Name: הליך תואם GMP לייצור תאי T מהונדסים גנטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: למדו הליך תואם GMP לייצור תאי T מהונדסים גנטית מתאי PBMC אנושיים. שיטה זו חסכונית ומאפשרת פיתוח תרפיות CAR T-cell לטיפול במחלות דם ממאירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה מומן במשותף על ידי האיחוד האירופי וקרנות לאומיות יווניות באמצעות התוכנית האופרטיבית תחרותיות, יזמות וחדשנות, תחת הקריאה RESEARCH - CREATE - INNOVATE (קוד פרויקט: T2EDK - 00474). ברצוננו גם להביע את תודתנו לקרן Choose Life על מתן תמיכה מתמשכת למעבדת GMP "דימיטריס לויס" של המכון לתרפיה תאית.

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת פטרס ומועצת הביקורת המוסדית של בית החולים הכללי האוניברסיטאי של פטרס. לפני קבלת דגימות ביולוגיות, התקבלה הסכמה מדעת מאנשים בריאים. הערכת הזכאות של המשתתפים נערכה על פי נהלים מוסדיים ובהתאם לתקני JACIE ללוקפרזיס. אם יש ליישם פרוטוקול זה במסגרת ACT קליני, כל ההליכים חייבים לעמוד בהנחיות תנאי ייצור נאותים (GMP) ולהתבצע בחדרים נקיים תואמי GMP. אמצעי בטיחות מיוחדים נחוצים בעת עבודה עם וקטורים נגיפיים, ונהלים אלה צריכים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית ייעודי. במחקר זה, ההליכים המתוארים נערכו במסגרת היפוקסיסטיישן H35 HEPA מאומת (ראה טבלת חומרים) כדי להבטיח סביבה מבוקרת ומנוטרת. טיהור כל הנוזלים המסוכנים צריך להתבצע באמצעות תמיסת אקונומיקה 10%.
1. בידוד PBMC והפעלת תאי T (יום 0)
<ol><li>אספו תאים משקית האפרזיס של התורם (leukopaks, ראו טבלת חומרים) לתוך צינורות של 50 מ"ל, בהתאם לנפח הראשוני.</li>
	<li>בצע שתי שטיפות של שקית התא על ידי עירוי 15 מ"ל של מדיה hematopoietic מלאה (+5% HSA, מדיה hematopoietic מסחרי ללא סרום, ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>בצע צנטריפוגת שיפוע צפיפות מבוססת פוליסכריד בדילול של 1:2 (מגיב:מדגם). צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הפסקות (A/D, 9/0).</li>
	<li>באמצעות מיקרופיפטה, לאסוף PBMCs לתוך צינור נקי 50 מ"ל.</li>
	<li>שטפו את התאים פעמיים עם 1x PBS, מילוי עד 50 מ"ל עבור כל כביסה (400 x גרם, 10 דקות, טמפרטורת החדר). להשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של מדיה מלאה.</li>
	<li>ספור את התאים באמצעות כחול טריפאן באמצעות המוציטומטר רגיל או מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לדלל את התאים עם מדיה מלאה כדי להשיג ריכוז של 2 x 106 תאים / מ"ל.</li>
	<li>הפעל 20 x 106 PBMCs על ידי הוספת 10 μL של מגיב גירוי תאי T (ראה טבלת חומרים) לכל 2 x 106 תאים התחלתיים. הערה: פרוטוקול זה מיועד להפעלה של 20 x 106 PBMCs אך ניתן לכוונן אותו למספרי תאים גדולים יותר לפי הצורך.</li>
	<li>מוסיפים rhIL-2 (20 U/mL) (ראו טבלת חומרים), מערבבים בעדינות ומעבירים את התערובת לכלי מתאים (למשל, צלחת עם 6 בארות).</li>
	<li>לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 72 שעות.</li>
</ol>2. התמרה של תאי T Lentiviral (יום 3)
<ol><li>מעבירים את תרבית התאים לכלי מתאים, כגון צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל. ערבב היטב וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר את מגיב ההפעלה. בזהירות להשליך את supernatant לחלוטין להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום שלם. הערה: בשלב זה ניתן להפשיר את הנגיף על קרח.</li>
	<li>ספור את התאים באמצעות כחול טריפאן.</li>
	<li>להשהות מחדש את התאים בתווך מלא כדי להשיג ריכוז המאפשר ציפוי 0.5 x 106 תאים בנפח כולל של 400 μL לכל באר בצלחת 24 באר. הוסף rhIL-7 (155 U/mL) ו- rhIL-15 (290 U/mL) (ראה טבלת חומרים). הערה: הקפד לקחת בחשבון את נפח הווירוסים שיש להוסיף. עיין בשלב 2.4.</li>
	<li>בצינור נפרד, הוסף Vectofusin-1 (ראה טבלת חומרים) למדיום Opti-MEM בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל, עם נפח שווה לנפח הנגיפי שיש להשתמש בו. הערה: שקול את נפח תרבית התאים הכולל בעת חישוב הריכוז של Vectofusin-1. ראה שלב 2.3. לחלופין, Vectofusin-1 GMP יכול לשמש כמגיב בדרגת GMP.</li>
	<li>ערבבו את הנגיף המרוכז ב-MOI (Multiplicity of Infection) של 40 עם תערובת Vectofusin-1/Opti-MEM (יחס של 1:1) וערבבו היטב. מוסיפים תערובת זו לתרבית התאים ומתאימים את הנפח הכולל ל 400 μL לכל באר באמצעות מדיום מלא, במידת הצורך.</li>
	<li>מניחים את המכסה על הצלחת, אוטמים אותה עם סרט פרפין וצנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 2 שעות ב 32 ° C. לאחר מכן, לדגור את הצלחת ב 37 ° C, 5% CO2 לילה.</li>
</ol>3. הסרת וירוסים והרחבת תאי T (יום 4)
<ol><li>לאסוף את התאים ולאגד אותם לתוך כלי מתאים, כגון צינור 50 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות. בזהירות להסיר את supernatant לחלוטין להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיה מלאה.</li>
	<li>ספור את התאים באמצעות כחול טריפאן. להשהות מחדש את התאים במדיה מלאה בריכוז של 1 x 106 תאים / מ"ל. הוסף rhIL-7 (155 U/mL) ו- rhIL-15 (290 U/mL) (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>מעבירים את התאים לכלי מתאים, כגון צלוחיות T25, בריכוז של 0.3-0.5 x 106 תאים לסמ"ק2 ודגרים עליהם ב 37 ° C, 5% CO2, במשך יומיים. הערה: אם נדרשת אוכלוסיית תאים גדולה יותר, ניתן לתרבית תאים (1:2) בנוכחות rhIL7 ו-rhIL-15 כל יומיים, בהתאם לאותם תנאי דגירה שהוזכרו לעיל, עד להשגת מספרי התאים הרצויים.</li>
</ol>4. שימור בהקפאה (יום 14)
הערה: קרח יידרש להעביר קריובלים למקום האחסון במהלך שלב זה. העיתוי של שימור בהקפאה תלוי במספרי התאים הרצויים. עבור פרוטוקול זה, שימור בהקפאה מתבצע ביום ה -14 לאחר השגת הרחבה פי 25.
<ol><li>לאחר שמגיעים למספר התא הרצוי, קצרו את התאים והעבירו אותם לצינורות של 50 מ"ל (התאימו את מספר הצינורות בהתבסס על הנפח הכולל).</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות. בזהירות להסיר את supernatant לחלוטין להשעות את הגלולה ב 10 מ"ל של מדיה. במידת הצורך, אחסן את התאים מצינורות מרובים.</li>
	<li>ספור את התאים באמצעות כחול טריפאן. שמור aliquot של 1 x 106 תאים עבור כל בדיקת בקרת איכות (QC) (עיין בסעיף 5) כדי להעריך מספר העתקה וקטורית ויעילות התמירה.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב RT. בשלב זה, תייגו את הקריובלים בהתאם.</li>
	<li>הסר לחלוטין את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה בתמיסת שימור קריוגנית המורכבת מ- 50% HSA ו- 40% HBSS בריכוז של 1 x 107 תאים למ"ל לכל קריוביאלי. העבר את תרחיף התא למספר המתאים של קריוביאליים והוסף 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לכל קריוביאלי.</li>
	<li>הניחו את הקריובלים על קרח והעבירו אותם מיד למקפיא בקצב מבוקר לשימור בהקפאה. לאחר ההקפאה, העבירו את הקריביאלים למיכל חנקן נוזלי מנוטר לאחסון לטווח ארוך.</li>
</ol>5. בקרת איכות (יום 14)
הערה: לצורך בדיקות שחרור, המוצר עבר מספר בדיקות, כולל בדיקות סטריליות לגדילה מיקרוביאלית, והערכת רמת אנדוטוקסין. בדיקות אלה נערכו במעבדות מוסמכות בבית החולים הכללי האוניברסיטאי של פטרס ובאוניברסיטת פטרס. נוכחות מיקופלסמה נקבעה בתוך החברה באמצעות בדיקת זיהוי ביוכימי ונמדדה על לומנומטר בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). פנוטיפ התא (איור 1), כמו גם מספר התא והכדאיות שלו הוערכו בתוך החברה על-ידי ציטומטריית זרימה (ראו סעיף 5.1) ומונה תאים אוטומטי (ראו טבלת חומרים), בהתאמה. קריטריוני שחרור נקבעו בהתבסס על נתונים שפורסמו והמלצות 10,11 עבור מוצרי תאים המיוצרים בתקן GMP (טבלה 1).
<ol><li>ביצוע צביעת ציטומטריה של יעילות התמרה - זרימה (יום 14) הערה: aliquot של 1 x 106 תאים יוכתם עבור כדאיות (7-AAD) וסמן CD32 כדי להעריך את יעילות ההמרה (ראה טבלת חומרים). אם הגן המעניין, כמו במקרה של תאי CAR T, צריך להיות מזוהה, הנוגדן הספציפי צריך להיות בצבע שונה מזה של סמן CD3 ו 7-AAD כדי למנוע פיצוי. יש לקחת בחשבון דגימות בקרה מתאימות.<ol><li>מקם את הדגימה בשפופרת FACS והוסף 500 μL של מאגר FACS.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם ב RT במשך 5 דקות.</li>
		<li>יש להשליך לחלוטין את הסופרנאטנט עם פיפטה ולהשהות מחדש את הגלולה בתמיסה מדוללת ביחס 1:5 של חיץ CD3:FACS (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>מערבבים את הדגימה ודגרים במשך 30 דקות על קרח בחושך.</li>
		<li>הוסף 500 μL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות (RT).</li>
		<li>השליכו לחלוטין את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה בתמיסה מדוללת ביחס 1:20 של חיץ 7-AAD:FACS (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>מערבבים את הדגימה ודגרים במשך 10 דקות על קרח בחושך.</li>
		<li>הוסף 200 μL של מאגר FACS ונתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+%28CTL019%29+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19%2B+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183(2015).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Wang, X., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells%3A+foundation+of+a+promising+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).</li>
<li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li>
<li>Kaiser, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+commercial+process+for+the+manufacture+of+genetically+modified+T+cells+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+quality%2C+non-clinical+and+clinical+aspects+of+medicinal+products+containing+genetically+modified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Medicines+Agency%22%5BJournal%5D)">Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.</a> European Medicines Agency. , EMA/CAT/GTWP/671639/2008 Rev. 1 - corr., Committee for Advanced Therapies (CAT) (2020).</li>
<li>Castella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+CAR+T-Cell+production+%28ARI-0001%29+using+a+closed+semi-automatic+bioreactor%3A+experience+from+an+academic+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial.</a> Frontiers in Immunology. 11, 482(2020).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviruses+as+gene+transfer+agents+for+delivery+to+non-dividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).</li>
<li>Ausubel, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+CGMP-grade+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+International%22%5BJournal%5D)">Production of CGMP-grade lentiviral vectors.</a> Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).</li>
<li>Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+viral+vector+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in viral vector manufacturing.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).</li>
<li>Rad, S. M. A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+choice%3A+Who+should+drive+the+CAR+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells.</a> PLoS One. 15 (7), e0232915(2020).</li>
<li>Sandrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+a+modified+RD114+envelope+glycoprotein+show+increased+stability+in+sera+and+augmented+transduction+of+primary+lymphocytes+and+CD34%2B+cells+derived+from+human+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates.</a> Blood. 100 (3), 823-832 (2002).</li>
<li>Costello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+stimulated+and+unstimulated+T+lymphocytes+by+HIV-1-derived+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).</li>
<li>Radek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectofusin-1+improves+transduction+of+primary+human+cells+with+diverse+retroviral+and+lentiviral+pseudotypes%2C+enabling+robust%2C+automated+closed-system+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing.</a> Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).</li>
<li>Hanenberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+retrovirus+and+target+cells+on+specific+fibronectin+fragments+increases+genetic+transduction+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.</a> Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).</li>
<li>Lamers, C. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retronectin-assisted+retroviral+transduction+of+primary+human+T+lymphocytes+under+good+manufacturing+practice+conditions%3A+tissue+culture+bag+critically+determines+cell+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield.</a> Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>Wang, R. -N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+%CE%B3%CE%B4+T+cell+expansion+and+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for γδ T cell expansion and lentiviral transduction.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+and+optimization+of+protocols+for+producing+recombinant+lentivirus+carrying+the+anti-Her2+chimeric+antigen+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027(2018).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+the+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
</ol>

נ.ש. פיתח את הפרוטוקול וכתב את כתב היד שנבדק ופוקח על ידי א.ש.; ק"ש, ג.א. ביצעו ניסויים נוספים; D.K., M.L. סיפקו תמיכה רבת ערך בניסויים ויחד עם V.Z., N.T. בתהליך הסקירה. נ.ט. חברה בחברת פרוטאונס בע"מ. כל שאר המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

וקטורים לנטי-ויראליים ככלי להעברת גנים הם כלים חשובים בתחום התרפיה התאית והגנטית בשל יכולתם להתמיר תאים מתחלקים ובלתי מתחלקים12. עם זאת, ייצור בקנה מידה גדול של וקטורים לנטי-ויראליים בשיטות תואמות GMP עדיין מאתגר בשל פרמטרים שונים, כגון שיטות טרנספקציה ושלבי טיהור, אשר יכולים לגרום לשונות באצוות lentivirus. מרכזים אקדמיים משיגים לעתים קרובות מלאי ויראלי מחברות ביוטכנולוגיה לייצור ויראלי, המספקות תיעוד על הפונקציונליות והבטיחות של הנגיף כדי לעמוד בקריטריוני שחרור13,14</...

הופעתם של טיפולים תאיים מאמצים (ACT) ותאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T הביאו לשינוי מהפכני בפרקטיקה הקלינית המודרנית, וביססו פרדיגמה חדשה של רפואה מותאמת אישית. בפרט, תאי CAR-T המכוונים ל- CD19 הוכיחו תגובות קליניות יוצאות דופן ומייצגים את הטיפול המתקדם ביותר בתאי T לממאירויותתאי B 1,2,3,4,5. עם זאת, הטיפולים הנוכחיים בתאי T מהונדסים גנטית מסתמכים במידה רבה על וקטורים נגיפיים להעברת גנים. היישום של וקטורים נגיפיים ב- ACT, במיוחד בתנאי תנאי ייצור נאותים (GMP) במסגרת אקדמית, מציב אתגרים משמעותיים עקב מגבלות מדרגיות, דרישות ציוד מיוחדות, הצורך בכוח אדם מיומן והשימוש בריאגנטים תואמי GMP לייצור חלקיקים נגיפיים בתיווך פלסמיד 6,7,8.
כתוצאה מכך, תהליך הייצור עבור טיפולים בתאי T מהונדסים גנטית הוא מורכב ומתחיל בדרך כלל עם בידוד של תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם (PBMCs) ממוצר leukapheresis. תאי T מועשרים לעתים קרובות ממאגר PBMC ומופעלים באמצעות מיקרו-קומפלקסים 7,9 נגד CD3/CD28. לאחר מכן, תאי T מהונדסים גנטית עם וקטורים נגיפיים או לא ויראליים, אשר ניתן לייצר באתרם או במיקור חוץ. כדי להשיג את מספרי התאים הדרושים לעירוי, תאים מהונדסים גנטית מורחבים לפני ניסוח סופי ו / או שימור בהקפאה. לבסוף, מוצר התא חייב לעמוד בקריטריוני שחרור שונים המבוססים על מבחני בקרת איכות מרובים9.
פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה מקיפה המשתמשת בטכניקות פשוטות למניפולציה ex vivo של PBMCs בריאים לייצור מוצר תאי T מהונדסים גנטית בתנאים תואמי GMP. הפרוטוקול משלב שימוש בווקטור לנטי-ויראלי, אשר ניתן למיקור חוץ לחברת ייצור נגיפים המספקת את כל הבדיקות הכמותיות/פונקציונליות, הטוהר והבטיחות הדרושות (למשל, טיטר נגיפי, זיהוי של לנטיוירוס בעל יכולת שכפול DNA של התא המארח). עבור מחקר זה, הווקטור המשמש הוא VSV-g (Vesicular Stomatitis Virus G Protein) מבוסס וקטור לנטיויראלי מהדור השני עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כגן המעניין, בביטוי מכונן.

<table><tbody><tr><td>צלחת מטופלת TC 24 בארות</td><td>353047</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור FACS 5 מ"ל&nbsp;</td><td></td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פלקון 50 מ"ל</td><td>גריינר ביומדיקה</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מטופלת TC 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS CANTO II</td><td>BD Biosciences</td><td>V96300084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter&nbsp;</td><td>Corning Cell Cytosmart</td><td>J21E0081</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Greiner biomedica</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)-</td><td></td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10.6.2&nbsp;</td><td>TreeStar</td> <td>Inc-Gibco</td><td></td></tr> <tr><td>CTS Opti-MEM I Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4124801</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-15</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-114</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-146</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-111</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>HEPA Whitley H35 Hypoxystation</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>HA0315172H</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום אנושי (HSA)</td><td>בקסטר</td><td>B05AA01</td><td></td></tr><tr><td>ג'וניור LB 9509 לומינומטר נייד</td><td>Berthold Technologies</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כימות Lenti-X Provirus</td><td>Takara Bio</td><td>631239</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP T cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-156</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי&nbsp; CD3 (שיבוט: UCHT-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>557706</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זיהוי MycoAlert Plus</td><td>Lonza Bioscience</td><td>LT07-703</td><td></td></tr><tr><td>סרט סגירה הניתן להרחבה במיוחד של Parafilm 5 ס"מ x 75 מ'</td><td>D.Dutscher</td><td>90261</td><td></td></tr><tr><td>PeriStem PS-650-DB (שקית אפרזיס)</td><td>מכשיר ביומד</td><td>SC00816</td><td></td></tr><tr><td>פלנר Kryo10 סדרה III</td><td>פלנר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 צלוחיות</td><td>Greiner biomedica</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול, תמיסה של 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vectofusin-1 GMP</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-165</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVOTM 15 ללא סרום תאים המטופויאטיים בינוני</td><td>Lonza Bioscience</td><td>A1048501</td><td></td></tr></tbody></table>

הליך תואם gmp לייצור תאי t מהונדסים גנטית

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

תחום הטיפול התא המאמץ (ACT) עבר מהפכה על ידי פיתוח תאים מהונדסים גנטית, במיוחד תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T. תאים מהונדסים אלה הראו תגובות קליניות יוצאות דופן בחולים עם ממאירויות המטולוגיות. עם זאת, העלות הגבוהה של ייצור טיפולים אלה וביצוע הערכות בקרת איכות נרחבות הגבילה את נגישותם למגוון רחב יותר של מטופלים. כדי להתמודד עם בעיה זו, מוסדות אקדמיים רבים בוחנים את ההיתכנות של ייצור פנימי של תאים מהונדסים גנטית, תוך שמירה על הנחיות שנקבעו על ידי סוכנויות רגולטוריות לאומיות ובינלאומיות.
ייצור מוצרי תאי T מהונדסים גנטית בקנה מידה גדול מציב מספר אתגרים, בעיקר מבחינת יכולות הייצור של המוסד והצורך לעמוד בדרישות כמות העירוי. אתגר מרכזי אחד כרוך בייצור וקטורים נגיפיים בקנה מידה גדול תחת הנחיות תנאי ייצור נאותים (GMP), אשר לעתים קרובות מועברים במיקור חוץ לחברות חיצוניות. בנוסף, פישוט תהליך ההתמרה של תאי T יכול לסייע במזעור השונות בין אצוות ייצור, להפחית עלויות ולהקל על הכשרת כוח אדם. במחקר זה, אנו מתארים תהליך יעיל להתמרה לנטיויראלית של תאי T אנושיים ראשוניים עם סמן פלואורסצנטי כגן המעניין. התהליך כולו עומד בתקנים תואמי GMP ומיושם בתוך המוסד האקדמי שלנו.

הערכת יעילות התמרה התאים המומרים הוערכו לביטוי גן העניין (GFP) באמצעות ציטומטריית זרימה. תוצאות מייצגות מתוארות באיור 1. ביום ה-14, יותר מ-95% מהתאים היו CD3+, מה שמצביע על הפעלה מוצלחת של תאי T והתרחבותם. יעילות ההולכה באוכלוסיית +CD3 נמדדה ב-58.7% (TD, איור 1C) בהשוואה לתאים הלא-מומרים (UNTD, איור 1B) שהציגו יעילות התמרה של 0.51%. ניתוח כדאיות הראה שיותר מ-95% מהתאים היו בחיים ל...

פרוטוקול זה מתאר את תהליך התמרת תאי T אנושיים ראשוניים עם גן מעניין, ומבטיח תאימות לתקני תנאי ייצור נאותים (GMP).

הליך תואם GMP לייצור תאי T מהונדסים גנטית

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

פרוטוקול זה מתאר תהליך פשוט ותל"ג של התמרת תאי T ראשוניים אנושיים עם גן מעניין. טכניקה ספציפית זו תוכננה להיות חסכונית ותל"ג ללא שימוש בפלטפורמות ייצור יקרות של מערכות סגורות הזמינות כיום במרכזים אקדמיים רבים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת באופן פוטנציאלי ביצירת טיפולים תאיים מהונדסים גנטית, כולל אך לא מוגבל לתאי CAR T, אשר היוו שינוי פרדיגמה להתמודדות עם ממאירויות המטולוגיות.כדי לבודד PBMC מהתאים שנאספו לאחר לויקפרזיס של דם תורם, בצע צנטריפוגה הדרגתית צפיפות מבוססת רב-סוכר של הדגימה, תוך שמירה על יחס מגיב לדגימה של 1:2, על ידי צנטריפוגה של התערובת ב 800 גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלמים כבויים. לאחר מכן באמצעות מיקרופיפטה, לאסוף את PBMCs לתוך צינור נקי 50 מיליליטר. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS על ידי צנטריפוגה.לפני השעיית התאים שטופים במדיה hematopoietic מלא. הפעל כ -20 מיליון מהתאים המתקבלים על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של מגיב גירוי תאי T לכל 2 מיליון תאים. לאחר מכן, לאחר הוספת אינטרלוקין-2 אנושי רקומביננטי ב 20 יחידות למיליליטר, מערבבים את התמיסה בעדינות ומעבירים אותה לצלחת שש בארות.לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות לפני ביצוע התמרה ויראלית. ביום השלישי מעבירים את תרבית התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומערבבים אותו היטב. צנטריפוגה את הצינור ב

a-gmp-compliant-procedure-for-the-generation-of-gene-modified-t-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול מהיר, פשוט וחסכוני עבור הדור של התורם הנגזרות multivirus ספציפי ההרג (rCTL) עבור עירוי כדי allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (HSCT) מקבלי בסיכון לפתח זיהומים CMV, עו"ד או EBV. תהליך הייצור GMP תואמי וצריך להבטיח את יישום רחב יותר של חיסוני T-cell מעבר במרכזים מיוחדים.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

הסרטון מתאר תהליך ליצירת תאי CAR T מהונדסים גנטית באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. הדבקת תאי T ב-CRISPR וב-CAR lentiviruses גורמת לשינויים בגן המטרה ולסינתזה של קולטן אנטיגן כימרי או CAR, מה שמוביל בסופו של דבר להיווצרות תאי CAR T מהונדסים גנטית.

שינוי גנטי של תאי CAR T באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

סרטון זה מדגים בדיקה לביצוע עריכת גנים בתאי T אנושיים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. תערובת של תאי T ראשוניים CD4+ ו- CD8+ משולבת עם קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9, המכוון לגנים ספציפיים לנוקאאוט. לאחר ההתחשמלות, ה-sgRNA מנחה את Cas9 לרצף הדנ"א של המטרה, ויוצר חתכים מדויקים. חתכים אלה מתוקנים לאחר מכן על ידי מנגנון חיבור הקצה הלא הומולוגי של התא, המוביל לנוקאאוט גנטי.

טכניקת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים בתאי T

תאי T מבטאים רצפטור אנטיגן chimeric CD19 ספציפי (CAR) הם חדורים כטיפול investigational של ממאירויות B-cell בניסויים בריפוי הגנטי הראשונים ב-האנושיים שלנו. אנו מתארים שינוי גנטי של תאי T...

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

ניתן למנף את ההשפעות הלימפודו-דפלטיביות והאימונומודולטוריות של טיפול סטנדרטי בכימותרפיה והקרנות כדי לשפר את היעילות האנטי-גידולית של אימונותרפיה של תאי T. אנו מתארים שיטה ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים ל-EGFRvIII (CAR) ומתן אותם בהקשר של סטנדרט הטיפול בגליובלסטומה.

דור של תאי T CAR למאמצת תרפיה בהקשר של גליובלסטומה טיפול סטנדרטי

בזאת אנו מתארים שיטה חדשנית להפקה לקולטנים המצויים בתאי T אנטיגן ספציפי (TCRs) על ידי התאמת TCRα או TCRβ של TCR קיים, שהוא בעל אנטיגן-הסגולי של עניין, עם hemichain המשלים של רפרטואר קולטן תא ההיקפי T. TCRs שנוצר דה נובו לשמר אנטיגן-סגולי עם משתנה זיקה.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לערוך גנטית לרכב-T תאים דרך CRISPR/Cas9 מערכת.

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

מאמר זה מפרט את תהליך הייצור של תאי T קולטני אנטיגן כימריים לשימוש קליני, במיוחד באמצעות מעבד תאים אוטומטי המסוגל לבצע התמרה נגיפית וטיפוח של תאי T. אנו מספקים המלצות ומתארים מלכודות שיש לקחת בחשבון במהלך תהליך הפיתוח והיישום של ניסוי קליני בשלב מוקדם.

ייצור תאי T של קולטן אנטיגן כימרי על מעבד תאים אוטומטי

פרוטוקול זה מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי ואת התמרת תאי T מורין, ומאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-T בעכבר.

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

פרוטוקול זה מתאר שיטה ניתנת להרחבת מוצרי טיפולי תאים מאמצים (ACT), כלומר קולטני אנטיגן כימרי (CAR)-תאי T ותאי Cytokine Killer (CIK), תוך שימוש במכשירי התרחבות מהירה חדירת גז (G-Rex), המדגימים גדילה יעילה וחזקה בסביבה קלינית רלוונטית.

יצירה יעילה ומהירה של CAR-T ותאי הרג מונעים מציטוקין במכשירים הניתנים להרחבה GMP

למדו הליך תואם GMP לייצור תאי T מהונדסים גנטית מתאי PBMC אנושיים. שיטה זו חסכונית ומאפשרת פיתוח תרפיות CAR T-cell לטיפול במחלות דם ממאירות.

הליך תואם GMP לייצור תאי T מהונדסים גנטית

גלה סרטונים נוספים