Name: כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: למד כיצד לכמת שינויים גלובליים בהיסטון במיקרוגליה מבודדת ממוח עכבר באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר של שינויים אפיגנטיים לפני ניתוח מעמיק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה ל-Yanyang Bai על העזרה עם האימונובלוט באיור 5. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות [CRC-RS 950-232402 to AC]; מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 ל- AC]; Scottish Rite Charitable Foundation [21103 to AC] ו-Brain Canada Foundation [AWD-023132 to AC]; מלגת בוגר אבוריג'יני של אוניברסיטת קולומביה הבריטית (6481 עד MT); מלגת בוגר קולומביה הבריטית (6768 ל- MT); פרס Canadian Open Neuroscience Platform Student Scholar Award (10901 ל-JK); מלגת ארבע שנים לדוקטורט באוניברסיטת קולומביה הבריטית (6569 ל-JK). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתב היד.

עכבר מוח Histone שינוי כימות באמצעות ציטומטריה זרימה

<ol><li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%3A+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li>
<li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications%2C+Long-Term+Potentiation%2C+and+Long-Term+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li>
<li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li>
<li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li>
<li>Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGosselin%2C+D+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+hard%2C+play+hard%3A+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis%3A+An+Integrated+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li>
<li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li>
<li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).</li>
<li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications%3A+A+MODEL-AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70(2019).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Conventional+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Flow+Cytometry+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Conventional Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+artifactual+and+confounding+glial+signatures+by+single-cell+sequencing+of+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain.</a> Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).</li>
<li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li>
<li>Rumbaugh, G., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+in+the+brain%3A+measuring+global+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).</li>
<li>Xavier, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+delineation+of+signaling+and+epigenomic+mechanisms+underlying+microglia+inflammatory+activity+in+acute+and+chronic+brain+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRvix%22%5BJournal%5D)">Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies.</a> BioRvix. , (2022).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המוצג מאפשר הערכה כמותית של רמות HPTM גלובליות באמצעות ציטומטריית זרימה. בעוד פרוטוקול זה מציג שיטה חדשנית, מחקרים קודמים ביצעו הערכה כמותית של חלבונים בגישה דומה26. שיטות קודמות ששימשו להערכת רמות HPTM גלובליות כוללות אימונוהיסטוכימיה וכתם מערבי 16,17,19,20. השיטה המבוססת על ציטומטריית זרימה המוצגת היא שיטה הניתנת לכימות בקלות, בעוד שהכתם המערבי והאימונוהיסטוכימיה הם כמותיים למחצה ובעלי תפוקה נמוכה יותר. הכתם המערבי מסתמך על ליזה של התא ולכן דורש גם נורמליזציה של חלבונים וגם חלבון בקרת העמסה שמניחים שהוא ללא שינוי בתנאי הניסוי27. אימונוהיסטוכימיה היא כמותית למחצה ותפוקה נמוכה מאוד מכיוון שקשה להעריך כמותית את כמות החלבון מבלי לבחון ברמת תא בודד16. באופן דומה, עבור מיקרוגליה מבודדת, יש יתרון לשימוש בשיטת ציטומטריית זרימה בשל התפוקה המוגבלת מכיוון שכתם מערבי דורש קלט חלבון גדול בהרבה19. דרישות מספר התאים הנמוך מאפשרות להפעיל לוחות צביעה מרובים מאותה חיה.
עם זאת, כמו בכל שיטה אחרת, ישנן מגבלות לטכניקה זו כולל עלות נוגדנים וזמינות, שכן לא כל הנוגדנים פועלים היטב בהגדרת ציטומטריית זרימה. בנוסף, בהשוואה לאימונובלוט, ריכוז הנוגדנים הנדרש גבוה בהרבה. בעוד ריבוב מאפשר שימוש בנוגדנים מרובים על אותו פאנל של תאים, לא ניתן להסיר את התאים מהנוגדן לאחר הניתוח, ובכך להגביל את השימוש בתאים לאחד לכל מין נוגדנים. זה שונה מאימונובלוט שבו ניתן להשתמש באותו כתם שוב ושוב. עם זאת, בהתאם לזמינות הנוגדנים ומספר ערוצי הגילוי על ציטומטר, ניתן יהיה לבחון עד תריסר סימנים בו זמנית.
השיטה הנוכחית לוכדת רק את הרמות העולמיות של ביטוי חלבונים ולא את המיקום הגנומי הספציפי, ושינויים ברמות העולמיות עשויים שלא לשקף שינויים באתרים גנומיים בודדים. באופן דומה, היעדר שינוי ברמות העולמיות לא אומר שאין שינויים באתרים גנומיים, אלא פשוט שהשינויים הגלובליים מסתכמים בכך שאין הבדלים בין הטיפולים. ככזו, טכניקה זו נועדה לשמש כמסך לזיהוי HPTM בעלי עניין לניתוח גנומי. בנוסף, שיטה זו אינה מאפשרת השוואה בין סימני חלבון שונים למעט כאשר היא מוערכת כשינוי קיפול לשליטה. לכן, זה מוגבל בהשוואה לשיטה סטנדרטית מבוססת עקומה כגון ELISA לקביעת חלבונים.
הפרוטוקול שהוצג מציע אסטרטגיה לבידוד תאי מיקרוגליה חיים במוח. פרוטוקול זה מסתמך על ביטוי חלבון P2RY12 לבידוד מיקרוגליה. עם זאת, P2RY12 הוא סמן הומיאוסטטי במיקרוגליה וניתן להפחית אותו במודלים של מחלות, כגון 5XFAD22. לכן, בעת שימוש בחיית מודל מחלה הקפד לבחור חלבוני סמן אחרים כגון TMEM119, CD11b או CD45 כדי לסייע בבידוד של מיקרוגליה23. באופן דומה, אנו מציגים את הפרוטוקול הזה כבידוד מההיפוקמפוס ו/או מקליפת המוח. פרוטוקול זה יפעל לבודד מיקרוגליה מאזורי מוח אחרים, כולל אזורי חומר לבן, אולם בעלי חיים רבים עשויים להידרש להשיג מספיק מיקרוגליה בהתאם לגודל האזורים המעניינים.
הפרוטוקול המוצג יכול לבודד תאי מיקרוגליה חיים במוח, אך ישנם מספר שלבים, המתוארים להלן, בשלב הבידוד שיכולים להפחית את תפוקת התאים אם הם מבוצעים בצורה שגויה.
זילוח לפרוטוקול זה גורם לאחוז גבוה יותר של מיקרוגליה במקטע המועשר במערכת החיסון, מה שיפחית את משך הזמן במיון. עם זאת, זילוח אינו נדרש, ושיטות אחרות של המתת חסד ניתן להשתמש במידת הצורך.
במהלך בידוד מיקרוגליה, המיאלין צריך להיות מוסר לחלוטין. ציטומטרים של זרימה מסתמכים על כך שתאים מסוגלים לנוע דרך צינורות צרים בקצב מהיר. בשל צמיגותו ונטייתו לגוש, המיאלין גורם לבעיות עם ציטומטרים, לעתים קרובות גורם לסתימות אשר יכולות גם לפגוע בציוד וגם להרוס את הדגימה, מה שמקטין את התשואה באופן דרסטי. היזהר להסיר את כל המיאלין במהלך איסוף של שברים מועשרים במערכת החיסון כדי למנוע בעיות במורד הזרם.
צביעת פלטות לעומת צביעת צינורות: בפרוטוקול זה תיארנו שתי אפשרויות להכתמת תאים בצינורות של 1.5 מ"ל או בצלחת באר 96. מקרה השימוש עבור כל אחד מהם תלוי בניסוי; עם זאת, באופן כללי, צביעת צינור היא סיכון נמוך יותר להשפעה על התשואה מאשר צביעת פלטות, שכן הפליק מסתכן באובדן תאים אם נעשה בצורה לא נכונה. צביעת הצלחת מהירה הרבה יותר מכיוון ששאיפת הסופרנאטנט עבור כל צינור גוזלת זמן. לפני הקיבוע (למיון וכו'), השתמשו בצביעת צינור כדי למקסם את התשואה ולהפחית את הסיכון לאובדן. עם זאת, עבור ניתוח HPTM, ברגע שהתאים קבועים לצביעה תוך גרעינית, הגלולה יציבה יותר, ויש סיכון מופחת לאובדן עם הבהוב.
קביעת שיפוע הצפיפות הבלתי רציף: בעת קביעת השכבות, הגדרת השכבות כראוי חיונית לקבלת החלק המועשר במערכת החיסון. אם השכבות מופרעות או מעורבבות ונראות עכורות, התאים לא ימוינו למיקומם הרצוי, ויהיה קושי להשיג את מקטע התאים המועשר במערכת החיסון. אם זה קורה, ספין עם מדיום הצפיפות כדי להסיר מיאלין ולאחר מכן לאסוף את כל השברים הנותרים, לדלל עם 3 מ"ל של חיץ FACS ל 1 מ"ל של צפיפות בינונית ולערבב היטב (זה ידרוש צינורות מרובים). סובב ב 500 x גרם במשך 10 דקות עם הבלם על 0. השליכו את הסופרנטנט, והשאירו רק ~ 300 מיקרוליטר תמיסה. אספו את כל הדגימה והכתם. זה יניב באחוזי מיון מופחתים ובכמות זמן גבוהה יותר בציטומטר, אך עדיין ניתן להשוות את התשואה.
בעת שימוש בשיטת הבידוד, מועיל להיות מסוגל לאסוף תאים עבור RNA ועבור הערכת HPTM מאותו מוח עכבר. במצב זה, לאחר מיון תאי המיקרוגליה החיים, ניתן לחלק את התאים כדי להקצות חלק להערכת RNA (מספר קלט מינימלי של תאים לקבלת תפוקת RNA סבירה הוא 75,000 תאים) וחלק לניתוח ציטומטריית זרימה נוספת (מינימום 10,000 תאים לבאר לקביעה טובה של MFI). במקרה זה, נדרש מיון ציטומטר זרימה. עם זאת, כאשר מתכננים להשתמש רק בתאים לניתוח HPTM, אין צורך במיון, וניתן להכתים את החלק החיסוני בנוגדן P2RY12 ובנוגדן HPTM. לאחר מכן ניתן להגדיר Gating על הציטומטר עבור מיקרוגליה P2RY12+, כפי שנעשה עבור מיון זרימה, לנתח רק אות HPTM בתוך מיקרוגליה. ביטול המיון מאפשר לפרוטוקול להיות מהיר וחסכוני יותר. נוסף על כך, אם מעריכים HPTM מתאים בתרבית, די להתחיל בפרוטוקול הצביעה ואין צורך בנוגדנים לסמן התא כפי שמודגם באיור 6. פרוטוקול הערכת HPTM יכול לשמש עבור סוגי תאים רבים, כולל תאים בתרבית, תאים ראשוניים ותאים הנגזרים מ- IPSC.
לבסוף, בעוד שהצגנו רק שני שימושים פוטנציאליים של מיקרוגליה במורד זרם הבידוד, ישנם רבים אחרים כולל טכניקות אפיגנטיות כגון ChIP, CUT&Tag ו- CUT&RUN. במקרה של טכניקות אפיגנטיות גנומיות, שבהן אפיון שינויים במוקדים ספציפיים הוא עניין, בחר מעכבים ספציפיים עבור כותבים ומחקים של סימני כרומטין11 המותאמים לניסויים כדי להבטיח שכל השינויים האפיגנטיים במיקרוגליה שצוינו אינם ממצאים טכניים מכל שלב בתהליך הבידוד כגון עיכול אנזימטי. בעת הערכת שינויים ברמות גלובליות של סימנים אפיגנטיים, כגון באמצעות ציטומטריית זרימה כמותית, כל השינויים הנגרמים על ידי הליך אינם צפויים להיות גדולים כל כך שהם מזוהים ברמה העולמית.
בסך הכל, השיטות הנדונות מספקות שיטה חדשנית של תא בודד לכימות רמות גלובליות של שינויים בהיסטון ושינויים אפיגנטיים אחרים על ידי ציטומטריית זרימה. הדגמנו כי שיטה זו רגישה מספיק כדי לזהות שינויים גלובליים בסמן המשפר H3K27ac במיקרוגליה בתגובה ל- LPS in vivo. זה עולה בקנה אחד עם ריצוף ChIP קודם של H3K27ac בעקבות גירוי LPS המראה שיפוץ דרמטי של משפרים המגיבים LPS28. יישומים של שיטה זו יאפשרו לבחון שינויים אפיגנטיים גלובליים על פני סוגים שונים של תאי מוח בהתפתחות ובמחלות.

אפיגנטיקה היא חקר המנגנונים המווסתים ביטוי גנים מבלי לשנות את רצף הדנ"א הבסיסי. הבקרה האפיגנטית של ביטוי גנים היא דינמית בתוך התאים ויכולה לאפשר תגובות מהירות ומתואמות לגירויים סביבתיים שונים. הוויסות הדינמי מתרחש בחלקו כתוצאה משינויים במבנה הכרומטין ברמת הנוקלאוזום, המורכב מחלבוני היסטון (H2A, H2B, H3, H4) המורכבים לליבת אוקטמר הפצועה בחוזקה על ידי DNA1. יחסי הגומלין בין חלבוני ההיסטון לבין הדנ"א יכולים לשלוט בנגישות הדנ"א למכונות שעתוק, שבסופו של דבר יכולות לשלוט בביטוי גנים ובהיבטים אחרים של ביולוגיית הכרומטין2. לחלבוני היסטון יש זנבות לא מובנים הכוללים שאריות טעונות חיובית היוצרות אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם עמוד השדרה של הדנ"א הטעון שלילית. אינטראקציות אלה גורמות לאריזה הדוקה של הדנ"א ולנגישות מופחתת של הדנ"א. שינויים קוולנטיים בזנבות ההיסטון, המכונים שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון (HPTM), יכולים לווסת אינטראקציות אלה 3,4. חלק מה-HPTMs המאופיינים ביותר כוללים אצטילציה ומתילציה של זנב היסטון, אשר יכולים לשנות את הזיקה של אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין זנבות ההיסטון לדנ"א, וכתוצאה מכך נגישות דיפרנציאלית לדנ"א הבסיסי וגיוס גורמי שעתוק המזהים HPTM אלה באתרים ספציפיים. HPTMs מוסדרים על ידי שלושה סוגים חשובים של אנזימים המכונים קוראים - אשר מזהים, סופרים - אשר מפקידים, ומחקים - אשר מסירים HPTM. לפיכך, גיוס או פירוק של אנזימי קורא, כותב או מחק יכול בסופו של דבר לשנות את הנוף של HPTMs ולשלוט במבנה ובתפקוד של כרומטין, מה שהופך את הוויסות והקריאה שלהם לחיוניים להבנת הביולוגיה התאית ותפקוד 3,4.
התאים במערכת העצבים המרכזית (CNS) גמישים מבחינה אפיגנטית מכיוון שהם משנים את התעתיק שלהם כדי להסתגל לגירויים סביבתיים. עדויות מצטברות מצביעות על כך ששינויים באפיגנום, כגון מתילציה של דנ"א, רנ"א לא מקודד ו-HPTM, ממלאים תפקיד חיוני בהיווצרות זיכרון ובתפקוד סינפטי5. שיבוש הדינמיקה של HPTM באמצעות מניפולציה של הקוראים, הכותבים או המחקים הרלוונטיים יכול לחסום או לשפר למידה אסוציאטיבית והגברה לטווח ארוך 6,7,8. מיקרוגליה, התא החיסוני המקומי של מערכת העצבים המרכזית, מווסת במהירות את התעתיק שלהם בתגובה לגירוי חיסוני באמצעות שינויים דינמיים באפיגנום 9,10,11. רמה גבוהה זו של הסתגלות לסביבת המוח המקומית שלהם מקשה על בחינתם בהקשר מבודד, שכן מחקרים הראו כי האפיגנום והשעתוק של תאי מיקרוגליה משתנים לאחר שעות ספורות בלבד באמצעי התרבית לאחר הוצאתם מסביבת המוח11. בנוסף, מכיוון שתאי מיקרוגליה מהווים רק 10% מתאי המוח, מדדים הבוחנים שינויים ברמת הרקמה כולה חסרים רגישות וספציפיות12,13. כתוצאה מכך, מיקרוגליה צריכה להיות מבודדת במהירות כדי לבחון את השינויים האפיגנטיים כגון רמות HPTM, ex vivo.
השיטות הנפוצות לבחינת HPTM כוללות ריצוף כרומטין-אימונומשקעים (ChIP-seq) ומחשוף תחת מטרות וריצוף תיוג (CUT&Tag-seq)4. בעוד שטכניקות אלה הן ספציפיות מאוד ל-HPTM בודד ויכולות ליידע את נוכחותם של HPTM בהקשר גנומי ספציפי, הן יכולות לבחון רק אחד מה-HPTM האפשריים הרבים בתוך ניסוי יחיד11,14 לכן, לפני שממשיכים בניסויים כאלה, הדורשים השקעה משמעותית של זמן וכסף, חשוב מאוד לצמצם את רשימת ה-HPTM המעניינים לחקירה נוספת על ידי בחינה ראשונית של שינויים גלובליים רמות HPTM. שתי הגישות העיקריות לבחינת רמות HPTM גלובליות הן אימונוהיסטוכימיה וניתוח כתמים מערביים, אך שתי הגישות הן כמותיות למחצה בלבד, בעלות תפוקה נמוכה, ודורשות מספר רב של חלקי רקמות או תאים מבודדים15,16. לפיכך, שאפנו לפתח שיטה כמותית רגישה ביותר שתוכל לשמש לבחינת רמות HPTM העולמיות במהירות וברמת התא הבודד.
הפרוטוקול המוצג מאפשר זיהוי מהיר של רמות HPTM גלובליות באמצעות ציטומטריית זרימה תוך גרעינית. מחקרים קודמים בתאים סרטניים הצדיקו את החשיבות של בחינת הרמות העולמיות מנקודת מבט קלינית17,18. זה גם נפוץ עבור מחקרים להשתמש ברמות גלובליות כשיטת סינון לפני הערכת מיקום גנומי של HPTM ספציפיים של עניין19,20. עבור מיקרוגליה, הערכת הרמות העולמיות לאחר בידוד היא מאתגרת בשל תפוקת התאים הנמוכה; Pan et al מציגים רמות HPTM גלובליות ממיקרוגליה מבודדת, שבה מיקרוגליה משלושה בעלי חיים אוחדה כדי לאפשר זיהוי רמת חלבון על ידי כתם מערבי19. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מסוגלים לזהות שינויים גלובליים עם קלט תאים נמוך בהרבה, מה שמאפשר סינון של סימנים מרובים לכל חיה ומבטל את הצורך באיסוף דגימות.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי רמות HPTM במהירות באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית כמותית במיקרוגליה מבודדת. בעוד שאנו מתמקדים באופן ספציפי בכימות HPTM לשם קיצור, פרוטוקול זה יכול לשמש באותו אופן לכימות רמות גלובליות של אנזימי קורא, כותב ומחק. הפרוטוקול מועבר בשני חלקים: הראשון, שיטת הבידוד למיקרוגליה, ושנית, השיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לקביעת רמות HPTM. שיטת הבידוד מניבה תאים שניתן להשתמש בהם הן לבידוד RNA והן להערכת רמת HPTM המאפשרת הערכה של ביטוי גנים ורמות HPTM מאותה דגימה. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה להערכת HPTM על סוגי תאים אחרים כפי שמצוין בפרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>0.5M</td><td>EDTA Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה בז, פוליפרופילן, סטרילי&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 בארות צלחות לא מטופלות שקופות</td><td>Costar</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear Polystyrene Microplate, תחתית עגולה שקופה, משטח לא מטופל</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl Histone 3 K9 (C5B11)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9649S</td><td>דילול: 1:100</td></tr><tr><td>אצטיל היסטון H4 K8 (2594)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>2594S</td><td>דילול: 1:100</td></tr><tr><td>אצטיל-היסטון H3 K27 (D5E4)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>8173S</td><td>דילול: 1:100</td></tr><tr><td>אצטיל-היסטון H3 Lys27 (MA523516)</td> <td>דילול MA523516 Invitrogen</td><td></td><td>: 1:100</td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>New England Biolabs</td><td>15021S</td><td></td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>New England Biolabs</td><td>2222S</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-היסטון H3 (טרי מתיל K4)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab213224</td><td>דילול: 1:100</td></tr><tr><td>אנטי לקטיל-היסטון H4 (Lys 12) ארנב mAb</td><td>PTM Biolabs</td><td>PTM-1411RM</td><td>דילול: 1:250</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-L-לקטיליזין pAb</td><td>PRM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>דילול: 1:250</td></tr><tr><td>Apc נוגדן נגד P2RY12, שיבוט: S16007D</td><td>BioLegend</td><td>848006</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tocris</td><td>5217</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ציטו-אחרון</td><td>BioLegend</td><td>422501</td><td></td></tr><tr><td>דימתילסולפוקסיד,</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td> סטרילית <td>12611S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>חמור אנטי עכבר AlexaFluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-546-150</td><td>דילול: 1:500</td></tr><tr><td>חמור אנטי ארנב AlexaFluor488</td><td>ABclonal</td><td>AS035</td><td>דילול: 1:500</td></tr><tr><td>חמור אנטי ארנב AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>דילול: 1:500</td></tr><tr><td>חמור אנטי ארנב סגול מבריק 421</td><td>BioLegend</td><td>406410</td><td>דילול: 1:500</td></tr><tr><td>פיפטות העברה חד פעמיות של פישרברנד</td><td>פישרברנד</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>יחידת מסנן PES חד פעמית של פישרברנד, 250 מ"ל&nbsp;</td><td>פישרברנד</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פוליקלונלי H3K18ac</td> דילול <td>720095</td><td>Invitrogen</td><td>: 1:100</td></tr><tr><td>HBSS (10X), ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול</td><td>אדום Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול</td><td>אדום Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>היסטון 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td>דילול: 1:100</td></tr><tr><td>מטחנות רקמות KONTES Dounce 125 מ"מ 7 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR</td><td>885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>לקטיל-היסטון H3 (Lys 18) ארנב mAb</td><td>PTM BIolabs</td><td>PTM-1406RM</td><td>דילול: 1:250</td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5418</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eחרוזי פיצוי חרוזים</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>ערכת PDS, בקבוקון פפאין - Worthington Biochemical</td><td>Cedarlane</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>פנול</td><td>אדום VWR</td><td></td><td></td>RC57004</tr><tr><td>QIAמגרסה</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי פלואורסצנט קשת, 1 שיא (3.0-3.4 uM - עוצמה בינונית</td><td>BioLegend</td><td>422905</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים עם מכסים, 5 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>טריפטוליד</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>97539</td><td></td></tr><tr><td>סט מאגר גורם שעתוק גרעיני אמיתי</td><td>BioLegend</td><td>424401</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX PLUS (נגד עכבר CD16/32) נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>156604</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כדאיות ניתנת לתיקון זומבי אקווה</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

בקרת ביטוי גנים מתרחשת באופן חלקי על ידי שינויים במבנה הכרומטין, כולל הוספה והסרה של שינויים לאחר תרגום לזנבות היסטון. שינויים לאחר תרגום היסטון (HPTM) יכולים להקל על ביטוי גנים או דיכוי. לדוגמה, אצטילציה של שאריות ליזין זנב היסטון מנטרלת את המטען החיובי ומפחיתה אינטראקציות בין הזנב לדנ"א טעון שלילית. הירידה באינטראקציות זנב-דנ"א היסטון גורמת לנגישות מוגברת של הדנ"א הבסיסי, ומאפשרת גישה מוגברת לגורמי שעתוק. סימן האצטילציה משמש גם כאתר זיהוי למפעילי שעתוק המכילים ברומודומיין, ויחד יוצרים ביטוי גנים משופר. סימני היסטון יכולים להיות מווסתים באופן דינמי במהלך התמיינות תאים ובתגובה לסביבות תאיות וגירויים שונים. בעוד שגישות ריצוף הדור הבא החלו לאפיין מיקומים גנומיים עבור שינויים בודדים בהיסטון, ניתן לבחון רק שינוי אחד במקביל. בהתחשב בכך שישנם מאות HPTM שונים, פיתחנו מדד כמותי בתפוקה גבוהה של HPTM גלובלי שניתן להשתמש בו כדי לסנן שינויים בהיסטון לפני ביצוע גישות ריצוף גנום נרחבות יותר. פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לזיהוי HPTM גלובלי וניתן לבצע אותו באמצעות תאים בתרבית או תאים מבודדים מרקמות in vivo . אנו מציגים נתונים לדוגמה מתאי מיקרוגליה מבודדים במוח של עכבר כדי להדגים את הרגישות של הבדיקה לזיהוי שינויים גלובליים ב- HPTM בתגובה לגירוי חיסוני שמקורו בחיידק (lipopolysaccharide). פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה וכמותית של HPTM וניתן ליישם אותו על כל וסת שעתוק או אפיגנטי שניתן לזהות על ידי נוגדן.

עכברים בוגרים עברו טרנסקרדיליזציה והוקרבו לבידוד מיקרוגליה. תאי מיקרוגליה בודדו על קרח והוכתמו בנוגדנים מתים חיים P2RY12-APC וסגול 525. תאים שנקבעו כחיוביים עבור P2RY12 ושליליים עבור כתם מת חי 525 סגול מוינו כתאי מיקרוגליה חיים. התפוקה הממוצעת של תאי מיקרוגליה ממוח עכבר מנותח הייתה 1.28 x 105 ± 0.05 (ממוצע ± שגיאת תקן של ממוצע (SEM), N=100). אין הבדל ביבול תאי מיקרוגליה מעכברים נקביים (1.25 x 10,5 ± 0.09 [ממוצע ± SEM, N=46]) ומזכרים (1.32 x 10,5 ± 0.07 [ממוצע ± SEM, N=54]) עכברים (t(98)=0.6365, p=0.526). כאשר מבודדים מאזורי מוח ספציפיים, התפוקה הממוצעת של מיקרוגליה מקליפות המוח של עכברים היא 8.3 x 104 ± 0.08 (ממוצע ± SEM, N = 15) ומהיפוקמפוס עכבר היא 4.1 x 104 ± 0.02 (ממוצע ± SEM, N = 16). כצפוי, קיים הבדל משמעותי בתפוקת תאי המיקרוגליה מכל אזור במוח (F(2, 128)=25.25, P&lt;0.0001). לאחר בידוד מיקרוגליה, RNA הופק מהתאים המבודדים באמצעות ערכת בידוד RNA בעלת קלט נמוך. באופן עקבי, ציון שלמות הרנ"א (RIN) היה מעל 9.0 (9.62 ±-0.05) והתשואה הממוצעת של RNA לתא הייתה 0.25 ±-0.01 pg (ממוצע ± SEM, N=32; קובץ משלים S2).
עכברים בוגרים הוזרקו תוך צפקית עם 1 מ"ג / ק"ג lipopolysaccharide (LPS) 24 שעות לפני ההקרבה. העכברים עברו טרנסקרדיליזציה של HBSS, ותאי מיקרוגליה בודדו מכל המוח בהתאם לפרוטוקול המתואר (איור 5A). לכל כתם הוקצו 20,000-30,000 תאים לכל פאנל נוגדנים. הרמות העולמיות של היסטון 3 ליזין 27 אצטילציה (H3K27Ac) הוערכו במיקרוגליה מבודדת באמצעות ציטומטריית זרימה. עבור עכברים זכרים ונקבות, טיפול LPS גרם לעלייה ב- H3K27Ac כאשר ה- MFI מנורמל בתוך המין (t(6)=9.676, p&lt;0.0001; איור 5B). כאשר בוחנים את ההיסטוגרמות של התאים המוכתמים, האוכלוסיות נשארות מפוזרות באופן נורמלי עם שונות דומה; אולם התאים עברו לפלואורסצנטיות מוגברת וכתוצאה מכך חלה עלייה ב-MFI (איור 5C). כאשר בוחנים H3K9Ac באותו טיפול, יש עלייה דומה ב- H3K9Ac (t(6)=7.299, p=0.0003; איור 5D,E), אולם שינוי הקיפול של LPS ביחס לאות PBS של H3K9Ac קטן מהאות H3K27Ac.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> איור 5: שינויים גלובליים באצטילציה של היסטון בתאי מיקרוגליה מבודדים. (A) עכברים מוזרקים תוך צפקית עם מלח חוצץ פוספט (PBS) או 1 מ"ג/ק"ג ליפופוליסכריד (LPS) 24 שעות לפני ההקרבה. תאי המיקרוגליה נאספים מהמקטע המועשר במערכת החיסון ומקובעים לציטומטריית זרימה ולהערכת היסטון גלובלית לאחר שינוי תרגומי. העוצמה הפלואורסצנטית החציונית מוערכת כפרוקסי לביטוי חלבון. נוצר באמצעות BioRender.com. (B) הרמות העולמיות של H3K27Ac עלו בתגובה לטיפול ב-LPS. שינוי קפל ל-PBS מנורמל בתוך ניסוי ומין. מבחן t דו-זנבי לא מזווג, t(6)=9.676, p&lt;0.0001. גרף עמודות מתאר את הממוצע ± SEM. N=8 בעלי חיים; 2 לכל תנאי ב-2 ניסויים בלתי תלויים. (C) היסטוגרמות לדוגמה המתארות שינוי של עוצמת פלורסנט H3K27Ac. מודאל מתאר היסטוגרמות מעכברים המוזרקים על ידי PBS לעומת עכברים המוזרקים על ידי LPS. (D) היסטוגרמות לדוגמה המתארות שינוי של עוצמת פלואורסצנטית H3K9Ac. מודאל מתאר היסטוגרמות מעכברים המוזרקים על ידי PBS לעומת עכברים המוזרקים על ידי LPS. (E) רמות גלובליות של H3K9Ac עלו בתגובה לטיפול ב-LPS. שינוי קפל ל-PBS מנורמל בתוך ניסוי ומין. מבחן t דו-זנבי לא מזווג, t(6)=7.299, p=0.0003. גרף עמודות מתאר את הממוצע ± SEM. N=8 בעלי חיים; 2 לכל תנאי ב-2 ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי לאשר שהשיטה המתוארת דומה לשיטות אחרות ששימשו בעבר לכימות גלובלי של שינוי היסטון, שאפנו להשתמש באימונובלוט ככלי השוואתי. עם זאת, התשואה מתאי המיקרוגליה המבודדים פשוט נמוכה מכדי לאפשר הערכה סבירה. לכן, השתמשנו בתאי BV2 בתרבית כדי להשוות את שיטת ציטומטריית הזרימה התוך-תאית לכתם מערבי (WB). תאי BV2 גודלו במדיה מלאה (DMEMF12, 10% FBS, 1x פניצילין/סטרפטמיצין ו-1x L-גלוטמין) ב-37°C, 5% CO2. התאים עברו עם 0.25% טריפסין-EDTA וצופו בצפיפות של 250,000 תאים/באר וטופלו במדיה מופחתת בסרום (DMEM F12, 2% FBS, 1x פניצילין/סטרפטמיצין ו-1x L-גלוטמין) והורשו להתאושש במשך 12 שעות ב-37°C, 5% CO2. התאים טופלו ב-LPS של 25 ננוגרם/מ"ל במשך 24 שעות לפני הקיבוע כמתואר לעיל או בליזה עם חיץ ליזה WB. האות של H3K27Ac בוצע בשתי השיטות כאשר GAPDH שימש כבקרת טעינה עבור WB. ניתוח עוצמת הפלואורסצנט המנורמלת בהשוואה לבקרת PBS נקבע עבור כל קבוצה (איור 6A). כאשר בחנו את השינוי באות H3K27Ac המנורמל על ידי WB, חלה עלייה של פי 1.527 במצב הטיפול ב- LPS ביחס לבקרת H2O שנקבעה כמשמעותית על ידי מבחן t לא מזווג (t=3.024, df=5; p=0.0293). כאשר בחנו את השינוי באמצעות ציטומטריית זרימה, חלה עלייה של פי 1.482 במצב הטיפול ב-LPS שנקבע כמשמעותי (t=7.843, df=10; p&lt;0.0001). באמצעות ANOVA דו-כיווני להשוואת השיטות, נקבע שיש השפעה משמעותית של הטיפול (F(1,15)=45.21,p&lt;0.0001), אך לא השיטה (F(1,15)=0.05545, p=0.8697) או אינטראקציה (F(1,15)=0.02785, p=0.8697). בנוסף, אנו מוודאים כאן כי אין שינוי ברמות H3 של היסטון הן על ידי כתם מערבי והן על ידי ציטומטריית זרימה מכיוון ש- ANOVA דו-כיווני לא הראה השפעה משמעותית של הטיפול ב- LPS (F(1,7)=0.02170,p=0.8870), השיטה (F(1,7)=0.01191, p=0.9162) או האינטראקציה (F(1,7=0.01191, p=0.9162; איור 6B). כתמים לדוגמה והזזות היסטוגרמה עבור נתונים אלה מוצגים גם כן (איור 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> איור 6: השוואת שיטות לכימות שינוי ההיסטון העולמי בין ציטומטריית זרימה לכתם מערבי. (A) תאי BV2 מטופלים בליפופוליסכריד 25 ננוגרם/מ"ל (LPS) או H2O במשך 24 שעות לפני הניתוח. עוצמת הפלואורסצנט של H3K27Ac מתוארת כשינוי קיפול לבקרת הרכב, מלח חוצץ פוספט (PBS), הן עבור ציטומטריית זרימה והן עבור כתם מערבי. ANOVA דו-כיווני גילה השפעה משמעותית של הטיפול ב-LPS (F(1,15)=45.21, p&lt;0.0001), אך לא השיטה (F(1,15)=0.05545, p=0.8697) או אינטראקציה (F(1,15)=0.02785, p=0.8697). התיקון של טוקי לבדיקת השערות מרובות הוחל על השאריות. * מציג 0.0332, ** מציג 0.0021. (B) עוצמת הפלואורסצנטיות של היסטון H3 מתוארת כשינוי קיפול ל-PBS הן עבור ציטומטריית זרימה והן עבור כתם מערבי. ANOVA הדו-כיווני לא גילה השפעה משמעותית של הטיפול ב- LPS (F(1,7)=0.02170, p=0.8870) או השיטה (F(1,7)=0.01191, p=0.9162) או האינטראקציה (F(1,7=0.01191, p=0.9162). (C) כתמים לדוגמה ו-(D) שינויי ציטומטריה של זרימה מתוארים. גודל ההיסטוגרמה מנורמל לאחוזים בהתבסס על מספר התאים הנמצאים במצב עוצמת פלואורסצנטי. גרף עמודות מתאר את ממוצע SEM. n = 2 ניסויים עצמאיים, 2 לכל תנאי לכל ניסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי טכניקה זו יכולה לשמש כדי להעריך כמותית את רמות HPTM העולמי במיקרוגליה מבודדת. בנוסף, השיטה הוכחה כדומה לטכניקות קודמות אך דורשת קלט תאים נמוך בהרבה. בנוסף, למרות שלא הוצג, עם פיצוי הולם, ניתן להשתמש בטכניקה הנוכחית עם נוגדנים מרובים באותו פאנל המעריך HPTM שונים.
קובץ משלים S1: קבצי ניתוח לדוגמה. קובץ זה מכיל קובץ ניתוח wsp ו-7 קבצי fcs כולל ללא כתם, P2RY12FMO, 568FMO, שני בעלי חיים שטופלו ב-PBS ושני בעלי חיים שטופלו ב-LPS מוכתמים ב-H3K27Ac. מטרת הקובץ הזה היא להדגים את הניתוח וההסתבכות על ניסוי שיכול לתאר איך נראה ניסוי מוצלח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים S2: נתוני בידוד. הקובץ המצורף מכיל את הנתונים הרלוונטיים לאחר מיון מיקרוגליה, המכיל את תפוקת המיקרוגליה והרנ"א מהפרוטוקול המתואר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>אוכלוסייה מגודרת</td>
			<td>תדירות ההורה</td>
			<td>תדירות סה"כ</td>
			<td>מנה</td>
		</tr><tr><td>S1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>S2&gt;S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ &gt; APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: תרשים שושלת לדוגמה לדוגמה מתאר אחוזים ומספרי אירועים הדרושים לזיהוי מדויק של חלבונים.

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

מטרת המחקר שלנו היא להבין את מנגנוני הבקרה הבסיסיים השולטים בביטוי גנים במוח, ואנו מתעניינים במיוחד בהבנת האופן שבו שיבוש מנגנונים אלה תורם למצבים נוירו-התפתחותיים ונוירופסיכיאטריים. אנו מתמקדים בהבנת האופן שבו גורמי סיכון גנטיים וסביבתיים משתלבים כדי לשנות את תפקוד התאים ולייצר ליקויים התנהגותיים. פרוטוקול זה כולל שיטות לסינון בתפוקה גבוהה של שינויים בהיסטון במיקרוגליה מבודדת, ומאפשר לנו לסנן עשרות שינויים אפיגנטיים שונים לפני שאנו מתחייבים לריצוף בתפוקה גבוהה, ומחקרי מעקב פונקציונליים.הפרוטוקול שלנו מספק מדדים של שינויי היסטו גלובליים בדומה לעלילה המערבית. עם זאת, הטכניקה שלנו היא גם מהירה יותר, דורשת פחות תאי קלט, היא כמותית יותר, וניתן להכפיל אותה.

quantification-global-histone-post-translational-modifications-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר שיטה לתיבוי נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ממוחו של העכבר העוברי. הביטוי של המעמד המורכב histocompatibility גדול אני על פני השטח החוץ תאיים של נוירונים מתורבתים מוערך לאחר מכן על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה.

הערכת הביטוי של קומפלקס היסטו-תאימות גדול מחלקה I על נוירונים היפוקמפוס מורין ראשי על ידי Cytometry זרימה

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות חיוביות vGLUT1 וסינפטוזומים גולמיים מסומנים באדום pHRodo באמצעות ציטומטריית זרימה.

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

פרוטוקול זה משלב זרימה ציטומטרית וריצוף RNA של תא בודד כדי לבודד ולאפיין מצבי תאי מיקרוגליה במוח הקטן של מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. הוא משתמש בדיסוציאציה אנזימטית, צנטריפוגה פרקול וצביעה חיסונית כדי לחשוף הטרוגניות של מיקרוגליה ולשפר את ההבנה של תפקידיהם בהתפתחות המוח הקטן ובמחלות.

זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה

ציטומטריית זרימה היא כלי רב עוצמה המאפשר בידוד וחקר של אוכלוסיות תאים ספציפיות. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לבידוד תאים המבטאים LacZ מרקמות שבלול של עכברים טרנסגניים ניאונטליים. תאי שבלול מופרדים סומנו באמצעות סובסטרטים המשורשרים לפלואורופור של β-galactosidase לפני ההפרדה באמצעות ציטומטריית זרימה.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר טיהור של תא כלי הדם של מוח העכבר. כלי מוח מבודדים כוללים תאי אנדותל המקושרים בצמתים הדוקים ומוקפים בלמינה בסיסית רציפה, פריציטים, תאי שריר חלק בכלי הדם, כמו גם ממברנות אסטרוגליאליות סביב כלי הדם.

טיהור של כלי מוח עכבר

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

ניתוח כמותי של תוכן התא בתוך בעצב מאתר קשה עקב מחסור הרקמה. פרוטוקול זה מתאר שיטה רקמות לעיכול, הכנה מספקת מספיק תאים לניתוח cytometry זרימה של אוכלוסיות תאים חיסוניים מרוב עצבים של עכברים בודדים.

ניתוח של תאים חיסוניים העצבים ממוגלה יחיד, גנגליון העזוב השורש של עכבר אחת באמצעות Cytometry זרימה

אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

מטרת מאמר זה היא לספק מדריך מקיף, שיטתית של טיהור יעיל של שינויים היסטוניים H3 ו- H4, כימות של שאריות היסטון acetylated.

טיהור של H3, H4 חלבוני היסטון, כימות של סימני היסטון Acetylated תאים ורקמות המוח

למד כיצד לכמת שינויים גלובליים בהיסטון במיקרוגליה מבודדת ממוח עכבר באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר של שינויים אפיגנטיים לפני ניתוח מעמיק.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

גלה סרטונים נוספים