וסקולריזציה יעילה של אורגנואידים בכליות באמצעות השתלה אינטרסלומית בעוברי תרנגולות

אורגנואידים בכליות בתרבית במבחנה נשארים לא בשלים, מה שמגביל את תחולתם. ושיטה זו של השתלה intracoelomic גורם כלי דם ומשפר את ההתבגרות של אורגנואידים. ההליך יעיל מאוד, ומאפשר השתלה וניתוח של מספר רב של אורגנואידים בניסוי אחד.

לאחר הכנת אורגנואידים שמקורם ב-HIPSC והדגירה על ביצי הרגל המופרות נוצר חלון בקליפת הביצה ביום השלישי לדגירה. מניחים חתיכה קטנה של סרט שקוף על הקצה המחודד של הביצה. צור חור קטן בקליפת הביצה באמצע הסרט השקוף על ידי הקשה עליו עם הקצה החד של זוג מספריים מנתחים.

לאחר מכן, הכנס מחט 19 מד על מזרק חמישה מיליליטר לתוך החור בזווית של 45 מעלות. שאפו שניים עד שלושה מיליליטר אלבומין מהביצית כדי להוריד את העובר בתוך הביצית. הסתירו את החור עם חתיכה שנייה של סרט שקוף, ואז הניחו חתיכה גדולה של סרט שקוף על העיפרון המסומן כלפי מעלה בצד הפונה כלפי מעלה של הביצה.

עשו חור בקליפת הביצה באמצע הסרט השקוף על ידי הקשה עליו עם הקצה החד של זוג מספריים מנתחים. חותכים חלון עגול קטן בקליפת הביצה מהחור הזה באמצעות מספריים מנתחים מעוקלים. הסתכל דרך חלון זה כדי לאתר את העובר.

לאחר מכן, הגדל את החלון כדי לייעל את הגישה לעובר. הסר חתיכות גדולות של קליפת ביצה שאולי נפלו על גבי העובר באמצעות מלקחיים. הסר חתיכות קטנות יותר על ידי הנחת כמה טיפות של DPBS עם סידן ומגנזיום על העובר עם פיפטה העברת פלסטיק, ולאחר מכן שאיפה DPBS עם קליפת הביצה לתוך פיפטה.

באמצעות פיפטה העברת פלסטיק, להוסיף שלוש טיפות של DPBS, בתוספת סטרפטומיצין 0.5% פניצילין לביצה. אטמו בזהירות את החלון בחתיכה גדולה של סרט שקוף לפני שתחזירו את הביצה לאינקובטור עד היום הרביעי של הדגירה. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל.

מניחים את הביצה תחת מיקרוסקופ נתיחה על מחזיק גומי או קרטון ביצים. עובר התרנגולת נמצא כעת בשלב המבורגר-המילטון 23 עד 24 ושוכב על צדו השמאלי כשצדו הימני פונה לצופה. אתר את ניצן הכנף והרגל הימנית של העובר כאשר הקולום יוערך בין שני ניצני הגפיים הללו.

באזור שבין הכנף הימנית לניצן הרגל, יוצרים פתח רציף בקרום הוויטליין, בכוריון ובמי השפיר על ידי החזקתם בשני זוגות מלקחיים מנתחים ומשיכה עדינה שלהם לכיוונים מנוגדים. בדוק אם יש גישה ללא הפרעה לחלל הקואלומי. אחזו בעדינות בקצה דופן הגוף בין הכנף לניצן הגפיים בעזרת זוג מלקחיים מנתחים ומשכו אותו מעט לכיוון הצופה.

החלל הקואלומי חייב להיות גלוי בבירור. הכניסו בזהירות מכשיר קהה אך דק לחלל הקואלומי. מניחים חצי אורגנואיד בתוך הביצה על גבי האלנטואי באמצעות דיסקטור דורה.

בעזרת מלקחיים מנתחים, אחזו בזהירות בקצה דופן הגוף ומשכו אותו מעט לכיוון הצופה כדי להפוך את הפתח לקולום לגלוי. העבירו בעדינות את האורגנואיד לכיוון ודרך הפתח בדופן הגוף לתוך הקולום בעזרת חוט טונגסטן קהה ומחזיק אזמל מיקרו. דחפו את האורגנואיד מעט בצורה גולגולתית כדי לתקוע אותו בתוך הקולום.

כעת הוא נראה ממש מאחורי ניצן הכנף. מוסיפים שלוש טיפות DPBS לביצה באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק. אטמו בזהירות את החלון עם חתיכת סרט גדול ושקוף לפני שתחזירו את הביצה לאינקובטור עד ליום ה-12 של הדגירה.

גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל. מניחים את הביצה תחת מיקרוסקופ ניתוח במחזיק גומי. להעריך את כלי הדם ולאתר את הוורידים, אשר ניתן להבחין מן העורקים על ידי צבע אדום בהיר מעט שלהם.

כדי לשפר את הגישה לכלי הדם, הגדל בזהירות את החלון על ידי חיתוך אותו עם מספריים ניתוח מעוקל. לאחר בחירת הווריד, הכנס את קצה מחט מיקרו נימי לתוך הווריד בזווית אפס עד 20 מעלות. ודא שהמחט נמצאת בווריד על ידי הזזת הקצה בעדינות מצד לצד.

בעדינות ובהתמדה לנשוף לתוך מערכת ההזרקה כדי להזריק את העדשה culinaris agglutinin. ומניחים את הביצה בחזרה באינקובטור למשך 10 דקות כדי לתת לה לזרום. מניחים את הביצה במחזיק גומי על הספסל.

לאחר מכן, חותכים דרך הקרומים המקיפים את העובר עם מספריים מנתחים מעוקלים. גרפו את העובר מהביצית עם כף מחוררת ומיד ערפו את ראשו של העובר באמצעות מספריים. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מניחים את גוף העובר בצלחת פטרי.

הניחו את העובר על גבו בצלוחית הפטרי ופרשו את איבריו. פתח בזהירות את דופן הבטן של העובר לאורך ציר האורך באמצעות מלקחיים. אתר את האורגנואיד בתוך העובר.

האורגנואיד מתחבר לרוב לאונה הימנית של הכבד, בקצה הכף או באופן גולגולתי, ממש מתחת לכלוב הצלעות. לכן, מומלץ להתחיל בהסתכלות על מיקומים אלה. ברגע שהאורגנואיד מאותר, הוציאו אותו מהעובר על ידי חיתוך סביבו עם מספריים מיקרו.

הניחו את האורגנואיד ברקמת העוף המחוברת אליו באופן בלתי נמנע בצלוחית פטרי מתחת למיקרוסקופ המנתחת. הסר כמה שיותר רקמת עוף עם סכין גילוח מפלדת אל-חלד דו-צדדית. תמונות אימונופלואורסצנטיות של אורגנואיד כליה לא מושתל ואורגנואיד כליה מושתל מכילות שניהם מבנים גלומרולריים וצינוריים.

באורגנואידים שלא הושתלו נמצאים כמה תאי אנדותל אנושיים. באורגנואיד המושתל נראית רשת כלי דם מחוררת בכל האורגנואיד. תמונות מוגדלות של האזורים הארוזים מדגימות את שלושת סוגי תאי האנדותל שניתן להבחין ביניהם באורגנואידים מושתלים: תאי אנדותל אנושיים מחוררים, תאי אנדותל אנושיים לא מחוררים, ותאי אנדותל שמקורם בתרנגולות.

באורגנואידים לא מושתלים, תאי אנדותל מקיפים מבנים גלומרולריים אך אינם פולשים אליהם. עם זאת, באורגנואידים מושתלים, מבנים גלומרולריים הם כלי דם על ידי נימים מחוררים. ניתן לנתח אורגנואידים מושתלים באמצעות טכניקות שונות בהתאם למטרת הניסוי.

השוואה ישירה לבקרות שלא הושתלו יכולה לספק תובנה לגבי תהליך הווסקולריזציה וההבשלה.