Name: טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למדו להעריך פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה באמצעות מעקב וידאו ותוכנת Fiji בקוד פתוח. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של מהירות ומרחק תנועה במבוגרים ובזחלים, ומסייעת בחקר שינויים התנהגותיים במודלים של מחלות אנושיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן שיגור מיוחדת מאוניברסיטת סוצ'ו והקרן הלאומית למדע של סין (NSFC) (82171414). אנו מודים לחברי המעבדה של פרופ' צ'ון-פנג ליו על הדיון וההערות.

W1118 זבובים בוגרים וזחלי כוכב שלישי שימשו במחקר הנוכחי.
1. הכנה ניסיונית
הערה: זירת שדה פתוח למעקב אחר תנועה של דרוזופילה עשויה מג'ל סיליקה חסר צבע וריח.
<ol><li>מערבבים מגיב A וריאגנט B ביחס של 1:10, בהתאם להוראות היצרן לערכת הסיליקה (ראה טבלת חומרים). ודא כי סודיום ביקרבונט הוסיף לתערובת על ידי ערבוב עד צבע משתנה לבן. מעבירים את התערובת לתבנית פטרי נקייה ומכניסים לתנור ב-40°C לייבוש למשך 48 שעות.</li>
	<li>מקם את מצלמת ה- HD (ראה טבלת חומרים) על חצובה, וכוונן אותה כך שעדשת המצלמה תהיה ניצבת לפני השטח של זירת הסיליקה. התאמת אורך המוקד ופתחי המצלמה, ודא שהמצלמה ממוקדת בפני השטח של הסיליקה ושהתצוגה מוארת כראוי. מערך הניסוי מומחש באיור 1.</li>
	<li>העבר זבוב לזירת השדה הפתוח כדי להקליט וידאו רציף של לפחות 61 שניות. הערה: בהתחשב באופי האיטי של הזחלים, מומלץ זמן הקלטת וידאו של יותר מ -10 דקות.<ol><li>פתח את הסרטון עם פיג'י, גרור את מד ההתקדמות למסגרת הראשונית ואשר בשתיקה. בחרו את כל גוף הזבוב באמצעות הכלי "בחירה חופשית" (איור 2B,C).</li>
		<li>לחצו על התמונה > להתאים את הבהירות והניגודיות > כדי להתאים את איזון הלבן עד שערך האפור של האזור שנבחר יתקרב לרקע הרחב (איור 2D-F). הערה: הומוגניזציה של הרקע של הפריים הראשון מאפשרת לתוכנה להבחין ברקע ללא אובייקטים כלשהם וליצור ניגודיות כאשר זבוב נוכח, ובכך לאפשר לתוכנה לעקוב אחריו.</li>
	</ol></li>
	<li>בצעו את הניסוי כולו בסביבת בדיקה של 25°C ו-60% לחות יחסית, באזור שקט וללא חשיפה לאור בהיר.</li>
</ol>2. הקלטת וידאו ועיבוד מקדים
<ol><li>לאחר תקופה קצרה של הרדמה תוך שימוש ב-95% פחמן דו-חמצני (CO2), העבירו זבוב לזירה הפתוחה ולחצו על כפתור ההקלטה ביישום המצלמה כדי להתחיל להקליט וידאו. הערה: כדי למזער את השפעת חומר ההרדמה על תנועה, אפשר לזבובים להתאושש במשך 10 דקות לפני תחילת הקלטת וידאו. מומלץ גם להרדים באמצעות קירור.<ol><li>לאחר שהזבובים מתאוששים מההרדמה, הניחו את צלחת הזירה המכילה את הזבוב מתחת למצלמה ונערו את הצלחת במהירות מצד לצד כדי לוודא שהזבוב נמצא בתנועה כאשר ההקלטה מתחילה.</li>
	</ol></li>
	<li>עם סיום ההקלטה, לחץ על כפתור העצירה כדי לסיים את הקלטת הווידאו. הערה: ודא שזמן הקלטת הווידאו חורג במעט מזמן מעקב היעד בהפרש קטן. בנוסף, כדי לשפר את יעילות הניסוי, ניתן לעקוב אחר זבובים מרובים באופן ספונטני. הדבר תלוי ברזולוציה של המצלמה כדי לאפשר חיתוך וידאו באיכות גבוהה.</li>
	<li>המר את הסרטונים שהוקלטו לפורמט AVI עם קידוד MJPEG, כך שניתן יהיה לפתוח ולנתח אותם באמצעות פיג'י. בינתיים, הגדר את קצב הפריימים לשנייה (fps) של הווידאו ל- 15 fps עבור זבובים בוגרים ו- 12 fps עבור זחלים.</li>
</ol>3. ניתוח וידאו
<ol><li>פתחו את הסרטון שעבר טרנספורמציה עם "השתמש בערימה וירטואלית" ו"המר לגווני אפור", שתי אפשרויות בחלון הקופץ בעת פתיחת הווידאו עם פיג'י (איור 2A).</li>
	<li>צור מסגרת ראשונה ריקה, כאמור לעיל.</li>
	<li>השיגו חלון עיבוד באמצעות הכלי "הגדר תמונה פעילה" של תוסף AnimalTracker וצרו אזור מעקב שמקיף את הזירה בחלון הווידאו המקורי באמצעות הכלי "סגלגל" (איור 3A).</li>
	<li>הגדר את המסננים (איור 3A,3) ואת הפרמטרים של שני המסננים (איור 4A-G) עבור המסגרת הריקה הראשונה בחלון העיבוד. לאחר מכן, בחרו את הפריים הבא בחלון הווידאו המקורי, ובחרו את המשטח המסונן של חלון העיבוד (איור 5A-C). הערה: שלב הסינון משמש להפחתת רעשי התמונה ו/או להסרת הרקע, ובכך מפשט את הפרדת החזית מהרקע בבינאריות של המסגרות.</li>
	<li>לאחר שנבחר חלון עיבוד מסונן, סובב את הזבוב המסומן עם פרופיל אדום מכוסה בחלון העיבוד באמצעות הכלי "הגדר סף" (איור 3A,4, איור 5D-E ואיור 6A).</li>
	<li>השתמשו ב"גלאי הכתמים המוגדר" כדי לאפשר למחשב לזהות את הזבוב באמצעות פרופיל אדום המכוסה בחלון העיבוד (איור 3A,5 ואיור 6B).</li>
	<li>הגדר את פריים 901 כמסגרת האחרונה עבור הזבוב הבוגר, המחושב לפי משך ההקלטה של הווידאו ו-fps (איור 3A,6, איור 6C). הערה: הניסוי הבא עם זחלים היה במעקב במשך 10 דקות, כך שמסגרת 7200 מוגדרת כפריים האחרונים.</li>
	<li>השתמשו בכלי "הצג כתמים" כדי להציג מלבן מעקב בחלון הווידאו המקורי (איור 3A,7 ואיור 6D,E). לאחר מכן, התחל את המעקב וייצא את קובץ המעקב לאחר השלמת הניטור (איור 3A,8,9 ואיור 7A,B).</li>
</ol>4. מעקב אחר ניתוח קבצים
<ol><li>טען את קובצי המעקב והאזור באמצעות התוסף Animal tracker > Tracking analyzer (איור 8A).</li>
	<li>בחר באינדקס הרצוי באמצעות הגדרות אזור ושנה את הגדרות הפרמטרים (איור 8). חשב את זמן מרווח המסגרות באמצעות קצב המסגרות. הערה: במצב זה, קצב המסגרות הוא 15 fps, ומרווח המסגרת הוא בערך 0.067 שניות, שהיא הגדרת ברירת המחדל (איור 8D).</li>
	<li>הפק את תרשימי הניתוח הכמותי באמצעות תוכנת הגיליונות האלקטרוניים ו- GraphPad Prism לאחר ניתוח במנתח מעקב (איור 9).</li>
</ol>5. ניתוח לכל מסגרת
<ol><li>בצע ניתוח מהירות לכל מרווח פריימים. נתח את קובץ המסלול ללא פיג'י אם יש צורך במחקר מפורט יותר.<ol><li>פתח את קובץ המעקב, העתק את כל הקואורדינטות ל- Microsoft Office Excel ופצל את התאים באמצעות מקש הרווח. הערה: לדוגמה, לאחר שהקובץ חולק לעמודות "C" ו- "D", מהירות הדרוזופילה לכל מרווח מסגרת מחושבת לפי הנוסחה SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2), המוצגת בעמודה "E" (איור 10A). הנתונים בעמודה "E" מציינים את מספר הפיקסלים שהזבוב העביר בין שתי מסגרות, כאשר המסגרת הראשונה אינה נחשבת. בחר את כל התוצאות המחושבות והוסף תרשים קו כדי להציג מהירות אינטואיטיבית של תנועת זבוב לכל מרווח פריימים, עם שיא בתרשים הקו (איור 10B).</li>
	</ol></li>
	<li>חשב את זמן חוסר התנועה לכל מרווח פריימים. לאחר פיצול הקובץ לעמודות "C" ו- "D", חשב את מצב חוסר התנועה של דרוזופילה לכל מרווח מסגרת באמצעות הנוסחה IF(SQRT((C6-C5)^ 2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), המוצגת בעמודה "E". (איור 10C). הערה: בניגוד לניתוח מהירות, הוגדרו תוצאות הפריים הראשון. זבובים שנעו פחות מ-20 פיקסלים נחשבו חסרי תנועה ונרשמו כ-"0" בעמודה "E".<ol><li>בחר את כל התוצאות המחושבות והוסף תרשים טורים כדי להציג באופן חזותי את זמן חוסר התנועה בשולי תרשים הטורים כולו (איור 10D).</li>
	</ol></li>
	<li>ודא שזווית הכיוון משתנה. הערה: ניתוח זווית שינוי הכיוון מייצג את בחירת הכיוון של הזבובים. לאחר פיצול הקובץ לעמודות "C" ו- "D", זווית שינוי הכיוון מחושבת לפי הנוסחה ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), המוצגת בעמודה "E" (איור 10E). התוצאות המחושבות מציינות את הזווית בין שלוש קואורדינטות.<ol><li>בחר את כל התוצאות המחושבות והוסף דיאגרמת פיזור כדי להמחיש את זווית שינוי הכיוון של תנועת הזבובים (איור 10F).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ham, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+UCHL1+rescues+the+defects+related+to+Parkinson%27s+disease+by+suppressing+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis.</a> Science Advances. 7 (28), (2021).</li>
<li>Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+and+preimaginal+exposure+to+methylmercury+disrupts+locomotor+activity+and+circadian+rhythm+of+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster.</a> Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).</li>
<li>Jones, M. A., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+age-related+impairment+in+locomotor+and+other+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors.</a> Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).</li>
<li>Yamaguchi, M., Yoshida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model organism.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).</li>
<li>Rothenfluh, A., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs%2C+files%2C+and+videotape%3A+the+effects+of+ethanol+and+cocaine+on+Drosophila+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).</li>
<li>Tsuda, L., Lim, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+model+system+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease model system using Drosophila.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).</li>
<li>Dung, V. M., Thao, D. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).</li>
<li>Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly+for+ALS%3A+Drosophila+modeling+on+the+route+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).</li>
<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+rapid+iterative+negative+geotaxis+assay+for+analyzing+adult+climbing+behavior+in+a+Drosophila+model+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), 56507(2017).</li>
<li>Eidhof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+locomotor+behavior+in+the+Drosophila+island+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 55892(2017).</li>
<li>Scaplen, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+quantification+of+group+locomotor+activity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4427(2019).</li>
<li>Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARGO+%28Massively+Automated+Real-time+GUI+for+Object-tracking%29%2C+a+platform+for+high-throughput+ethology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology.</a> PLoS One. 14 (11), e0224243(2019).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).</li>
<li>Cichewicz, K., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShinyR-DAM%3A+a+program+analyzing+Drosophila+activity%2C+sleep+and+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms.</a> Communications Biology. 1, 25(2018).</li>
<li>McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+larval+activity+in+the+Drosophila+activity+monitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52684(2015).</li>
<li>Walter, T., Couzin, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRex%2C+a+fast+multi-animal+tracking+system+with+markerless+identification%2C+and+2D+estimation+of+posture+and+visual+fields%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields.</a> eLife. 10, (2021).</li>
<li>Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%82%AC100+lab%3A+A+3D-printable+open-source+platform+for+fluorescence+microscopy%2C+optogenetics%2C+and+accurate+temperature+control+during+behaviour+of+zebrafish%2C+Drosophila%2C+and+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 15 (7), e2002702(2017).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+the+behavior+of+Drosophila+melanogaster+for+toxicity+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study.</a> Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%3A+their+ability+to+reproduce+the+features+of+clinical+disease+and+model+gene-environment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions.</a> Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).</li>
<li>Coulom, H., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+rotenone+models+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).</li>
<li>Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone+mediated+developmental+toxicity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892(2022).</li>
<li>Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnimalTracker%3A+an+ImageJ-based+tracking+API+to+create+a+customized+behaviour+analyser+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program.</a> Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).</li>
<li>Qu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EasyFlyTracker%3A+a+simple+video+tracking+Python+package+for+analyzing+adult+Drosophila+locomotor+and+sleep+activity+to+facilitate+revealing+the+effect+of+psychiatric+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665(2022).</li>
<li>Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+of+Drosophila+movement+behaviour+assays+using+computer+vision+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Innovative+Approaches+in+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python.</a> International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תכננו שיטה, המבוססת על חומר הקוד הפתוח AnimalTracker API התואם לתוכנית עיבוד התמונה של פיג'י, שיכולה לאפשר לחוקרים להעריך באופן שיטתי את הפעילות המוטורית על ידי מעקב אחר זבובי זחלים בוגרים ובודדים. AnimalTracke הוא כלי שנכתב ב- Java שניתן לשלב בקלות במסדי נתונים קיימים או כלים אחרים כדי להקל על ניתוח התנהגות מעקב אחר בעלי חיים שתוכננה על ידי יישום24. בניתוח פריים אחר פריים על ידי נוסחת חישוב תוכנה המכמתת את הפעילות המוטורית של הבוגרים והזחלים, ניתן לנתח באופן גמיש מספר פרמטרים, כ...

Drosophila melanogaster מספק אורגניזם מודל מצוין לחקר תפקודים תאיים ומולקולריים במודלים של מחלות עצביות שנוצרו על ידי שינוי גנים1, טיפול תרופתי2 והזדקנות3. השימור הגבוה של מסלולים ביולוגיים, תכונות פיזיקליות וגנים הומולוגיים הקשורים למחלות בין בני אדם לדרוזופילה הופך את זבוב הפירות לחיקוי אידיאלי מהרמה המולקולרית לרמה ההתנהגותית4. במודלים רבים של מחלות, ליקוי התנהגותי הוא מדד חשוב, המספק מודל מועיל לנוירופתיות אנושיות שונות 5,6. דרוזופילה משמשת כיום לחקר מחלות אנושיות מרובות, התפתחות עצבית ומחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון וטרשת אמיוטרופית צידית 7,8. גילוי היכולת המוטורית של מודלי המחלה חיוני להבנת ההתקדמות הפתוגנית ועשוי לספק מתאם פנוטיפי למנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך המחלה.
לאחרונה, כלי תוכנה זמינים מסחרית ותוכניות חסכוניות פותחו עבור אסטרטגיות זיהוי לוקומוטור Drosophila, כגון בדיקות תפוקה גבוהה בזבובים מקובצים9,10 ומדידת תנועה בזמן אמת11,12. גישה קונבנציונלית אחת כזו היא גיאוטקסיס שלילי אינטראקטיבי מהיר (RING), המכונה גם מבחן הטיפוס, הכולל ערוצים מרובים המאפשרים להכיל אוכלוסיית זבובים גדולה עם אותו מין וגיל, מה שמקטין את השונות תוך איסוף נתונים 9,13. שיטת בדיקה מקדימה נוספת לניתוח התנהגות לוקומוטורית היא TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), מכשיר המשתמש במספר אלומות כדי לזהות תנועת פעילות זבובים בתוך צינור זכוכית דק14. המכשיר מתעד מיקום רציף, המייצג תנועה אוטומטית על ידי חישוב מעברי הקרן כדי ללמוד את הפעילות והשעון הביולוגי של הזבובים לאורך פרק זמן ארוך יותר15. למרות ששיטות אלה שימשו באופן נרחב בניתוח פגמים התנהגותיים בזבובי פירות כדי לקבוע שינויים בתנועה התנהגותית, הן תמיד דורשות ציוד בדיקה מיוחד או תהליכי ניתוח מורכבים, ומגבילות את יישומן בדגמים מסוימים עם מכשיר מוגבל ופשוט. אסטרטגיות קבוצתיות למעקב אחר בעלי חיים לבדיקת הדרוזופילה הבוגרת, כגון FlyGrAM11 ובדיקת האי דרוזופילה 10, מיישמות גיוס חברתי ומעקב אישי באזור מוגדר מראש. אף על פי כן, להגבלה חברתית של הפרט באזורים מנוגדים עלולה להיות השפעה שלילית על הזיהוי בתמונות, הנגרמת כתוצאה מהתנגשות או חפיפה של זבובים. למרות שכמה שיטות מבוססות חומרים בקוד פתוח, כגון TRex16, MARGO 12 ו- FlyPi17, יש מצב חירום, הן יכולות לעקוב אחר הזבובים במהירות עם שימוש גמיש בבדיקות התנהגותיות. גישות בדיקה אלה קשורות להתקנות משוכללות של מכשירים ניסיוניים, דרישות תוכנה מיוחדות או שפות מחשב מקצועיות. עבור הזחלים, מדידת המרחק הכולל שעבר על פני מספר קווי הגבול של הרשת ליחידת זמן18, או ספירה גסה של התכווצויות דופן הגוף עבור פרטיםבאופן ידני 19, הן השיטות הדומיננטיות להערכת היכולת המוטורית שלהם. בשל חוסר דיוק בציוד או במכשירים ובשיטות ניתוח, תנועה התנהגותית מסוימת של הזחלים עלולה לחמוק מגילוי, מה שמקשה על הערכה מדויקת של תנועה התנהגותית, במיוחד תנועה עדינה15.
השיטה הנוכחית שפותחה משתמשת בממשק תכנות היישומים AnimalTracker (API), התואם לתוכנית עיבוד התמונה פיג'י (ImageJ), כדי להעריך באופן שיטתי את הפעילות המוטורית של זבובים בוגרים וזחלים כאחד על ידי ניתוח התנהגות המעקב שלהם מסרטוני וידאו בחדות גבוהה (HD). פיג'י היא תוכנת קוד פתוח להפצת ImageJ שיכולה לשלב ספריות תוכנה חזקות עם שפות סקריפטים רבות, וכתוצאה מכך אב טיפוס מהיר של אלגוריתמים לעיבוד תמונה, מה שהופך אותה לפופולרית בקרב ביולוגים בזכות יכולות ניתוח התמונה שלה20. בגישה הנוכחית, השילוב של פיג'י ב-API של AnimalTracker מנוצל לפיתוח בדיקה התנהגותית ייחודית של דרוזופילה עם החדרת אלגוריתם מותאמת אישית, ומספק צעד שימושי לתיעוד מפורט והדרכות לתמיכה ביכולות אנליטיות חזקות של התנהגות לוקומוטורית (איור 1). כדי לעקוף את הסיבוך של זיהויים אובייקטיביים בתמונות הנגרמות כתוצאה מהתנגשות או חפיפה של זבובים, כל זירה מוגבלת לאירוח זבוב אחד בלבד. לאחר הערכת דיוק המעקב של הגישה, היא יושמה כדי לעקוב ולכמת את תנועות הלוקומוטור של דרוזופילה שניתנו עם התרופה הרעילה רוטנון, המשמשת בדרך כלל למודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון, ובסופו של דבר גילתה פגיעה בתנועה בטיפול התרופתי21. מתודולוגיה זו, המשתמשת בקוד פתוח ובתוכנה חופשית, אינה מחייבת מכשור בעלות גבוהה, ויכולה לנתח באופן מדויק ומשכפל תנועה התנהגותית של דרוזופילה .

<table><tbody><tr><td>גשש אחר בעלי חיים</td> גרסת <td>התוכנית לחקר המוח ההונגרי</td><td>: 1.7</td><td>אתר אינטרנט: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads</td></tr><tr><td>תוכנת מצלמה</td><td>גרסת מיקרוסופט</td><td>: 2021.105.10.0</td><td>מערכת Windows 10 מובנית</td></tr><tr><td>מחשב</td><td>DELL</td><td>Vostro-14-5480</td><td>מערכת הפעלה win-10 זמינה</td></tr><tr><td>תחנת עבודה להרדמה פחמן דו חמצני דרוזופילה</td><td>Wu han Yihong technology</td><td>#YHDFPCO2-018</td><td>Official Website: http://www.yhkjwh.com/</td></tr> <tr><td>Fiji</td><td>software Fiji team</td><td>version: 1.53v</td><td>Official webאתר: https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>Format factory software</td><td>Pcfreetime</td><td>גרסה: X64 5.4.5</td><td>Official webאתר: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html</td></tr><tr><td>Graph pad prism</td><td>GraphPad</td><td>גרסת תוכנה: 8.0.2</td><td>האתר הרשמי: https://www.graphpad-prism.cn</td></tr><tr><td>מצלמת בחדות גבוהה</td><td>TTQ</td><td>Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60 מ"מ)</td> <td>אתר רשמי: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35</td></tr><tr><td>תוכנת Office</td> גרסת <td>מיקרוסופט</td><td>: Office 2019</td><td>האתר הרשמי: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office צלחת</td></tr><tr><td>פטרי</td><td></td><td>110301003</td><td>גודל : 60 מ"מ</td></tr><tr><td>סיליקה ג'ל</td><td>DOW</td><td>SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>מערבבים היטב לפי ההוראות</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Macklin</td><td>#144-55-8</td><td>מערבבים היטב עם סיליקה ג'ל</td></tr></tbody></table>

טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל אידיאלי לחקר מחלות שונות בשל שפע של טכניקות מניפולציה גנטית מתקדמות ותכונות התנהגותיות מגוונות. זיהוי ליקוי התנהגותי במודלים של בעלי חיים הוא מדד מכריע לחומרת המחלה, למשל, במחלות נוירודגנרטיביות שבהן חולים חווים לעתים קרובות ליקויים בתפקוד המוטורי. עם זאת, עם זמינותן של מערכות שונות למעקב והערכה של ליקויים מוטוריים במודלים של זבובים, כגון אנשים שטופלו בתרופות או אנשים טרנסגניים, עדיין חסרה מערכת חסכונית וידידותית למשתמש להערכה מדויקת מזוויות מרובות. שיטה המבוססת על ממשק תכנות היישומים AnimalTracker (API) פותחה כאן, התואמת לתוכנית עיבוד התמונה של פיג'י, כדי להעריך באופן שיטתי את פעילויות התנועה של פרטים בוגרים וזחלים מווידאו מוקלט, ובכך לאפשר ניתוח של התנהגות המעקב שלהם. שיטה זו דורשת רק מצלמה בחדות גבוהה ושילוב חומרה היקפית למחשב כדי להקליט ולנתח התנהגות, מה שהופך אותה לגישה זולה ויעילה לסינון מודלים של זבובים עם ליקויים התנהגותיים טרנסגניים או סביבתיים. דוגמאות לבדיקות התנהגותיות באמצעות זבובים שטופלו בפרמקולוגית ניתנות כדי להראות כיצד הטכניקות יכולות לזהות שינויים התנהגותיים הן בזבובים בוגרים והן בזחלים באופן שניתן לחזור עליו.

במחקר הנוכחי נבדקו ליקויים מוטוריים בזבובים בוגרים ובזחלי כוכב שלישי שטופלו ברוטנון והושוו בפעילותם המוטורית לזו של זבוב ביקורת הניזון מהתרופה הממסה דימתיל סולפוקסיד (DMSO). טיפול ברוטנון בדרוזופילה הוכח כגורם לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח22 ומוביל לליקויים מוטוריים משמעותיים23. כפי שניתן לראות באיור 11 ובאיור 12, לזבובים בוגרים ולזחלי אינסטאר שלישי שטופלו ברוטנון יש ליקויים מוטוריים משמעותיים בהשוואה לזבובי ביקורת שניזונו מ-DMSO.<s...

הפרוטוקול הנוכחי מעריך את הפעילות המוטורית של דרוזופילה על ידי מעקב וניתוח תנועת הזבובים בזירה בעבודת יד באמצעות תוכנת קוד פתוח פיג'י, התואמת לתוספים לפלח פיקסלים של כל פריים בהתבסס על הקלטת וידאו בחדות גבוהה כדי לחשב פרמטרים של מהירות, מרחק וכו '.

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

השיטה מבוססת על תוכנת קוד פתוח להערכה שיטתית של הפעילות המוטורית המקומית למעקב אחר התנהגות הזחלים הבוגרים והזחלים מווידאו מוקלט. שיטה זו דורשת שילוב מכשירים בעלות נמוכה כדי להקליט ולנתח התנהגות, מה שהופך אותה לגישה זולה ויעילה לסינון תנועת זבובים. טכנולוגיה זו משמשת לזיהוי שינוי התנהגותי במודל זבוב של מחלה אנושית עם פגיעה מקומית בתנועה, אך היא אינה מתאימה לטיפול במחלות, נכויות או קשיים.חיוני לנקות את חלון הווידאו הרלוונטי במהלך תהליך הניתוח, כלומר החלון המקורי וחלון הווידאו לעיבוד. כדי להתחיל, מערבבים מגיב A ומגיב B של ערכת הסיליקה ביחס של אחד עד 10, על פי הוראות היצרן, כדי להכין את זירת השדה הפתוח למעקב אחר תנועה דרוזופילה. לאחר מכן, הגדר את מצלמת ה- HD על חצובה, וכוונן אותה כך שעדשת המצלמה תהיה ניצבת לפני השטח של זירת הסיליקה.לאחר מכן פתח את הסרטון עם פיג'י. גרור את מד ההתקדמות למסגרת הראשונית ואשר בשתיקה. בחר את כל גוף הזבוב באמצעות כלי הבחירה ביד חופשית.לחצו על תמונה, התאמה, בהירות וניגודיות כדי להתאים את איזון הלבן עד שערך האפור של האזור שנבחר יתקרב לרקע הרחב. העבירו את הזבוב המורדם לזירת השדה הפתוח. לאחר שהזבוב מתאושש מההרדמה, הניחו את צלחת הזירה עם הזבוב מתחת למצלמה ונערו אותה במהירות מצד לצד כדי לוודא שהזבוב נמצא בתנועה כאשר ההקלטה מתחילה.לחץ על לחצן ההקלטה ביישום המצלמה כדי להתחיל בהקלטת וידאו. עם סיום ההקלטה, לחץ על כפתור העצירה כדי לסיים את הקלטת הווידאו. המר את הסרטונים שהוקלטו לפורמט AVI עם קידוד פגאני M-J כך שניתן יהיה לפתוח ולנתח אותם באמצעות פיג'י.כמו כן, הגדר את המסגרות לשנייה של הווידאו ל -15 fps עבור זבובים בוגרים ו- 12 fps עבור זחלים. כדי לפתוח את הסרטון עם פיג'י, בחר את שתי האפשרויות, השתמש בערימה וירטואלית והמיר לקנה מידה אפור, בחלון הקופץ. השג חלון עיבוד באמצעות כלי התמונה הפעילה המוגדר של תוסף מעקב בעלי החיים, וצור אזור מעקב המקיף את הזירה בחלון הווידאו המקורי, באמצעות הכלי הסגלגל.הגדר את המסננים ואת הפרמטרים של שני המסננים עבור המסגרת הריקה הראשונה בחלון העיבוד. לאחר מכן בחרו במסגרת הבאה בחלון הווידאו המקורי ובחרו במשטח המסונן של חלון העיבוד. לאחר בחירת חלון עיבוד מסונן, השתמשו בכלי קביעת סף כדי לסובב את הטרקטור עם פרופיל אדום, המכוסה בחלון העיבוד.לאחר מכן השתמש בגלאי הכתמים כדי לאפשר למחשב לזהות את הזבוב באמצעות פרופיל אדום, המכוסה בחלון העיבוד. הגדר את המסגרת האחרונה עבור הזבוב או הזחלים הבוגרים, כמתואר בכתב היד של הטקסט. השתמשו בכלי הצגת כתמים להצגת מלבן מעקב בחלון הווידאו המקורי.התחל את המעקב וייצא את קובץ המעקב לאחר השלמת הניטור. טען את קבצי המעקב והאזור באמצעות תוסף מעקב החיות ומנתח המעקב. בחר באינדקס הרצוי באמצעות הגדרות אזור, ושנה את הגדרות הפרמטרים.חשב את זמן מרווח המסגרות באמצעות קצב המסגרות. הפק את תרשימי הניתוח הכמותי באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני ומנסרת לוח גרפים, לאחר שנותחו במנתח המעקב. פתח את קובץ הרצועה.העתק את כל הקואורדינטות ל- Microsoft Office Excel ופצל את התאים באמצעות מקש הרווח. כדי לחשב את זמן חוסר התנועה לכל מרווח פריימים, בחר את כל התוצאות המחושבות והוסף תרשים טורים כדי להציג באופן חזותי את זמן חוסר התנועה בשולי תרשים הטורים כולו. כדי להמחיש את השינויים בזווית הכיוון, בחר את כל התוצאות המחושבות והוסף דיאגרמת פיזור.לזבובים בוגרים וזחלי אינסטאר שלישי, שטופלו ברוטנון, היו ליקויים מוטוריים משמעותיים בהשוואה לזבובי ביקורת, שניזונו מ-DMSO ממס. ניתוח כמותי של הטיפול ברוטנון בזבובים בוגרים הראה ירידה משמעותית במרחק הנסיעה ובמהירות הממוצעת. ועלייה משמעותית בזמן חוסר התנועה.גרפים מייצגים הראו פחות שיאים של מהירות התנועה למרווח פריימים בזבובים שניזונו מרוטנון בהשוואה לאלה בקבוצת הביקורת, מה שמצביע על חומרת הגירעון בפעילות המוטורית. עמודת חוסר התנועה המוסדית של פיקסלים נעים לכל פריים הראתה גם פחות תנועה משמעותית בתוך דקה אחת עבור זבובי רוטנון, בהשוואה לזבובי הביקורת. גרפים מייצגים הממחישים את זווית התנועה של שינויי הכיוון במזון רוטנון, ובחיות ביקורת, חשפו גם שינויים בכיוון שנבחר על ידי זבובים.תוצאות דומות נצפו עבור זחלי האינסטאר השלישי. התוצאות הראו כי התנועה ההתנהגותית של זחלי מעקב שניזונו מרוטנון נפגעה משמעותית בהשוואה לקבוצת הביקורת. השלב המכריע ביותר בתהליך הניתוח הוא יצירת המסגרת הריקה הראשונה, מכיוון שהיא מעידה אם התוכנה יכולה לבדוק ביעילות.טכנולוגיה זו יכולה לאפשר לחוקרים להעמיק במנגנון הבסיסי של פגמים מרובים, כגון פגיעה עצבית או שרירית.

a-simple-technique-to-assay-locomotor-activity-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

המחקר של התנהגות של תנועה...

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

אנו מתארים נוהלי רישום פעילות של תנועה יומי של...

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית</em

תסיסנית melanogaster היא מערכת גנטית התנהגותית מודל צייתן, שבו נעשה שימוש כדי להבין את הבסיס המולקולרי התאי של תהליכים ביולוגיים רבים חשובים יותר ממאה שנים 1. תסיסנית נוצלה היטב כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס הגנטי של ההתנהגות במהירות הבזק.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

סרטון זה מתאר שיטה פשוטה לכימות תנועת הזבובים ומציג את בדיקת הטיפוס שבוצעה. מבחן טיפוס הזבובים הוא מבחן כללי של תפקוד מוטורי המסתמך על תגובת גיאוטקסיס שלילית.

בדיקת טיפוס זבובים: שיטה לבדיקת תנועה כללית בדרוזופילה מלנוגסטר

סרטון זה מתאר כיצד לעקוב אחר זבובים ההולכים בחופשיות כדי להעריך את יכולת התנועה הכללית שלהם. הפרוטוקול המוצג מדגים את הגדרת הבדיקה וניתוח הנתונים באמצעות תוכנת מעקב וידאו.

מעקב אחר זבובים מהלכים בחופשיות: שיטה להערכת תנועה בדרוזופילה

סרטון וידאו זה מתאר את מערכת ניטור פעילות דרוזופילה (DAM) המשמשת למעקב אחר פעילות לוקומוטורית. חוקרים משתמשים בנתוני פעילות שנאספו מה-DAM כדי לחקור את השעון הביולוגי בזבובי פירות. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לטעון זבובים במכשיר ולתעד נתוני פעילות עבור ניסויים צירקדיים.

דרוזופילה מוניטור פעילות (DAM): שיטה למדידת פעילות מוטורית בזבובים

כאן אנו מתארים שיטה למדידה מהירה ומדויקת של ביצועי טיסה בדרוזופילה, המאפשרים תפוקה גבוהה הקרנה.

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים<em&gt; דרוזופילה</em

תסיסנית שימושית בלומדת מניפולציות גנטיות או סביבתיות המשפיעות על התנהגויות כמו פעילות של תנועה ספונטנית. כאן אנו מתארים פרוטוקול אשר מנצל צגים עם קרניים אינפרא אדומות ותוכנות לניתוח נתונים לכמת פעילות של תנועה ספונטנית.

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

שימוש במצלמת אינטרנט ושילוב של תוכנות חופשיות וזולות, ניתן לנתח דפוסי קטר בדרוזופילה melanogaster כדי לזהות הבדלים במהירות, מרחק, והזמן של פעילויות מוטוריות שונות.

שיטה בעלות נמוכה לניתוח כמו פעילות תפיסה ותנועה ב<em&gt; דרוזופילה</em

דוח זה מתאר שיטה למדידת פעילות הזחלים של דרוזופילה באמצעות מוניטור פעילות הדרוזופילה TriKinetics. המכשיר משתמש בקרני אינפרא אדום כדי לזהות תנועות של עד 16 בעלי חיים בודדים. ניתן לנתח נתונים כדי לייצג פרמטרי תנועה כולל קצבים ומיקומי בעלי החיים בתוך תאי הבדיקה.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

למדו להעריך פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה באמצעות מעקב וידאו ותוכנת Fiji בקוד פתוח. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של מהירות ומרחק תנועה במבוגרים ובזחלים, ומסייעת בחקר שינויים התנהגותיים במודלים של מחלות אנושיות.

טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה

גלה סרטונים נוספים