שימוש בריאגנטים ייחוס כדי לאשר את החוסן של מבחני שחרור ציטוקינים לחיזוי בטיחות נוגדנים חד-שבטיים

בדיקות בטיחות של תרופות חדשות הן קריטיות, ופרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בתקנים מאומתים כדי להעריך את יכולת השחזור, החוסן והמגבלות הפוטנציאליות של פלטפורמת CRS. טכניקה זו אומתה עם ריאגנטים אלה ב-11 מעבדות שונות ובמחקר שיתופי בינלאומי עם דפוסי תגובה דומים שנצפו, ולכן שיפרה את המאמצים בהרמוניזציה ובשחזור. היישומים של טכניקה זו משתרעים לקראת בדיקת סיכון CRS משופרת של נוגדנים טיפוליים חדשים, והיא גם תעזור להיות מוכנים לניהול קליני של תופעות לוואי פוטנציאליות.

עבודה זו נועדה לשפר את יכולת השחזור וההרמוניזציה, והדגמה חזותית משפרת את סיכויי השחזור. התחל בהרכבה מחדש של תכולת אמפולות מגיב הייחוס במיליליטר אחד של מים מזוקקים סטריליים ואפשר 5 עד 10 דקות של התייבשות. לאחר מכן, ערבבו כל תמיסת נוגדנים כראוי לפני העברתה לצינור מכוסה סטרילי.

לאחר מכן, יש לדלל כל נוגדן משוחזר ולבדוק את הנוגדן ל-10 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS סטרילי. קח צלחת מיקרוטיטר סטרילית מפוליפרופילן 96 בארות עם תחתית U והוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים המדוללת הרצויה לבארות המיועדות של הצלחת. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לפני ביצוע בדיקת הפאזה המוצקה.

לאחר איסוף מינימום של 30 מיליליטר של דם מלא היקפי לתוך צינור הפריניזציה, הפוך אותו מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב נכון של דגימת הדם עם נתרן הפרין. יש להניח בצד 15 מיליליטר מדגימת הדם המלאה בשפופרת נפרדת לשימוש מאוחר יותר בבדיקת הדם המלא בשלב הימי. יש לדלל את 15 המיליליטר הנותרים של דם מלא על ידי הוספת נפח שווה של PBS או מדיה RPMI 1640 ללא סרום.

שכבו בעדינות את הדם המדולל על גבי 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות בצינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של הצינור באמצעות רוטור מתנדנד ללא בלם ותאוצה מופחתת ב-500 גרם וטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי להפריד את הדם למרכיביו השונים. לאחר הצנטריפוגה, שיפוע הצפיפות ייפרד כשכבה עליונה של פלזמה, ואחריה שכבה דקה של מעיל באפי המכילה PBMCs ושכבה תחתונה המכילה RBCs וגרנולוציטים פולימורפו-גרעיניים, כולל נויטרופילים ואאוזינופילים.

הסר בזהירות את שכבת הפלזמה העליונה, ואחריה את השכבה הבאה, כדי לקצור את ה- PBMCs. לכביסה, השעו מחדש את מעיל הבאפי שנקטף ב-10 מיליליטר PBS או מדיה RPMI 1640 ללא סרום. צנטריפוגה הצינור מתחיל ב -500 גרם למשך 10 דקות כדי לגלול את התאים.

השליכו את הסופרנטנט וחזרו על הכביסה שוב. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה המתקבלת בשני מיליליטר של מדיית RPMI מלאה. ספרו תאים באמצעות המוציטומטר והתאימו את ריכוז ה-PBMC למיליון תאים למיליליטר ב-RPMI מלא.

לבדיקת שחרור ציטוקינים מדם מלא בשלב מימי, קח את כל דגימת הדם שהונחתה קודם לכן, הוסף 190 מיקרוליטר מהדגימה לבארות של צלחת פוליסטירן תחתונה U של 96 בארות, נוגדנים לטיפול בחום וריאגנטים ייחוס מדוללים מראש ל-100 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS, והוסף 10 מיקרוליטר של הנוגדן המדולל הרצוי לבארות המיועדות המכילות 190 מיקרוליטר של דם מלא. דגרו את הצלחת למשך 48 שעות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לבדיקת שחרור ציטוקינים PBMC בשלב מוצק, השג את הלוחות המצופים שהוכנו בעבר.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, השליכו את תמיסת הנוגדנים מהצלחות המצופות. לאחר מילוי מאגר ריאגנטים ב-PBS, שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS כדי להסיר נוגדנים חד-שבטיים לא קשורים. הוסף 200 מיקרוליטר ממתלה PBMC שהוכן בעבר לכל באר.

דגרו את הצלחת למשך 48 שעות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה של 48 שעות עם בקרה ובדיקת נוגדנים חד שבטיים, צנטריפוגה את הצלחות ב-400 גרם למשך חמש דקות. אסוף את המדיום או הפלזמה המותנים בתא מבלי להפריע לגלולת התא.

הקפיאו את הסופרנטנט או הפלזמה שנאספו במינוס 20 מעלות צלזיוס. תוצאות בדיקת הפאזה המוצקה של PBMC הראו כי נוגדני הבקרה החיוביים גרמו לרמות גבוהות משמעותית של ציטוקינים בהשוואה לבקרות האיזוטיפ התואמות. כמו כן, נצפה כי סופראגוניסט אנטי-CD28 גרם לשינוי גבוה משמעותית של אינטרלוקין-2, או שחרור IL-2, מאשר האיזוטיפ התואם שלו, בעוד שאנטי-CD3 ואנטי-CD52, למרות שעדיין גרמו לביטוי IL-2, הביאו לשינויים ברמות נמוכות יותר.

בבדיקת הפאזה המימית של כל הדם, רמת הציטוקינים הניתנים לזיהוי הייתה נמוכה יחסית מאשר בבדיקת הפאזה המוצקה, אך התאפיינה ברגישות גדולה יותר לגירוי על ידי אנטי-CD52.