Name: ייצור נוירוגנין אנושי 2-Inducible Neurons בביוריאקטור תרחיף תלת ממדי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: למדו פרוטוקול להפקת נוירונים מתאי גזע אנושיים באמצעות ביוריאקטור תרחיף תלת ממדי. השיטה מאפשרת תפוקת תאים גבוהה והבדלה עצבית מהירה בסביבה פיזיולוגית ליישומים בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט EBiSC2 קיבל מימון מיוזמת התרופות החדשניות 2 Joint Undertaking (JU) תחת הסכם מענק מספר 821362. JU מקבל תמיכה מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי ומ- EFPIA. אנו מודים לנדין סמנדזיץ', הלן ד. מ. המר, ג'ון-מג'ד בלסטרס וונסה מ. נלוואג'ה על עזרתם בניתוחים אימונוציטוכימיים וביטוי גנים, כמו גם להייקה ארת'ן על תמיכתה הטכנית המצוינת. יתר על כן, אנו מודים לסטפני בר על הקמת תוכנית הביוריאקטורים. איור 2A נוצר באמצעות BioRender.com.

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

הביטוי החוץ רחמי של גורם השעתוק העצבי NGN2 הוכח בעבר כמאיץ שלבים מוקדמים של התמיינות עצבית וגורם למחויבות לשושלת עצבית ב- hiPSCs תוך שבוע אחד מהטיפוח12,13,20. עבודה זו מתארת פרוטוקול מפורט להתמיינות של BIONi010-C-13 hiPSCs ערוכים גנטית לנוירונים iNGN2 באמצעות ביוריאקטור benchtop.
CERO 3D bioreactor הוא ביוריאקטור בנפח נמוך עם ארבעה חריצים עבור צינורות מיוחדים, כל אחד עם קיבולת מקסימלית של 50 מ"ל. הטמפרטורה ורמות ה-CO2 נשלטות ברציפות ופרמטרי הגידול (למשל, מהירות סיבוב וזמן) מוסדרים עבור כל צינור, מה שמאפשר למשתמשים להריץ מספר גישות בידול במקביל. שוברי גלים משולבים על דופן הצינור הפנימי מאפשרים הפרעה של התווך עם לחץ גזירה נמוך ושומרים על אגרגטים תלת ממדיים במתלים במהלך סיבוב מבוקר. גישה מוגבלת לחומרים מזינים, כמו גם אינטראקציות תלת-ממדיות של תאים ומטריצה חוץ-תאית (ECM), עשויות להשפיע באופן משמעותי על התמיינות התא והתנהגותו24,25,26,27.
תרבית תאים כצברים תלת-ממדיים בתרחיף מגדילה את האינטראקציות בין התאים הללו, ובכך מחקה את סביבת in vivo של רקמות או איברים באופן הדוק יותר28. ההפרעה המקבילה של התווך מווסתת את גודל המצרף עקב חיכוך מכני, משפרת את חילוף הגזים ומפחיתה את שיפוע חומרי המזון והפסולת בצינור, תוך שמירה על שיפועים פיזיולוגיים רלוונטיים בתוך הצברים 29,30,31,32,33,34. למרות ששינויים בינוניים מבוצעים באופן ידני, הביוריאקטור מפחית את עלויות העבודה והתפעול בהשוואה לצלוחיות תרבית סטטיות. הביוריאקטור מציע גם מספר יתרונות על פני ביוריאקטורים אוטומטיים לחלוטין, שכן העיצוב נטול האימפלר מפחית את לחץ הגזירה ההידרודינמי על פני השטח המצרפיים, ובכך לא רק משפר את הישרדות התא, אלא גם מגביל את ההשפעות של לחץ גזירה על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים רגישים, התמיינות תאים ותפקוד35,36,37,38.
ביוריאקטורים של גלגל אנכי, שבהם תאים נסערים על ידי אימפלר אנכי גדול, כמו גם ביוריאקטורים מתנדנדים באמצעות שקיות תרבית מנופחות המחוברות לפלטפורמה ממונעת, מייצגים פלטפורמות מתלה תלת-ממדיות חלופיות. למרות שנבדקו יתר על המידה לגידול hiPSCs 17,18,19,39,40, מעט ידוע על יישומם בגישות התמיינות עצבית, והדיווחים מוגבלים להתרחבות מוצלחת של תאים מקדימים עצביים של יונקים ובני אדם בביוריאקטורים 41,42,43,44, עם מספר נדיר של מחקרים המתמקדים התבגרות44,45. באופן כללי, פלטפורמות מתלים תלת-ממדיות אוטומטיות מציעות את היתרון של שינויי ביניים אוטומטיים לחלוטין ומבוקרי מחשב, ובכך מפחיתות את השונות בטיפול וממזערות את הסיכון לזיהום. יתר על כן, פרמטרים תזונתיים כגון ריכוז לקטט וגלוקוז ניתן לנטר ברציפות. עם זאת, הקמת מערכות אלה דורשת לעתים קרובות השקעה ראשונית משמעותית, שטח מעבדה, והכשרה של כוח אדם מוסמך. הביוריאקטור הבנצ'טופ מייצג חלופה קומפקטית וקלה לשימוש לגידול תאים בתרחיף, אך אינו מספק ניטור מקביל של חומרים מזינים.
כמו ברוב הפרוטוקולים המשמשים לטיפוח תאים בפלטפורמות השעיה תלת-ממדיות, היווצרות ראשונית של אגרגטים מייצגת צעד קריטי. hiPSCs מתורבתים כחד-שכבות דבקות ולאחר מכן מועברים כתרחיפים חד-תאיים לסביבה תלת-ממדית. כדי למזער את אובדן התאים בשלב זה, יש לקחת בחשבון מספר היבטים. תכנון הצינורות עם שוברי הגלים המשולבים פירושו שנדרש נפח תרבית מינימלי של 10 מ"ל לכל צינור כדי להבטיח הפרעה בינונית אופטימלית. לכן אין להמעיט בנפח הקריטי בטווח הארוך. יתר על כן, צפיפות זריעה התחלתית של 7.5 מיליון תאים לכל 10 מ"ל נפח תרבית, ומהירות סיבוב של 60 סל"ד, מומלצת מאוד ליצירת אגרגטים יציבים בטווח הקצר, אם כי התאמות עשויות להיות נחוצות בהתאם לקו התא.
לאחר העברת hiPSCs להשעיה, אגרגטים צריכים להיווצר בתוך 24 שעות. השינוי הבינוני הראשון הוא קריטי, מכיוון שהאגרגטים קטנים ועלולים שלא להתיישב כראוי. זמן שקיעת האגרגטים יכול להיות מוארך אך לא יעלה על יותר מ -10 דקות, מכיוון שצברים עשויים להתחיל להתגבש ולגדול בצורה הטרוגנית. במהלך השאיפה, נפח תרבית מינימלי של 5 מ"ל יש להשאיר בצינור, וכל הפרעות של המדיום יש להימנע. עם זאת, אובדן של תאים וצברים צפוי במהלך השלבים הראשונים. ספירת תאים מצביעה על תפוקת תאים קבועה במהלך היומיים הראשונים בתרבית, מה שמצביע על כך שיכולת ההתרבות הגבוהה של hiPSCs מפצה על אובדן התאים הראשוני. ברגע שהם בהשעיה, הטיפוח וההפרעה העדינים מובילים לצברים בגודל הומוגני שמתחילים לצמוח עם הזמן.
התמיינות עצבית בוצעה על פי פרוטוקול שפורסם בעבר המבוסס על ביטוי יתר NGN2 המושרה על ידי דוקסיציקלין13, והצעדים הבודדים עברו אופטימיזציה לגידול תלת ממדי. גורם השעתוק העצבי NGN2 הוא מניע מתואר היטב בהתמיינות עצבית ומאיץ אינדוקציה עצבית באופן משמעותי11,13,46. בעוד שדפוסים קונבנציונליים עם גורמי גדילה מוגדרים אורכים מספר שבועות עד חודשים 7,8,9, ביטוי NGN2 גורם לגורל תאי עצב תוך ימים. בנוסף לקיצור זמן הגידול, הפרוטוקול אינו תלוי בגורמי גדילה יקרים או בציפוי מטריצות לתרבית התרחיף הראשונית, ובכך מוזיל את עלויות הגידול בנוסף.
יתר על כן, השוואה ישירה של דור NGN2 של נוירונים לא בוגרים בתרביות דבק ותרחיף חשפה גידול של פי 1.36 בתאים לאחר 4 ימים בתרבית באמצעות ביוריאקטור20, בעוד נפח התווך הדרוש לייצור של מיליון תאים צפוי להיות חצי חצי. לכן, שימוש בביוריאקטור מסוג benchtop לייצור נוירונים iNGN2 עשוי להיות מועיל, שכן ניתן לייצר מספר גבוה יותר של תאים עם זמן טיפול ועלות נמוכים יותר. בהתאם לדיווחים קודמים, מחויבות לשושלת עצבית נצפתה בשלב מוקדם. לאחר יומיים של השראת NGN2, ניכר ביטוי עמוק של סמנים עצביים קלאסיים כגון TUBB3, MAP2 ו- MAPT, התומכים בתחולת הביוריאקטור הבנצ'טופ להשראת נוירונים. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן להשיג כ-6.2 מיליון נוירוני iNGN2 לא בשלים ממיליון תאי גזע גזעיים (HiPSCs) תוך 4 ימים מהתרבית. עם זאת, קיבולת התפוקה עשויה להשתנות בין אצוות שונות ותלויה בנפח תרבית ההשעיה בעת הזריעה.
כדי להגדיל את היבול עוד יותר, זמן הגידול הוארך ב -3 ימים נוספים; עם זאת, למרות שהאגרגטים נעשו גדולים יותר, הם גם הפכו קומפקטיים מאוד ולא ניתן היה לנתק אותם כראוי לצורך שימור בהקפאה או ציפוי מחדש. למרות ההתקדמות בגישות של תרביות תלת-ממדיות, תרביות נוירונים דו-ממדיות הן עדיין תקן הזהב לניתוחים פונקציונליים כמו מערכי מיקרואלקטרודות או הדמיית סידן. סינגולריזציה של תאים היא לפיכך תנאי מוקדם חשוב עבור מונושכבה עצבית הומוגנית ורשת עצבית. ניתן להשתמש בניתוק מכני חזק יותר של התאים או בריאגנטים קשים של דיסוציאציה כדי להבטיח סינגולריזציה, אך עם השפעות פוטנציאליות על יכולת הקיום של התא, הפיזיולוגיה ויכולת ההתקשרות מחדש47,48. באשר לצורך בתאים בודדים לניתוחים והתבגרות נוספים, הצברים נותקו לאחר 4 ימים בהשעיה, והנוירונים (יום 2) iNGN2 נשמרו בהקפאה. התמיינות ואפיון של נוירונים iNGN2 לאחר הפשרה אישרו בגרות גוברת של התרביות העצביות והיווצרות רשת עצבית צפופה.
הפרוטוקול המסופק מניב מספר גבוה של נוירונים iNGN2. עם זאת, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות. באשר לרוב פלטפורמות תרביות ההשעיה, העברת hiPSCs מתרבות דבקה דו-ממדית לסביבה תלת-ממדית היא קריטית וקשורה לעתים קרובות לאובדן תאים עמוק. אובדן משמעותי נוסף של תאים ומצרפיים צפוי במהלך שינויים במדיה. בהשוואה לפלטפורמות אוטומטיות, זמן הטיפול וסיכוני הזיהום באמצעות הביוריאקטור הבנצ'טופ גדלים, מכיוון שיש לבצע שינויים בינוניים באופן ידני. מלבד היעדר אוטומציה, הביוריאקטור אינו מציע את האפשרות לפקח על החומרים המזינים, והקיבולת המקסימלית של 50 מ"ל לכל צינור מגבילה את פוטנציאל השדרוג של הפרוטוקול. לבסוף, חשוב לציין כי למרות ש-NGN2 מאיץ את מחויבות השושלת העצבית, משך ההתבגרות הסופנית אינו מתקצר ועדיין דורש תרבית ארוכת טווח במשך מספר שבועות. בהתחשב בחשיבות התמיכה האסטרוציטית לתפקוד עצבי, התקשרות והישרדות 49,50,51, יש לשקול גישות של תרבות משותפת, ועשויות אפילו להיות חיוניות לטיפוח לטווח ארוך.
לסיכום, פרוטוקול התמיינות דו-ממדי תורגם בהצלחה לסביבה תלת-ממדית לייצור מהיר וניתן לשחזור של נוירוני iNGN2 על ידי יישום ביו-ריאקטור בנצ'טופ. הפרוטוקול המתואר מניב כמויות גבוהות של נוירונים באיכות טובה, שמקורם ב-iPSC, אשר עשויים לשמש כנקודת מוצא לבדיקות מודל מורכבות, בדיקות תרופות בתפוקה גבוהה ומבחני רעילות בקנה מידה גדול.

הפרעות נוירולוגיות הן הגורם המוביל לנכות ברחבי העולם1. אחד מכל שישה אנשים נפגע, והתחלואה ממשיכה לעלות. הנטל הכלכלי הנלווה על חברות ומערכות הבריאות שלהן הוא עצום. הערכה של 30 מדינות אירופיות בשנת 2010 העריכה עלויות שנתיות של 800 מיליארד אירו הקשורות להפרעות נפשיות ונוירולוגיות2. הנטל החברתי-כלכלי הגובר דורש אסטרטגיות טיפול יעילות, ואף על פי שהבנתנו את הפתופיזיולוגיה של מחלות גדלה באופן משמעותי, התרגום למרפאות לעתים קרובות אינו מספיק. באופן כללי, רק 12% מהתרופות נכנסות לניסויים קליניים, מתוכם יותר מ -80% נכשלות בשלבים מאוחרים יותר, בעיקר בגלל חוסר יעילות או רעילות בלתי צפויה 3,4. הסיבות לכך מגוונות, אך יכולת ההעברה המוגבלת מניסויים בבעלי חיים בשלבים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם באה לידי ביטוי יותר ויותר5. מודלים אנושיים של תאי מבחנה ורקמות עשויים לגשר על הפער של תרגום בין מינים, ולהתקדמות בטכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (hiPSC) יש פוטנציאל גדול בהקשר זה. hiPSCs נמצאים בשימוש נרחב במחקר בסיסי וחולקים מאפיינים חיוניים עם תאי גזע עובריים (hESCs), כגון יכולת התחדשות עצמית כמעט בלתי מוגבלת והיכולת להתמיין לכל שלוש שכבות הנבט6, תוך עקיפת חששות אתיים הקשורים להשמדת עוברים.
הנגזרת של תאים עצביים מתאי גזע עובריים עובריים, ומאוחר יותר מתאי גזע עובריים, סימנה אבן דרך בחקר המוח. פרוטוקולי התמיינות ראשוניים התבססו על יישום גורמי גדילה המחקים שלבים קריטיים במהלך אמבריוגנזה, רובם כללו עיכוב SMAD כפול או בתרביות השעיה או בתרביות דבק 7,8,9. תאי עצב בוגרים נוצרו בהצלחה, אך מספר חסרונות של פרוטוקולים אלה עדיין מעכבים את השימוש הרחב בהם בפיתוח תרופות, כגון התפוקה הנמוכה והשונות הגבוהה בין אצווה לאצווה של תאי עצב שנוצרו, כמו גם עומס העבודה הנרחב הקשור לזמני תרבית ארוכים. שיפורים הושגו על ידי ביטוי כפוי של גורמי שעתוק המעורבים באופן קריטי בנוירוגנזה, ובני משפחת הנוירוגנין (NGN), במיוחד NGN2, זוהו כמניעים יעילים10. הביטוי החוץ רחמי בתיווך לנטי-ויראלי של NGN2 בתאי גזע גזעיים גבוהים האיץ את השלבים המוקדמים של התמיינות עצבית באופן משמעותי, וגרם לגורל תאי עצב תוך שבוע11 בלבד. הבשלה סופנית מאוחרת יותר בתרביות משותפות עם אסטרוציטים הניבה נוירונים פונקציונליים ברמת טוהר וכמות גבוהים עם תכונות הניתנות לשחזור. עריכה גנטית מכוונת אתר של אתר שילוב וירוסים הקשור לאדנו 1 (AAVS1) יושמה לאחר מכן כדי ליצור קווי hiPSC עם קלטת ביטוי יציבה ודוקסיציקלין עבור NGN212,13, ובכך למזער תופעות לוואי לא רצויות של מתן לנטיויראלי.
ההתמיינות החזקה והיעילה של נוירוגנין 2 (iNGN2) המושרה על ידי דוקסיציקלין טומנת בחובה פוטנציאל גדול לבדיקות תרופות פנוטיפיות בתפוקה גבוהה ומבחני רעילות10,14,15; והתקדמות משמעותית בעיבוד ביולוגי נעשתה במהלך העשור האחרון ביישום ביוריאקטורים להרחבה והתמיינות של תאים ניתנים להרחבה והתמיינות 16,17,18,19. עם זאת, רוב פרוטוקולי הבידול מותאמים לתרבויות דבקות, ותרגום לסביבה תלת-ממדית (3D) דורש לעתים קרובות שינויים חיוניים. לאחרונה, דווח על שימוש מוצלח בביוריאקטור תלת-ממדי עם תכונות לחץ גזירה מופחתות להרחבת hiPSCs ולהתמיינות הניתנת לשחזור להפטוציטים, קרדיומיוציטים ונוירונים20. כאן, פרוטוקול מפורט ליצירה ואפיון של נוירונים iNGN2 מסופק באמצעות ביוריאקטור תלת-ממדי זהה.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול 50 מ"מ</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11528926</tr><tr><td>60 מ"מ Nunclon Delta Surface</td><td>Nunc</td><td>734-2040</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן טובולין אנטי-בטא III [TU-20] (דילול 1:1,000)</td><td>Abcam&nbsp; &nbsp;</td><td>ab7751&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אפלייד ביוסיסטמס&nbsp; ערכת שעתוק הפוך cDNA בעלת קיבולת גבוהה</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10400745 תוסף B-27 (פי 50)&nbsp;</td><td>תוסף ללא סרום של Gibco</td><td>11530536</td><td>(50x)</td></tr><tr><td>BIONi010-C-13 קו hiPSC</td><td>הבנק האירופי לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (EBiSC), BIONEER כמפקיד</td><td>SAMEA103988285</td><td>Bioneer הוא מפקיד ב-EBiSC והבעלים של קו hiPSC.</td></tr><tr><td>ביוראנדר&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Biorender.com</tr><tr><td>תרבית תאים BSA בדרגת</td><td>תרמו פישר מדעי&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12330023</tr><tr><td>CERO 3D Incubator & Bioreactor</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800000</td><td></td></tr><tr><td>CEROtubes צינורות תרבית תאים 50 מ"ל</td><td>OLS OMNI מדעי החיים</td><td>2800005</td><td></td></tr><tr><td>Citavi 6</td><td>תוכנה</td><td></td><td></td>אקדמית שוויצרית</tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stemcell</td><td>7930</td><td>מדיום הקפאה המכיל 10% DMSO</td></tr><tr><td>Cytofix Fixation Solution</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td>תמיסת קיבוע 554655 המכילה 4% פרפורמלדהיד&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (כתם תאים קבועים של NUCBLUE)&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12333553</tr><tr><td>דוקסיציקלין הידרוכלוריד (DOX)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D3447</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ללא סידן ומגנזיום (DPBS -/-)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS עם סידן ומגנזיום (DPBS +/+)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11580456</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-/-)</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, תוסף GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL מערכת הדמיית תאי ליבה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>תוסף גלוטה-מקס&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>35050-038</td><td>דיפפטיד L-alanyl-L-גלוטמין מיוצב</td></tr><tr><td>ImageJ 1.51v&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אינסולין אנושית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I9278l</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 נוגדן חד שבטי (דילול 1: 300)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>13-1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה מופחת של Matrigel, ללא פנול-אדום&nbsp;</td><td>קורנינג מדעי החיים&nbsp;</td><td></td><td>356231 מטריצת קרום הבסיס</td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11140035 ערכת סרט דבק אופטי MicroAmp&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10095714</tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell</td><td>85850</td><td>מדיום תחזוקה iPSC ללא מזין&nbsp;</td></tr><tr><td>תוסף N-2 (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>תוסף ללא סרום על בסיס בוטנשטיין s N-1 ניסוח</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>11570556</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2</td><td>Nikon Instruments Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter-NC200</td><td>ChemoMetec A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 2021</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>מאגר סלסול/שטיפה&nbsp;</td><td>BD ביוסיינס&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>בדיקת פריימר TUBB3(Hs00801390_s1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת פריימר GAPDH (Hs99999905_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer Assay GUSB (Hs99999908_m1)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer Assay HPRT1 (Hs99999909_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת פריימר MAP2 (Hs00258900_m1)</td>בדיקת פריימר <td>11620099</td><td></td> <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>MAPT (Hs00902194_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Primer Assay POU5F1 (Hs04260367_gH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין 0.01%</td> <td>Merck</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>ערכת בידוד RNA מבוססת עמודות</td></tr><tr><td>RLT מאגר</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>מאגר ליזה תאים</td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>12539059</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td></td><td>11599686 אנזים דיסוציאציה של תאים</td></tr><tr><td>TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>11380912 qPCR מאסטר מיקס</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>תמיסת Trypsin-EDTA</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Via1-Cassette</td><td>ChemoMetec A/S</td><td>941-0012</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה מסוננות רחבות Thermo</td><td>Fisher 10088880</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי X20 אופטי 96WELL FAST CLEAR RESPONSE PLATES&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206343</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד, מעכב Rho kinase (מעכב ROCK)</td> <td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור נוירוגנין אנושי 2-inducible neurons בביוריאקטור תרחיף תלת ממדי

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

הגזירה של תאי שושלת עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) סימנה אבן דרך בחקר המוח. מאז הופעתם הראשונה, פרוטוקולים עברו אופטימיזציה מתמדת וכעת נמצאים בשימוש נרחב במחקר ופיתוח תרופות. עם זאת, משך הזמן הארוך מאוד של פרוטוקולי בידול והתבגרות קונבנציונליים אלה והביקוש הגובר ל- hiPSCs באיכות גבוהה ונגזרותיהם העצביות מעלים את הצורך באימוץ, אופטימיזציה וסטנדרטיזציה של פרוטוקולים אלה לייצור בקנה מידה גדול. עבודה זו מציגה פרוטוקול מהיר ויעיל להבחנה של נוירוגנין 2 (iNGN2) מהונדס גנטית, המושרה על ידי דוקסיציקלין - המבטא hiPSCs לנוירונים באמצעות ביוריאקטור תרחיף תלת-ממדי (3D).
בקצרה, תרחיפים חד-תאיים של iNGN2-hiPSCs הורשו ליצור אגרגטים תוך 24 שעות, ומחויבות השושלת העצבית נגרמה על ידי תוספת של דוקסיציקלין. האגרגטים נותקו לאחר יומיים של אינדוקציה והתאים נשמרו בהקפאה או צופו מחדש להבשלה סופנית. תאי העצב שנוצרו iNGN2 ביטאו סמנים עצביים קלאסיים בשלב מוקדם ויצרו רשתות עצביות מורכבות תוך שבוע לאחר ציפוי מחדש, מה שמצביע על בגרות גוברת של תרביות עצביות. לסיכום, פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב ליצירה מהירה של נוירונים שמקורם ב-hiPSC בסביבה תלת-ממדית מסופק הטומן בחובו פוטנציאל גדול כנקודת מוצא למידול מחלות, בדיקות תרופות פנוטיפיות בעלות תפוקה גבוהה ובדיקות רעילות בקנה מידה גדול.

במהלך השלבים הראשונים, תרביות דבק של hiPSCs מנותקות, ייחודיות ומועברות לתרחיף (איור 2). אגרגטים נוצרים בתוך 24 שעות וגדלים ברציפות בגודל. לאחר יומיים של השראת טרנסגנים, נוירונים מוקדמים יכולים להישמר בהקפאה לניסויים הבאים.
ההתפשטות המתמשכת בימים הראשונים של ההשעיה מניבה עלייה במספר התאים, ומגיעה לשיאה לאחר יומיים של זירוז (איור 3A,B). יחד עם ההתפשטות, האגרגטים מתחילים לגדול. בהשוואה ליום 0, הקוטר מראה עלייה של 50% ביום 2, והוא כמעט הוכפל ביום 5 (איור 3D). אף על פי שקוטר הולך וגדל מגביל את אספקת חומרי המזון בתוך האגרגטים, יכולת הקיום של התאים אינה מושפעת ביום 2 או ביום 5 להתמיינות (איור 3C). אולם גידול ממושך במשך יותר מ-4 ימים בתרחיף אינו משפר עוד יותר את תפוקת התאים, מאחר שהאגרגטים נעשים עמידים יותר ויותר לסינגולריזציה אנזימטית (איור 3B).
לאחר שימור בהקפאה, תאי יום 2 מופשרים ומצופים על כלים מצופים פולי-L-אורניתין (PLO)-למינין להבשלה סופנית. באופן כללי, תאים נצמדים היטב לאחר הפשרה, ומתחילים להאריך נוירוטים בשלב מוקדם. פרופיל ביטוי הגנים הרקתי, כמו גם צביעה אימונוציטוכימית עבור הסמנים העצביים TUBB3 ו-MAP2, מאשרים את זהות התא העצבי (איור 4A,B). בנוסף לרמות העולות של TUBB3 ו-MAP2, תרביות עצביות מועשרות בתעתיקי טאו של חלבון הקשור למיקרוטובולים (MAPT), המקודדים חלבון עצבי המעורב בייצוב אקסונים, ומראות ירידה במקביל בביטוי גורם השעתוק המווסת פלוריפוטנציה POU5F1. יתר על כן, רשת עצבית צפופה נוצרת בשבוע הראשון לאחר ההפשרה (איור 4C). שינויים מורפולוגיים אלה, בשילוב עם פרופיל השעתוק, מצביעים על הבשלה הולכת וגוברת של התרביות העצביות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig02.jpg"> איור 2: יצירת תאי עצב iNGN2 שמקורם ב-hiPSC באמצעות ביוריאקטור בנצ'טופ. (A) סקירה סכמטית של פרדיגמת ההתמיינות, המדגישה את שלבי המפתח של תרבית תאים. (ב-ו) תמונות Brightfield ממחישות (B) hiPSCs ו-(C,D) היווצרות אגרגטים בביוריאקטור הספסל. (E,F) תאי עצב iNGN2 מרחיבים את תאי העצב ועוברים שינויים מורפולוגיים במהלך ההתמיינות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: BMM = מטריצת קרום מרתף; iPSC-MM = אמצעי תחזוקה iPSC; אש"ף = פולי-L-אורניתין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig03.jpg"> איור 3: תפוקת תאים וכדאיות במהלך היווצרות וגדילה של תאים. (A) תמונות ברייטפילד מתארות את היווצרות האגרגטים בתוך יומיים מהתרבית בביוריאקטור הספסל, כמו גם את הגידול בגודל המצרפיים לאורך זמן. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) כימות תפוקת התא ו-(C) כדאיות לאורך מסלול ההתמיינות. תרשימי עמודות מייצגים את הממוצע + SD מארבעה ניסויים בלתי תלויים. (D) הקוטר, המעיד על גודל האגרגטים, נקבע באופן חצי אוטומטי באמצעות תוכנת הקוד הפתוח ImageJ (גרסה 1.53). ראשית, תמונות שדה בהיר הומרו לתמונות בינאריות, ולאחר מכן הוערכו עוד יותר באמצעות הכלי ניתוח חלקיקים, תוך החלת הפרמטרים הבאים: גודל &gt; 2,500 מיקרומטר2, מעגליות 0.45-1, לא לכלול קצוות, ולכלול חורים. קווים אופקיים מציינים את הממוצע ± SD של חמישה הבדלים בלתי תלויים. נקודות בודדות מייצגות את הממוצע של ניסויי התמיינות בודדים עם לפחות 20 אגרגטים לכל נקודת זמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig04.jpg"> איור 4: אפיון תאי עצב iNGN2 שמקורם ב-hiPSC. פרופיל ביטוי גנים טמפורלי עבור הגנים העצביים TUBB3, MAP2 ו- MAPT, כמו גם הגן הקשור לתאי גזע פלוריפוטנטיים POU5F1. רמות הביטוי היחסיות נורמלו לגני הייחוס GAPDH, HPRT1 ו-GUSB. hiPSCs בלתי מובחנים (יום-2) נבחרו ככיול. הסמלים הגיאומטריים מציינים את הממוצע ± SD של ארבעה הבדלים בלתי תלויים. (B) תמונות מייצגות של תאי עצב iNGN2 ביום 7 לאחר ההפשרה (יום-2+7), מוכתמים עבור בטא-III-טובולין (TUBB3, מגנטה) וחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2, ציאן). גרעיני התא הוכתמו ב-DAPI. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) הערכת הרשת העצבית בתמונות שדה בהיר של תרביות עצביות לאחר הפשרה. האורך הכולל של תאי עצב נקבע באזור של 930.82 × 698.11 מיקרומטר2 באמצעות ImageJ (גרסה 1.53). לאחר התאמת הבהירות והניגודיות, התמונות הומרו לתמונות של 8 סיביות והצבעים היו הפוכים. לאחר מכן נוירוטים עברו שלד ולאחר מכן נותחו באמצעות תוספי ImageJ 'Skeletonize' ו-'Analyze Skeleton', בהתאמה. האורך הכולל של תאי העצב חולק במספר הסומות באזור העניין כדי להניב את אורך הנוירוט הממוצע / התא. תרשימי עמודות מייצגים את הממוצע + SD משלושה ניסויים בלתי תלויים. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת תאי עצב פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים בביוריאקטור תרחיף תלת-ממדי של ספסל.

ייצור נוירוגנין אנושי 2-Inducible Neurons בביוריאקטור תרחיף תלת ממדי

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...

שימוש בביוריאקטורים לתרגום תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או פרוטוקולי תרבית IPSC מדו-ממד לתלת-ממד מאפשר יצירת תאים במספרים גבוהים עבור יישומים בקנה מידה גדול כגון הקרנות בתפוקה גבוהה. פרוטוקול התמיינות עצבי מהיר זה בסביבה פיזיולוגית תלת-ממדית משפר את האינטראקציות בין תאי ההתחלה ומעניק תפוקת תאים גבוהה למשך זמן קצר יותר עם וריאציה נמוכה של אצווה ל=אצווה ובכך מפחית עלויות וזמן. הבנק האירופי של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מיישם גישות דומות ליצירה מהירה וחסכונית של תאים ממוינים על פני שושלות מרובות, כולל תאי מוח אחרים וקרדיומיוציטים.התחילו לפני הטיפוח כאשר תא הגזע הפלוריפוטנטי המושרה על ידי האדם, או תרבית iPSC אנושית, הוא 60% עד 80% במקביל. שאפו את המדיום לחלוטין מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ושטפו בעדינות את התאים עם 1X DPBS פעמיים. הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA שחוממה מראש לצלחת פטרי בקוטר שישה סנטימטרים ודגרו על התאים במשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.לאחר מכן, טפחו בעדינות על הכלים כדי להקל על ניתוק התאים או דגרו למשך דקה עד שתיים נוספות אם התאים אינם מתנתקים. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בכל צלחת על ידי הוספת חמישה מיליליטר של אמצעי תחזוקה IPSC ללא מזין עם מעכב ROCK. העבירו את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר או 50 מיליליטר וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג כדי להבטיח סינגולריזציה של התא.קבע את מספרי התאים ב- 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי והעבר את נפח תרחיף התאים הרצוי לצינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים ב 300 גרם במשך שלוש דקות. לאחר מכן, שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים בשני מיליליטר של אמצעי תחזוקה IPSC ללא מזין עם מעכב ROCK.ממלאים כל צינור 50 מיליליטר עם 18 מיליליטר של המדיום. לאחר מכן, יש לפזר 20 מיליליטר של תרחיף תאים לכל צינור ביוריאקטור. הכניסו את הצינורות למערכת הביוריאקטור והגדירו את פרמטרי הגידול למשך זמן בלתי מוגבל.התחל את תוכנית קדם-הטיפוח באמצעות תצוגת הביוריאקטורים. כדי לשנות את המדיה למחרת, הניחו לצבר להתיישב בצינורות הביוריאקטור למשך כחמש דקות לפני שתשאפו בזהירות את הסופרנטנט. הוסף 15 מיליליטר של אמצעי תחזוקה IPSC טרי ללא מזין ללא מעכב ROCK לכל צינור והמשך את הגידול בביוריאקטור העליון במשך 24 שעות.כדי להתחיל התמיינות עצבית, תנו לצבר להתיישב בצינורות הביוריאקטור ושאפו בזהירות את הסופרנאטנט מהתאים, תוך השארת כחמישה מיליליטר של סופרנאטנט בצינור. לאחר מכן, להוסיף 35 מיליליטר של מדיום אינדוקציה עצבית המורכב מדיום neurobasal ושני מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין. החזירו את הצינורות לביוריאקטור שעל הספסל והמשיכו בטיפוח.בצע שינויי מדיה מדי יום במשך יומיים, כפי שהודגם בעבר. לאחר שאיפת הסופרנאטנט כפי שהוצג קודם לכן, מעבירים את האגרגטים לצינור סטרילי של 15 מיליליטר או 50 מיליליטר ושוטפים בעדינות את האגרגטים פעמיים עם DPBS. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט ככל האפשר מבלי להפריע לאגרגטים.לאחר מכן להוסיף שניים עד חמישה מיליליטר של אנזים דיסוציאציה תאים שחומם מראש לכדור, בהתאם לגודל הכדור, ולדגור על התאים במשך כ -10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. השהה מחדש בעדינות את הצברים המשוקעים כל שתי דקות עד שהאגרגטים יתנתקו. הוסף תווך נוירובזאלי שחומם מראש, פי שלושה מנפח אנזים הדיסוציאציה התאית שנוסף קודם לכן, והשהה מחדש את התאים בזהירות כדי להבטיח סינגולריזציה של התא.קבע את מספרי התאים והעבר את נפח תרחיף התאים המתאים לשימור בהקפאה לצינור של 15 מיליליטר או 50 מיליליטר. צנטריפוגה לתאים ב 300 גרם במשך שלוש דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו בעדינות את גלולת התא בנפח המתאים של מדיום ההקפאה המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד.Aliquot את תרחיף התא בבקבוקונים מתאימים לשימור בהקפאה. מעבירים את הבקבוקונים מיד למיכל הקפאה מצונן מראש ובקצב איטי מלא ב-2 פרופנול ומניחים את המיכל על מינוס 80 מעלות למשך הלילה. הניחו את הבקבוקונים על מינוס 150 מעלות צלזיוס למחרת לאחסון לטווח ארוך.לאחר שהתרביות הדבקות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים נותקו, יוחדו והועברו להשעיה, נוצרו אגרגטים תוך 24 שעות והמשיכו לגדול. לאחר יומיים של השראת טרנסגנים, תאי עצב מוקדמים יכולים להישמר בהקפאה להבשלה לאחר מכן. נצפתה התפשטות מתמשכת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים במהלך הימים הראשונים בהשעיה, ומספר תרביות התאים הגיע לשיא לאחר יומיים של זירוז.עם זאת, גידול ממושך במשך יותר מארבעה ימים בהשעיה לא שיפר את תפוקת התאים, שכן האגרגטים נעשו עמידים יותר ויותר לסינגולריזציה אנזימטית. יתר על כן, בהשוואה ליום האפס, הקוטר המצרפי גדל ב -50% ביום השני וכמעט הוכפל ביום החמישי. למרות שהגדלת הקוטר מגבילה את אספקת החומרים המזינים לאגרגטים, יכולת הקיום של התאים לא הושפעה ביום השני או החמישי להתמיינות.פרופיל ביטוי הגנים הטמפורלי, כמו גם הצביעה האימונוכימית של הסמנים העצביים בטא שלוש טובולין וחלבון הקשור למיקרוטובול, או MAP2, אישרו את זהות התאים העצביים של תאי ההקפאה של היום השני. בנוסף, תרביות עצביות הועשרו בתעתיקי טאו חלבוניים הקשורים למיקרוטובול, או MAPT, והראו ירידה במקביל בביטוי גורם השעתוק המווסת פלוריפוטנציה POU5F1 רשת עצבית צפופה נוצרה בשבוע הראשון לאחר ההפשרה, מה שהצביע גם על הבשלה גוברת של התרביות העצביות. פרוטוקול זה מניח את היסודות לתרגום לביוריאקטורים בקנה מידה גדול ואוטומטיים לחלוטין, המראים גידול משמעותי נוסף בקיבולת פלט התא עבור יישומים עתידיים בקנה מידה גדול.לאחר שהוכח עם נוירוגנין 2, השימוש בגורמי שעתוק קובעים ליניאריים כדי להאיץ את ההתמיינות יושם על סוגי תאים רבים ושונים ומחלות כדי להקל על מודלים iPSC.

production-human-neurogenin-2-inducible-neurons-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

כאן אנו מתארים את השימוש של הרכבה עצמית 3 ממדי הפיגום לתרבות תאים אנושיים אבי עצביים. אנו מציגים פרוטוקול לשחרר את התאים מן הפיגומים כדי להיות מנותח למשל לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה. פרוטוקול זה עשוי להתאים סוגי תאים אחרים לבצע מחקרים מפורטים באופן מכניסטי.

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

סרטון זה מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים (תאי גזע עובריים) לנוירונים דופמינרגיים, כדי לספק מודל לחקר מחלת פרקינסון. תאי גזע עובריים בתרבית בתווך אינדוקציה עצבי בצלחת מיקרו-באר כדי ליצור נוירוספרות תלת-ממדיות. לאחר מכן הם מתורבתים במדיום אינדוקציה עצבי כדי לקדם את ההתמיינות לנוירוני אב דופמינרגיים. ההבשלה הסופית של תאי העצב מתרחשת בהחדרת תרבית בתנאי ממשק אוויר-נוזל, וכתוצאה מכך אורגנואידים תלת-ממדיים המורכבים מנוירונים דופמינרגיים בוגרים.

יצירת אורגנואידים עצביים דופמינרגיים מתאי גזע עובריים אנושיים

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

התכנות עצביים ישיר יוצרת הנוירונים זה לשמור על הגיל לתא ההתחלה סומטיים. כאן, אנו מתארים שיטה המבוססת על וקטורים יחיד לייצר נוירונים המושרה fibroblasts עורי שהושג מתורמים האנושי למבוגרים.

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

מחקר זה מציג ומתאר פרוטוקולים לגזור שני מסוימים נוירונואידים אנושיים האדם כמודל רלוונטי ומדויק עבור לימוד 1) התפתחות האדם הגלינובלסטומה בתוך אורגנואידים האדם באופן בלעדי בבני אדם ו 2) תא העצב הדואמיאנרגיות בידול היוצר אורגאיד תלת מימדי.

ארגונית עצבית אנושית לחקר סרטן המוח ומחלות ניווניות

פרוטוקול זה מספק הליך מקיף כדי ליצור אורגנואיד עצב מוטורי iPS האנושי נגזר באמצעות הרכבה ספונטנית של חבילה חזקה של אקסונים המורחבת מספרואיד בשבב תרבית רקמות.

דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי

האינטראקציות הנוירוניות-גליאליות בניוון עצבי אינן מובנות היטב בשל כלים ושיטות לא מספקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים ממוטבים להשגת תאי עצב מושרים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומספקים דוגמאות לערכים של שיטות אלה בהבנת תרומות ספציפיות לסוג התא במחלת אלצהיימר.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור תרביות משולבות בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית של נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC. מודל קוקולטורה זה, שנוצר בתוך פיגום הידרוג'ל בפורמטים של 96 או 384 בארות, מדגים כדאיות גבוהה לאחר ההדפסה וצמיחת עצבים תוך 7 ימים ומראה את הביטוי של סמני בשלות עבור שני סוגי התאים.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של תרביות נוירון-אסטרוציטים אנושיות שמקורן ב-iPSC עבור יישומי סינון

למדו פרוטוקול להפקת נוירונים מתאי גזע אנושיים באמצעות ביוריאקטור תרחיף תלת ממדי. השיטה מאפשרת תפוקת תאים גבוהה והבדלה עצבית מהירה בסביבה פיזיולוגית ליישומים בקנה מידה גדול.

ייצור נוירוגנין אנושי 2-Inducible Neurons בביוריאקטור תרחיף תלת ממדי

גלה סרטונים נוספים