ייצור נוירוגנין אנושי 2-Inducible Neurons בביוריאקטור תרחיף תלת ממדי

שימוש בביוריאקטורים לתרגום תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או פרוטוקולי תרבית IPSC מדו-ממד לתלת-ממד מאפשר יצירת תאים במספרים גבוהים עבור יישומים בקנה מידה גדול כגון הקרנות בתפוקה גבוהה. פרוטוקול התמיינות עצבי מהיר זה בסביבה פיזיולוגית תלת-ממדית משפר את האינטראקציות בין תאי ההתחלה ומעניק תפוקת תאים גבוהה למשך זמן קצר יותר עם וריאציה נמוכה של אצווה ל=אצווה ובכך מפחית עלויות וזמן. הבנק האירופי של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מיישם גישות דומות ליצירה מהירה וחסכונית של תאים ממוינים על פני שושלות מרובות, כולל תאי מוח אחרים וקרדיומיוציטים.

התחילו לפני הטיפוח כאשר תא הגזע הפלוריפוטנטי המושרה על ידי האדם, או תרבית iPSC אנושית, הוא 60% עד 80% במקביל. שאפו את המדיום לחלוטין מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ושטפו בעדינות את התאים עם 1X DPBS פעמיים. הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA שחוממה מראש לצלחת פטרי בקוטר שישה סנטימטרים ודגרו על התאים במשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.

לאחר מכן, טפחו בעדינות על הכלים כדי להקל על ניתוק התאים או דגרו למשך דקה עד שתיים נוספות אם התאים אינם מתנתקים. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בכל צלחת על ידי הוספת חמישה מיליליטר של אמצעי תחזוקה IPSC ללא מזין עם מעכב ROCK. העבירו את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר או 50 מיליליטר וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג כדי להבטיח סינגולריזציה של התא.

קבע את מספרי התאים ב- 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי והעבר את נפח תרחיף התאים הרצוי לצינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים ב 300 גרם במשך שלוש דקות. לאחר מכן, שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים בשני מיליליטר של אמצעי תחזוקה IPSC ללא מזין עם מעכב ROCK.

ממלאים כל צינור 50 מיליליטר עם 18 מיליליטר של המדיום. לאחר מכן, יש לפזר 20 מיליליטר של תרחיף תאים לכל צינור ביוריאקטור. הכניסו את הצינורות למערכת הביוריאקטור והגדירו את פרמטרי הגידול למשך זמן בלתי מוגבל.

התחל את תוכנית קדם-הטיפוח באמצעות תצוגת הביוריאקטורים. כדי לשנות את המדיה למחרת, הניחו לצבר להתיישב בצינורות הביוריאקטור למשך כחמש דקות לפני שתשאפו בזהירות את הסופרנטנט. הוסף 15 מיליליטר של אמצעי תחזוקה IPSC טרי ללא מזין ללא מעכב ROCK לכל צינור והמשך את הגידול בביוריאקטור העליון במשך 24 שעות.

כדי להתחיל התמיינות עצבית, תנו לצבר להתיישב בצינורות הביוריאקטור ושאפו בזהירות את הסופרנאטנט מהתאים, תוך השארת כחמישה מיליליטר של סופרנאטנט בצינור. לאחר מכן, להוסיף 35 מיליליטר של מדיום אינדוקציה עצבית המורכב מדיום neurobasal ושני מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין. החזירו את הצינורות לביוריאקטור שעל הספסל והמשיכו בטיפוח.

בצע שינויי מדיה מדי יום במשך יומיים, כפי שהודגם בעבר. לאחר שאיפת הסופרנאטנט כפי שהוצג קודם לכן, מעבירים את האגרגטים לצינור סטרילי של 15 מיליליטר או 50 מיליליטר ושוטפים בעדינות את האגרגטים פעמיים עם DPBS. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט ככל האפשר מבלי להפריע לאגרגטים.

לאחר מכן להוסיף שניים עד חמישה מיליליטר של אנזים דיסוציאציה תאים שחומם מראש לכדור, בהתאם לגודל הכדור, ולדגור על התאים במשך כ -10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. השהה מחדש בעדינות את הצברים המשוקעים כל שתי דקות עד שהאגרגטים יתנתקו. הוסף תווך נוירובזאלי שחומם מראש, פי שלושה מנפח אנזים הדיסוציאציה התאית שנוסף קודם לכן, והשהה מחדש את התאים בזהירות כדי להבטיח סינגולריזציה של התא.

קבע את מספרי התאים והעבר את נפח תרחיף התאים המתאים לשימור בהקפאה לצינור של 15 מיליליטר או 50 מיליליטר. צנטריפוגה לתאים ב 300 גרם במשך שלוש דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו בעדינות את גלולת התא בנפח המתאים של מדיום ההקפאה המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד.

Aliquot את תרחיף התא בבקבוקונים מתאימים לשימור בהקפאה. מעבירים את הבקבוקונים מיד למיכל הקפאה מצונן מראש ובקצב איטי מלא ב-2 פרופנול ומניחים את המיכל על מינוס 80 מעלות למשך הלילה. הניחו את הבקבוקונים על מינוס 150 מעלות צלזיוס למחרת לאחסון לטווח ארוך.

לאחר שהתרביות הדבקות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים נותקו, יוחדו והועברו להשעיה, נוצרו אגרגטים תוך 24 שעות והמשיכו לגדול. לאחר יומיים של השראת טרנסגנים, תאי עצב מוקדמים יכולים להישמר בהקפאה להבשלה לאחר מכן. נצפתה התפשטות מתמשכת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים במהלך הימים הראשונים בהשעיה, ומספר תרביות התאים הגיע לשיא לאחר יומיים של זירוז.

עם זאת, גידול ממושך במשך יותר מארבעה ימים בהשעיה לא שיפר את תפוקת התאים, שכן האגרגטים נעשו עמידים יותר ויותר לסינגולריזציה אנזימטית. יתר על כן, בהשוואה ליום האפס, הקוטר המצרפי גדל ב -50% ביום השני וכמעט הוכפל ביום החמישי. למרות שהגדלת הקוטר מגבילה את אספקת החומרים המזינים לאגרגטים, יכולת הקיום של התאים לא הושפעה ביום השני או החמישי להתמיינות.

פרופיל ביטוי הגנים הטמפורלי, כמו גם הצביעה האימונוכימית של הסמנים העצביים בטא שלוש טובולין וחלבון הקשור למיקרוטובול, או MAP2, אישרו את זהות התאים העצביים של תאי ההקפאה של היום השני. בנוסף, תרביות עצביות הועשרו בתעתיקי טאו חלבוניים הקשורים למיקרוטובול, או MAPT, והראו ירידה במקביל בביטוי גורם השעתוק המווסת פלוריפוטנציה POU5F1 רשת עצבית צפופה נוצרה בשבוע הראשון לאחר ההפשרה, מה שהצביע גם על הבשלה גוברת של התרביות העצביות. פרוטוקול זה מניח את היסודות לתרגום לביוריאקטורים בקנה מידה גדול ואוטומטיים לחלוטין, המראים גידול משמעותי נוסף בקיבולת פלט התא עבור יישומים עתידיים בקנה מידה גדול.

לאחר שהוכח עם נוירוגנין 2, השימוש בגורמי שעתוק קובעים ליניאריים כדי להאיץ את ההתמיינות יושם על סוגי תאים רבים ושונים ומחלות כדי להקל על מודלים iPSC.