אחד של התמיסה המכילה מצע ולומינול ביחס שווה על הממברנה. הניחו מיד את הממברנה במערכת הדמיה, ודמיינו את רצועות החלבונים על המסך. במחקר הנוכחי, ניתוח כתמים מערביים אישר את נוכחותם של שני סמני שלפוחית חוץ-תאיים, CD9 ואליקס.הגודל הממוצע והריכוזים של השלפוחיות שבודדו הן מ-SW480 והן מ-SW620 היו דומים. גירוי של מונוציטים במינונים שונים של ליפופוליסכרידים, או LPS, הראה שהמינון הנמוך ביותר של LPS המאפשר הפרשת אינטרלוקין 10 וגורם נמק הגידול במונוציטים היה 50 פיקוגרם למיליליטר. בדיקת LAL כרומוגנית הצביעה על כך שזיהום LPS של השלפוחיות החוץ תאיות היה בסביבות 50 פיקוגרם למיליליטר עבור שני קווי התא.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא השימוש בריאגנטים נטולי LPS או מרוקנים, ומדידת LPS שגרתית בכל שלב של ההליך. מניעת זיהום אנדוטוקסין קלה יותר מאשר חיסולו. הפרוטוקול המוצע מגביל את האפשרות לתוצאות שגויות עקב זיהום של כלי רכב חשמליים באנדוטוקסין, ומאפשר להעריך את פעילות כלי הרכב החשמליים בכל תא.הפרוטוקול המוצע שימושי לחוקרים העובדים עם תאים רגישים לאנדוטוקסין, כמו מונוציטים, תאים דנדריטיים ומקרופאגים.

isolation-low-endotoxin-content-extracellular-vesicles-derived-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: ווטסון, די.סי., et.al. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בקרום החיצוני של חיידקים מהונדסים גנטית. התהליך כולל גידול החיידקים לשחרור EVs, ואחריו צנטריפוגה עוקבת ושלבי סינון להסרת תאים ופסולת. לבסוף, אולטרה-סינון משמש לריכוז הרכבים החשמליים לניתוח במורד הזרם.

בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים

זהו פרוטוקול לבידוד ושלפוחיות רקמות (EVs) מהכבד. הפרוטוקול מתאר תהליך דו-שלבים המעורב בקולגן ומלווה באמצעות מעקב דיפרנציאלי לבידוד רקמת הכבד EVs.

בידוד של מסחטות ושלפוחיות רקמה מהכבד

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

הדו ח הנוכחי מדגיש את הדרישות כרונולוגי לחילוץ שלפוחית לפוחית (EV) בידוד מ מיקרוגלייה או דם מקרופאגים. Microglia-EVs נגזר הוערכו כרגולטורים של neurite מוצלח בעוד דם מקרופאג-נגזר EVs נחקרו בשליטה של הפלישה C6 glioma תא ב מבחנה. המטרה היא להבין טוב יותר אלה פונקציות EV כמו מגשרים החיסונית במיקרו סביבות מסוימות.

אפיון של תא החיסון-מסחטות נגזרות ושלפוחיות ולימוד השפעה פונקציונלית על סביבת התא

כתב יד זה מתאר כיצד להעריך במערכת החיסונית של vivo של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי הגידול (EVs) באמצעות ציטומטריית זרימה. רכבים חשמליים שמקורם בגידולים העוברים מוות תאי אימונוגני שנגרם כתוצאה מהטיפול נראים רלוונטיים במיוחד במערכון הגידול. פרוטוקול זה מדגים את ההערכה של אוקסליפלטין-induced emunostimulatory גידול EVs אבל יכול להיות מותאם להגדרות שונות.

ב-Vivo הקרנה אימונוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול על ידי ציטומטריית זרימה של תאי T טחול

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

הפרוטוקול כאן מדגים כי ניתן להפריד כראוי שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיה מותנית של תרביות תאים באמצעות כרומטוגרפיה של הרחקת גודל.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית

כאן אנו מתארים את העשרת שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית אופטימלית.

שיטת העשרה לבועיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד

במאמר זה אנו מתארים שיטת הומוגניזציה מהירה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) החולקים את אותו מקור ביולוגי ומבנה, מורפולוגיה והרכב חלבונים דומים של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות (EV).

שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של שלפוחיות שמקורן באנדוזום

שלפוחיות חוץ-תאיות טבעיות שמקורן בתאי הרג (NK-EVs) טומנות בחובן פוטנציאל מבטיח כתרופות ביותרפיות לסרטן. מחקר מבוסס מתודולוגיה זה מציג זרימת עבודה מדרגית של ייצור ביולוגי בלולאה סגורה שנועדה לייצר ולבודד ברציפות כמויות גדולות של כלי רכב חשמליים בעלי טוהר גבוה. בדיקות בקרה בתהליך מבוצעות לאורך כל תהליך הייצור הביולוגי, ומבטיחות שכלי הרכב החשמליים עומדים בתקני האיכות לשחרור המוצר.

זרימת עבודה של ייצור ביולוגי מדרגי לייצור ובידוד של טיפולים אתר-תאיים מבוססי סרטן חוץ-תאיים שמקורם בתאי הרג טבעיים

פרוטוקול זה נועד לזרז ולאפשר בידוד יעיל של שלפוחיות חוץ-תאיות מחלב אם אנושי בטוהר גבוה.

בידוד מהיר של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בחלב אם

למדו שיטה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות עם תכולת אנדוטוקסין נמוכה משורות תאים סרטניים SW480 ו-SW620. הפרוטוקול מספק טכניקות אספטיות להפחתת זיהום ולהערכה מדויקת של תוצאות הניסוי.

בידוד של תכולת אנדוטוקסין נמוכה שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בשורות תאים סרטניים

גלה סרטונים נוספים