Name: הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: למד הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות. השיטה משלבת מיקרוסקופיית Raman עם פלואורסצנציה דו-פוטונית לרזולוציה תת-תאית ללא סימון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר יג'ואן לי ואנתוני פונג על תמיכתם הטכנית, ולמעבדת Fraley על קו התאים. אנו מודים לקרנות הסטארט-אפ של UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 ופרס עמית הלמן.

<ol><li>Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amino+acids+in+nutrition+and+health%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Functional amino acids in nutrition and health.</a> Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).</li>
<li>Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+amino+acids+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of amino acids in cancer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).</li>
<li>Parthasarathy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-ring+circus%3A+Metabolism+of+the+three+proteogenic+aromatic+amino+acids+and+their+role+in+the+health+of+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l-tryptophan+activates+mammalian+target+of+rapamycin+and+enhances+expression+of+tight+junction+proteins+in+intestinal+porcine+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells.</a> The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
<li>Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signalling+and+cellular+metabolism+are+mutual+determinants+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).</li>
<li>Kimura, T., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+protects+hepatocytes+against+reactive+oxygen+species-dependent+cell+death+via+multiple+pathways+including+Nrf2-dependent+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction.</a> Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+supplementation+with+aromatic+amino+acids+decreased+triglycerides+and+alleviated+hepatic+steatosis+by+stimulating+bile+acid+synthesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Function%22%5BJournal%5D)">Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice.</a> Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+implications+of+natural+compounds+targeting+lipid+metabolism+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%2C+obesity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).</li>
<li>Lubes, G., Goodarzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+based+metabolomics+used+for+the+identification+of+cancer+volatile+organic+compounds+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).</li>
<li>Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+metabolic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">The potential of metabolic imaging.</a> Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).</li>
<li>Bowman, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lipid+coverage+and+high+spatial+resolution+MALDI-imaging+capabilities+of+oversampling+combined+with+laser+post-ionisation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).</li>
<li>Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+lipid+species+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry.</a> Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).</li>
<li>Pirman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cancer+cell+metabolism+revealed+by+direct+sample+analysis+with+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), e61379(2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lipidomics+with+high+structural+specificity+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry.</a> Nature Communications. 12 (1), 2869(2021).</li>
<li>Miyagi, M., Kasumov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+synthesis+of+biomolecules+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions.+Series+A%2C+Mathematical%2C+Physical+and+Engineering+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry.</a> Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378(2016).</li>
<li>Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+recognition+of+sphingomyelin-rich+membrane+domains+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).</li>
<li>Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+and+tissue+imaging+using+Raman+and+coherent+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501(2020).</li>
<li>Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stimulated+Raman+scattering+imaging+for+tissues+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Imaging+in+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals.</a> Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).</li>
<li>Yamakoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+EdU%2C+an+alkyne-tagged+cell+proliferation+probe%2C+by+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+metabolic+dynamics+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of metabolic dynamics in animals.</a> Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).</li>
<li>Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cancer+cell+metabolic+dynamics+regulated+with+aromatic+amino+acids+using+DO-SRS+and+2PEF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702(2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+of+lipid+metabolic+changes+in+drosophila+ovary+during+aging+using+DO-SRS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy.</a> Frontiers in Aging. 2, 819903(2022).</li>
<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+metabolic+dynamics+in+aging+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila.</a> Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Fung, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+sub-cellular+methionine+and+insulin+interplay+in+triple+negative+breast+cancer+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism.</a> Frontiers in Oncology. 12, 858017(2022).</li>
<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+diet+regulated+metabolic+activities+in+Drosophila+during+aging+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes.</a> Aging Cell. 21 (4), e13586(2022).</li>
<li>Shi, L., Wei, M., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-multiplexed+tissue+imaging+with+raman+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63547(2022).</li>
<li>Rysman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+lipogenesis+protects+cancer+cells+from+free+radicals+and+chemotherapeutics+by+promoting+membrane+lipid+saturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation.</a> Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).</li>
<li>Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lipid+class+homeostasis+is+altered+under+nutrient-deprivation+but+stable+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia.</a> BMC Cancer. 19 (1), 501(2019).</li>
<li>Thiam, A. R., Dugail, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-membrane+contact+sites+-+from+protein+binding+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function.</a> Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).</li>
<li>Schott, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+size+directs+lipolysis+and+lipophagy+catabolism+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).</li>
<li>Hoang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+resolution+DO-SRS+and+2PEF+imaging+of+metabolic+dynamics+regulated+by+L-methionine+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Biopsy+XXI%3A+Toward+Real-Time+Spectroscopic+Imaging+and+Diagnosis.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+A-PoD%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+metabolic+imaging+uncovers+sex-+and+diet-dependent+lipid+changes+in+aging+drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-molecular+hyperspectral+PRM-SRS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Chang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+cell+metabolism+and+lipid+production+in+3D+engineered+human+adipose+tissues+using+label-free+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy.</a> Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).</li>
<li>Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/</a> (2023).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

הדמיית DO-SRS ו-2PEF יושמה כדי לחקור דינמיקה מטבולית במודלים שונים של ex vivo, כולל דרוזופילה ורקמות אנושיות 21,22,23,24,26,27,33. שיטת ההדמיה המשמשת במחקר זה משלבת DO-SRS ומיקרוסקופ 2PEF, אשר יכול לעקוף שיטות הדמיה ספציפיות אחרות למולקולות על ידי ביטול הצורך במיצוי מולקולות או תיוג...

להיות חומצות אמינו ארומטיות חיוניות (AAAs), פנילאלנין (Phe) וטריפטופן (Tryp) יכול להיספג על ידי גוף האדם כדי לסנתז מולקולות חדשות לקיום פונקציות ביולוגיות נורמליות1. Phe נדרש לסינתזה של חלבונים, מלנין וטירוזין, ואילו Tryp נדרש לסינתזה של מלטונין, סרוטונין וניאצין 2,3. עם זאת, צריכה עודפת של AAAs אלה יכולה לווסת את המטרה של יונקים במסלול רפמיצין (mTOR), לעכב קינאז חלבון המופעל על ידי AMP, ולהפריע לחילוף החומרים במיטוכונדריה, לשנות באופן קולקטיבי את הביוסינתזה של מקרומולקולות ולהוביל לייצור של מבשרים ממאירים, כגון מיני חמצן תגובתי (ROS) בתאים בריאים 4,5,6. הדמיה ישירה של דינמיקה מטבולית משתנה תחת עודף רגולציה AAA חיונית כדי להבין את תפקידם של AAA בקידום התפתחות סרטן וצמיחה של תאים בריאים 7,8,9.
מחקרי AAA מסורתיים מסתמכים על כרומטוגרפיית גז (GC)10. שיטות אחרות, כגון דימות תהודה מגנטית (MRI), הן בעלות רזולוציות מרחביות מוגבלות, דבר המקשה על ביצוע אנליזה תאית ותת-תאית של דגימות ביולוגיות11. לאחרונה, סופח/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) פותח כדי להבהיר את התפקיד של AAAs בסינתזות שומנים וחלבונים בהתפשטות סרטן עם סמנים ביולוגיים לא פולשניים12,13,14. עם זאת, טכניקה זו עדיין סובלת מעומקי הדמיה רדודים, רזולוציה מרחבית ירודה והכנת דגימות נרחבת. ברמה התאית, ניתן לעקוב אחר איזוטופים יציבים לא רעילים, כגון חנקן-15 ופחמן-13, באמצעות הדמיה מרובת איזוטופים וספקטרומטריית מסות יונים משנית ננומטרית כדי להבין את שילובם במקרומולקולות. עם זאת, שיטות אלה הרסניות לדגימות ביולוגיות חיות15,16. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא טכניקה רבת עוצמה נוספת שיכולה לדמיין דינמיקה מטבולית17. קצב הסריקה האיטי במהלך דימות AFM, לעומת זאת, עלול לגרום לעיוות תמונה כתוצאה מסחיפה תרמית.
פיתחנו שיטת הדמיה דו-אורתוגונלית לא פולשנית על-ידי צימוד תחמוצת דאוטריום (D2O), מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (DO-SRS) ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של עירור שני פוטונים ללא תוויות (2PEF). שיטה זו משיגה רזולוציה מרחבית גבוהה וספציפיות כימית בעת הדמיה של דגימות ביולוגיות 18,19,20,21,22,23,24. פרוטוקול זה מציג את היישומים של DO-SRS ו- 2PEF כדי לבחון את הדינמיקה המטבולית של שומנים, חלבונים ושינויים ביחס חמצון-חיזור במהלך התקדמות סרטן. כאשר D2O הוא צורה איזוטופית יציבה של מים, ביומולקולות תאיות יכולות להיות מסומנות בדאוטריום (D) בשל הפיצוי המהיר שלו עם סך כל מי הגוף בתאים, ויוצרים קשרי פחמן-דאוטריום (C-D) באמצעות חילופי אנזימטיים21. קשרי C-D במקרומולקולות מסונתזות חדשות, כולל שומנים, חלבונים, דנ"א/רנ"א ופחמימות, ניתנים לזיהוי באזור הדממה התאית של ספקטרום ראמאן 20,21,22,25,26,27. עם שני פולסי לייזר מסונכרנים, קשרי C-D של ליפידים וחלבונים מסונתזים חדשים יכולים להיות מוצגים על תאים בודדים באמצעות הדמיה היפרספקטרלית (HSI) מבלי לחלץ או לתייג אותם עם חומרים ציטוטוקסיים. בנוסף, למיקרוסקופ SRS יש את היכולת לבנות מודלים תלת מימדיים (3D) של אזורים נבחרים בעלי עניין בדגימות ביולוגיות על ידי לכידת ושילוב קבוצה של תמונות חתך22,26. עם הדמיה נפחית היפרספקטרלית ותלת-ממדית, DO-SRS יכול להשיג התפלגות מרחבית של מקרומולקולות מסונתזות חדשות בתאים בודדים, יחד עם סוג האברונים המאפשרים את תהליך קידום צמיחת הסרטן תחת תקנה22 של AAA. יתר על כן, באמצעות 2PEF, אנו יכולים לקבל אותות אוטופלואורסצנטיים של פלבין וניקוטין-אמיד אדנין דינוקלאוטיד (NADH) ברזולוציה גבוהה, עומק חדירה עמוק ונזק ברמה נמוכה בדגימות ביולוגיות21,23,24. אותות אוטופלואורסנציה של פלבין ו- NADH שימשו לאפיון הומאוסטזיס חמצון-חיזור וחמצון שומנים בתאי סרטן22,26. ככזה, לא רק שהצימוד של DO-SRS ו-2PEF מספק אנליזה תת-תאית של דינמיקה מטבולית מווסתת AAA בתאים סרטניים עם פיזור מרחבי גבוה, מידע על ספציפיות כימית והכנת דגימה מינימלית, אלא שהשיטה גם מפחיתה את הצורך לחלץ או לתייג מולקולות אנדוגניות בריאגנטים רעילים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים תחילה את ההליכים של D2O והכנת חומצות אמינו, כמו גם תרבית תאים סרטניים. לאחר מכן, אנו מראים את הפרוטוקולים של דימות DO-SRS והדמיית 2PEF. לבסוף, אנו מציגים את התוצאות המייצגות של SRS והדמיית 2PEF, המדגימות שינויים מטבוליים מווסתים AAA של שומנים וחלבונים, ושינויים ביחס חמצון-חיזור בתאים סרטניים. המחשה מפורטת של התהליך מודגשת באיור 1.

<table><tbody><tr><td>10 מ"ל פיפטות סרולוגיות&nbsp;</td><td>Avantor (by VWR)</td> <td>75816-100</td><td>https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664</td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד, ללא מתנול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td>צלחת</td></tr> <tr><td></td><td>24 בארות https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906פישרברנד</td><td>FB0112929</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 מסנן מזרק 25 מ"מ, 2 &mu; m PES</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>381-2216-OEM</td><td></td></tr><tr><td>https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 460 ננומטר קוביית מסנן</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>OCT-ET460/50M32</td></tr><tr><td>מתאמי AC של ספק הכוח עבור LD OBIS 6 לייזר מרחוק</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>אספקת חשמל</td></tr><tr><td>למסנן מעבר פס</td> הלייזר <td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 מגה-הרץ</td></tr><tr><td>טרמינטור BNC 50 אוהם&nbsp;</td><td>מיני מעגלים</td><td>כבל STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>BNC</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>כבל קואקסיאלי, BNC זכר/זכר</td></tr><tr><td>פס רחב מראה דיאלקטרית</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 ננומטר</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעבה</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>קורנינג</td><td>2850-25</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח DC</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>הר דיכרואי</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>מגיב תרבית תאים דימתיל סולפוקסיד</td><td>mpbio&nbsp;</td><td>196055</td><td>https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf</td></tr><tr><td>הנשר השונה של דולבקו' s בינוני ללא מתיונין, תראונין ונתרן פירובט</td><td>MilliporeSigma</td><td>38210000</td><td>https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder עם סודיום ביקרבונט וללא מתיונין, תראונין וסודיום פירובאט&nbsp;</td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle' s</td><td>קורנינג</td> בינוני <td>MT10027CV</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>גרסה 1.53t 24 באוגוסט 2022</td><td></td></tr><tr><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads מים כבדים (תחמוצת דאוטריום)</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג', בע"מ.</td><td>7732-18-5</td><td>https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L</td></tr><tr><td>תאי הלה</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>https://www.atcc.org/products/ccl-2 המוצימטר</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z359629-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB & gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>מסנן פס פס גבוה OD</td><td>טכנולוגיית Chroma</td><td>ET890/220m</td><td>סנן את קרן סטוקס ושדר את קרן המשאבה</td></tr><tr><td>HyClone סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH300880340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340</td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.25% (1x) פתרון</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td></td></tr><tr><td>https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 מערכת לייזר SRS משולבת</td><td>פיזיקה יישומית & אלקטרוניקה בע"מ</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD מספק פולס יציאה ב-1031 ננומטר עם רוחב פולס של 6 ps וקצב חזרה של 80 מגה-הרץ, המשמש כקרן סטוקס. האלומה הכפולה בתדר ב-532 ננומטר משמשת לזריעה סינכרונית של מתנד פרמטרי אופטי פיקו-שנייה (OPO) כדי לייצר רכבת דופק נעולה במצב עם רוחב דופק של חמישה ~ 6 ps (קרן הסרק של ה-OPO חסומה עם מסנן אינטרפרומטרי). אורך גל הפלט של ה-OPO ניתן לכוונון מ-720&ndash; 950 ננומטר, המשמש כקרן המשאבה. עוצמת קרן סטוקס 1031 ננומטר מווסתת באופן סינוסואידי, על ידי EOM מובנה ב-8 מגה-הרץ עם עומק אפנון של יותר מ-90%. קרן המשאבה חופפת מרחבית לקורת סטוקס באמצעות מראה דיכרואית בתוך picoEMERALD. החפיפה הזמנית בין פולסי המשאבה לסטוקס מושגת עם שלב עיכוב מובנה וממוטבת על ידי אות SRS של D2O טהור במיקרוסקופ.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>תיבת בקרה IX3-CBH</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>שליטה במיקרוסקופ סריקת הלייזר</td></tr><tr><td>הר מראה קינמטי</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 מכווני משושה בפרופיל נמוך</td></tr><tr><td>L-Phenalynine</td><td>Sigma</td><td>P5482-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482</td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T8941-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941</td></tr><tr><td>LabSpec 6</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>מגבר נעילה</td> https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ <td>Zurich Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier</td></tr><tr><td>מפצל קרן דיכרואי ארוך עובר</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 ננומטר לייזר BrightLine מפצל קרן דיכרואי שטוח לייזר חד קצה</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>גרסת: R2022b</td><td></td></tr><tr><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html שקופיות מיקרוסקופ</td><td>פישרברנד</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 תוכנת הדמיית מיקרוסקופיה</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>MPLN 100x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364</td></tr><tr><td>MPLN 50x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON&nbsp;</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[פוקוס]=cmsContent11363</td></tr><tr><td>מעבה שמן NA</td><td>אולימפוס&nbsp;</td><td>6-U130</td><td>לק https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser</td></tr><tr><td>Wet</td><td>n Wild</td><td>B01EO2G5O4</td><td>https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW מקור HHQP38FXXDC_0</td></tr><tr><td></td><td>OriginLab</td><td>Origin 2022b (9.95)</td><td>https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782</td></tr><tr><td>PBS 1x (מי מלח בופר פוספט של Dulbecco)</td><td>תרמופישר-14040117</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמופישר - Gibco</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>מכלול פריסקופ</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>כולל את היחידות העליונות והתחתונות, &Oslash; עמוד 1 אינץ', ומזלג הידוק.</td></tr><tr><td>picoEmerald System</td><td>A.P.E</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ קופסה מסוככת עם מחברי BNC</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>קופסת אלומיניום עם כיסוי, BNC נקבה/נקבה</td></tr><tr><td>Si גלאי פוטודיודה</td><td>ביתי נבנה</td> מסדרת <td>N/A</td><td>DYI</td></tr> מרווחי <tr><td>פרוסות</td><td></td><td></td><td></td>סיליקון</tr><tr><td></td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/</td></tr> <tr><td>ספקטרוסקופיה ספונטנית של רמאן</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/</td></tr> <tr><td>מיקרוסקופיית פיזור רמאן מגורה</td><td>ביתית</td><td>ללא</td><td></td></tr><tr><td>מגע&nbsp; בקר פאנל</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>שליטה בכיוון ה-XY של מיקרוסקופ סריקת הלייזר</td></tr><tr><td>טריפן כחול 0.4% (0.85% NaCl)&nbsp;</td><td>לונזה</td><td>17-942E</td><td>https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Kaverme - אמזון</td><td>B07RNVXXV1</td><td>https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עירור שני פוטונים</td><td>נבנה בבית</td> נייר שקילה <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper</td></tr><tr><td>תוכנת ציריך LabOneQ</td><td>מכשירי</td><td></td> ציריך <td>שולטים במגבר הנעילה של ציריך</td></tr></tbody></table>

הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

חומצות אמינו ארומטיות חיוניות (AAAs) הן אבני בניין לסינתזה של ביומסות חדשות בתאים ולשמירה על תפקודים ביולוגיים תקינים. לדוגמה, אספקה שופעת של AAAs חשובה לתאים סרטניים כדי לשמור על הצמיחה והחלוקה המהירה שלהם. עם זאת, יש ביקוש גובר לגישת הדמיה ספציפית מאוד, לא פולשנית עם הכנת דגימה מינימלית כדי לדמיין ישירות כיצד תאים רותמים AAAs עבור חילוף החומרים שלהם באתרו. כאן, אנו מפתחים פלטפורמת הדמיה אופטית המשלבת חיטוט תחמוצת דאוטריום (D2O) עם פיזור ראמאן מגורה (DO-SRS) ומשלבת DO-SRS עם פלואורסצנטיות עירור של שני פוטונים (2PEF) במיקרוסקופ יחיד כדי להמחיש ישירות את הפעילות המטבולית של תאי HeLa תחת רגולציה AAA. באופן קולקטיבי, פלטפורמת DO-SRS מספקת רזולוציה מרחבית גבוהה וספציפיות של חלבונים ושומנים מסונתזים חדשים ביחידות תא HeLa יחיד. בנוסף, מודל 2PEF יכול לזהות אותות אוטופלואורסצנטיים של ניקוטין-אמיד אדנין די-נוקלאוטיד (NADH) ופלבין באופן נטול תוויות. מערכת ההדמיה המתוארת כאן תואמת הן למודלים במבחנה והן למודלים in vivo , שהיא גמישה לניסויים שונים. זרימת העבודה הכללית של פרוטוקול זה כוללת תרבית תאים, הכנת מדיה לתרבית, סנכרון תאים, קיבוע תאים והדמיית דגימה בשיטות DO-SRS ו-2PEF.

התוספת של עודפי AAA בריכוזים של פי 15 למדיה של תרבית תאים המכילה 50% D2O יצרה רצועות C-D ראמאן נפרדות של ליפידים וחלבונים מסונתזים חדשים בתאי HeLa (איור 2B). ניסויים קודמים בוצעו עם רמות ריכוז שונות, כגון 2x ו- 5x, ולמרות שהנתונים אינם מוצגים, ריכוז 15x יצר את רצועות C-D Raman המובהקות ביותר של שומנים וחלבונים מסונתזים חדשים. באופן ספציפי, על ידי חקירת טיפות שומנים (LDs), שמנו לב שגם 15x Phe וגם 15x Tryp גרמו לאותות ליפידים וחלבונים מסונתזים חדשים ב-2,143 cm-1 ו-2,172 cm-1</s...

אנו מציגים פרוטוקול להדמיה ישירה של פעילויות מטבוליות בתאים המווסתים על ידי חומצות אמינו באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (DO-SRS) המשולב במיקרוסקופ פלואורסצנטי עירור של שני פוטונים (2PEF).

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

אנו מציגים טכניקת הדמיה חדשה עם יכולת ללא תוויות, ספציפיות כימית גבוהה ורזולוציה תת-תאית. המתודולוגיה שלנו יכולה לענות על שאלות על תפקוד מטבולי לקוי בהזדקנות ומחלות כגון סרטן דימות ראמאן, יחד עם שני פוטונים פלואורסצנטיים ויצירת הרמוניה שנייה, מציעה טכנולוגיית הדמיה לא הרסנית ונטולת תוויות הדורשת הכנת דגימה מינימלית ומשיגה רזולוציה תת-תאית גבוהה מבלי לפגוע בדגימת התא. מספר שיטות הדמיה מופעלות כחלק מהפלטפורמה שלנו.אנשים צריכים לעקוב אחר הפרוטוקול שלנו כמיטב יכולתם, ולציין כי המערכת שלנו בנויה בבית. לאורך הדרך הם צריכים לפתח תרגול משלהם כדי להבטיח הצלחה. בשני צינורות נפרדים להתחיל על ידי מדידה וערבוב 10 מיליגרם של אבקת DMEM עם 4.7 מיליליטר של מים מזוקקים כפול בצינור חרוטי 15 מ"ל.מערבלים היטב והופכים את הצינור כדי להבטיח שהפתרון מעורבב היטב. עבור שני הצינורות, הוסף 4.7 מ"ל של תחמוצת דאוטריום, 0.5 מ"ל של FBS, ו 0.1 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין לפני מערבול והיפוך הצינור. לאחר מכן, להוסיף עודף פנילאלנין לצינור אחד עודף אבקת טריפטופן לצינור השני ולערבב שוב.הוסף מתיונין ותראונין במינון של 30 ו-95 מ"ג למ"ל, בהתאמה, לשני הצינורות, ולאחר מכן מערבל והופך את הצינור. לאחר מכן, סנן את המדיה מוכנה עם מסנן מזרק 25 מ"מ עם מסננים 0.22 מיקרומטר. אטם את כל המדיה הכיל צינורות חרוטיים עם Parafilm.אחסנו מדיה מוכנה בארבע מעלות צלזיוס. שמור על תאי ריפוי בבקבוק תרבית באמצעות DMEM סטנדרטי בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין וסטרפטומיצין. תרבית משנה של תאי המרפא ביחס פיצול של אחד עד 10 עד הגעה ל-80% או יותר כדאיות התא.לפני זריעת התאים, השקיעו את פולי-די-ליזין מעוקר, מצופה למינין, מחליקי כיסוי עגולים בקוטר 12 מ"מ באתנול 70%. יבשו את החלקות הכיסוי באמצעות מגבונים ללא מוך, והניחו את החלקות הכיסוי הנקיות בבארות המתאימות של הצלחת. שטפו את התאים פעם אחת עם PBS ללא יוני מגנזיום וסידן.הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק את תאי ההיצמדות מהבקבוק ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלוש דקות. לאחר מכן הוסף DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין וסטרפטומיצין לתאים. פיפטה עדינה למעלה ולמטה.לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים DMEM בתוספת 0.5% FBS ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין. ספרו את תאי הכתם הכחול טריפאן באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ אור וזרעו בצפיפות של פי שניים 10 עד התאים החמישיים לכל באר של צלחת 24 באר.פזרו את התאים באופן שווה על ידי ניעור הצלחת בעדינות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר שמונה שעות, החליפו את אמצעי התרבית הישנים בתחמוצת דאוטריום 50% ועודף פנילאלנין או 50% תחמוצת דאוטריום ועודף טריפטופן.להחזיר את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך 36 שעות. כעת הכינו שקופיות מיקרוסקופ עם חללי הדמיה בקוטר תשעה מ"מ. מניחים 15 מיקרוליטר של PBS, בתוספת יוני סידן ומגנזיום ושוטפים את התאים באותה תמיסה.הוסיפו 0.5 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד נטולת מתנול 4% והשאירו את הצלחת מתחת למכסה המנוע למשך 15 דקות. שאפו את תמיסת הפרפורמאלדהיד ושטפו אותה עם PBS, בתוספת סידן ומגנזיום ברזל פעמיים. הוסיפו מ"ל אחד של PBS, בתוספת יוני סידן ומגנזיום לכל באר.השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להסיר בזהירות את החלקות הכיסוי מכל באר. הפוך אותם והנח את התא המכיל צד על חללי ההדמיה במגע עם PBS. אטמו את השכבה החיצונית של חלקת הכיסוי עם מרווח ההדמיה באמצעות לק שקוף.יש להעמיס את הדגימה הביולוגית על מחזיק הדגימה ישירות מתחת לעדשת המטרה. לאחר מכן לחץ על סמל המצלמה בתוכנה כדי להפעיל את מצלמת הווידאו ולהתאים את מישור המיקוד כדי לזהות אזור עניין עם עדשת האובייקט 50X. עבור לעדשה האובייקטיבית 100X.לחץ על סמל העצירה כדי לכבות את מצלמת הווידאו. לאחר מכן בחר סורג של 1, 800 שורות למ"מ ולהגדיר את טווח הרכישה מ 400 ל 3, 150 ס"מ הפוך. לבסוף, הגדר את זמן הרכישה ל -90 שניות, את ההצטברות לשלוש ואת הבינינג לארבע עבור הרעש הקטן ביותר ואת הספקטרום המדויק ביותר.לחץ על התחל כדי לחמם את הלייזר. התחל בלחיצה על המתג הראשי של תיבת הבקרה IX3CBH למצב מופעל, ואחריו על המתג הראשי של בקר לוח המגע. לאחר מכן הפעל את המתג הראשי של מתאם החשמל של ספק הכוח עבור שלט הלייזר LDOBIS6 המחובר למסרק הלייזר הראשי FV31S.הפעל גם את מתאם החשמל של ספק הכוח המרוחק לייזר LDOBIS6 המחובר למסרק הלייזר המשולב FV31S. לאחר מכן, לחץ על המתגים הראשיים של גלאי פוטודיודה SI ומגבר נעילה מופעל. הגדר את IR הלייזר על 1031 ננומטר הגדר את מערכת פיקו אמרלד באורך גל בין 720 ל 990 ננומטר.הרכיבו את הדגימה על השמן והניחו טיפת מים גדולה על שקופית המיקרוסקופ שבה הדגימה קבועה. בחר גודל סריקה כ- 512 על 512 פיקסלים. רכוש ושמור את התמונות כאולימפוס.קובץ גרפי OIR. לאחר הגדרת האות ל- 862.0, רכוש תמונת רקע ושמור אותה. התאם את זמן השהייה לשמונה מיקרו-שניות לפיקסל ואת גודל הפיקסלים ל- 512 על 512 פיקסלים.הגדר את פרמטר עוצמת תריס הלייזר ל- 150 מילי-וואט לשחזור תמונה תלת-ממדית, כוונן את אובדן הרמאן המגורה ל-2, 850 ס"מ הופכי. לאחר זיהוי התאים הבודדים הרצויים, רשום את הלייזר כדי לסרוק ממישור המיקוד העליון כדי לזהות את השכבות העליונות והתחתונות של תאים אלה. נעשה שימוש בפיזור ראמאן של תחמוצת דאוטריום (Deuterium oxide), שנבדק ומגורה כדי להמחיש את ההתפלגות המרחבית של אותות CD על תאים בודדים.תאי הבקרה הציגו פסי CD, שומנים וחלבונים מתונים. עם זאת, הטריפ של 15 x v ו- 15 x הציג איסורים חזקים יותר על שומנים ב- CD וחלבון. ניתוח כמותי הצביע על כך שעודף חומצות אמינו ארומטיות עשוי להגביר את סינתזת השומנים ב-10% עד 17%, אך להפחית את ויסות סינתזת החלבונים ב-10%ניתוח מטרי של חומצות אמינו ארומטיות התאים שטופלו הראה עלייה של 50% בפלבין חלקי פלבין בתוספת NADH ועלייה של 10% בשומנים בלתי רוויים חלקי שומנים רוויים.הקרנת נפח טיפות השומנים התלת-ממדית של ראמאן המגורה בתאי מרפא תחת בקרה ותנאי חומצות אמינו ארומטיות עודפות מוצגים. ניתוחים כמותיים של טיפות שומנים תלת-ממדיות הראו עלייה בספירה, אך ירידה בגודל חומצות אמינו ארומטיות שטופלו בתאים בהשוואה לקבוצת הביקורת. יש למטב את פרמטרי ההדמיה של ראמאן ושני פוטונים פלואורסצנטיים מדגימה אחת לשנייה כדי להבטיח את איכות ההדמיה הטובה ביותר.אנשים יכולים לשדך את המערכת שלנו עם הדור ההרמוני השני כדי לחקור את מבנה הקולגן, אשר מבהיר שינויים מטבוליים מוקדמים בהזדקנות ובמחלות, ולהבין את ההתקדמות של ניוון עצבי או סרטן. הטכנולוגיה שלנו היא הראשונה מסוגה הממחישה סינתזת שומנים וחלבונים במערכות ביולוגיות ברזולוציה תת-תאית גבוהה. הטכנולוגיה יכולה להיות מתורגמת גם למרפאה לגילוי מחלות לא פולשניות.

bioorthogonal-chemical-imaging-cell-metabolism-regulated-aromatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

13 C-איזוטופ תיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מטבוליזם התא מרכזי בסוגים שונים של מיקרואורגניזמים. אחרי תאים בתרבית כבר עם מצע שכותרתו ספציפיים, GC-MS המדידה יכול לחשוף מסלולים מטבוליים פונקציונלי המבוסס על דפוסי תיוג ייחודי חומצות אמינו proteinogenic.

מסלול אישור דיסקברי מטבולית ודרך 13 C-תיוג של חומצות אמינו Proteinogenic

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

פרוטוקול זה מציג בדיקת ספיגת חומצות אמינו עם תווית רדיו, אשר שימושית להערכת צריכת חומצות אמינו בתאים ראשוניים או בעצמות מבודדות.

הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ובצירי עצם מבודדים

בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת מודדת את קצב צריכת החמצן ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, המתאים לייצור אדנוזין טריפוספט מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, באמצעות חיישני pH וחמצן. כתב היד מסביר שיטה להבנת מצב האנרגיה של אוסטאובלסטים ואפיון ופרשנות של המצב הביו-אנרגטי התאי.

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

פרוטוקול זה מתאר הדמיה וניתוח פלואורסצנטי של קואנזימים מטבוליים אנדוגני, אדנין ניקוטינאמיד מופחת (פוספט) dinucleotide (NAD(P)H), ו flavin adenine dinucleotide מחומצן (FAD). הדמיה אוטופלואורסצנטית של NAD(P)H ו-FAD מספקת שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת חילוף החומרים התאי.

הדמיית זרם אוטומטי להערכת חילוף החומרים התאי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהכלאה פוטותרמית פוטותרמית-פלואורסצנטית באתרו (OPTIR-FISH), הידועה גם בשם MID-INFRARED PHOTOTHERMAL-FISH (MIP-FISH), כדי לזהות תאים בודדים ולהבין את חילוף החומרים שלהם. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב עבור יישומים מגוונים, כולל מיפוי מטבוליזם תאי עם רזולוציה של תא יחיד.

הכלאה פוטותרמית אופטית אינפרא אדום-פלואורסצנטי באתרו (OPTIR-FISH)

תוך שימוש בפלטפורמה רב-מודאלית המשלבת שיטות הדמיה אופטיות ללא תוויות, פיתחנו פרוטוקול להדמיה וכימות של דינמיקה תאית וחילוף חומרים. באמצעות הדמיה באמצעות פלואורסצנציה רב-פוטונית, דור הרמוני שני ומיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה, אנו יכולים ליצור סקירה הוליסטית של הסביבה התאית והמולקולרית.

פלטפורמת הדמיה אופטית מולטי-מודאלית לחקר חילוף החומרים התאי

פרוטוקול זה משלב מערכת ביו-ריאקטור שנבנתה בהתאמה אישית עם ספקטרוסקופיה של ¹³C NMR היפרפולרית כדי למדוד מטבוליזם פירובט בזמן אמת בתאים חיים, ולשפר את יכולת השחזור והדיוק הקינטי עבור מחקרים מטבוליים ויישומי סינון תרופות.

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי 13C

Non-הרסני להדמיה נפח יכולה להיות מושגת רק על ידי טכניקות טומוגרפית, מתוכם היעילה ביותר היא טומוגרפיה רנטגן מיקרו ממוחשבת (CT).

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

למד הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות. השיטה משלבת מיקרוסקופיית Raman עם פלואורסצנציה דו-פוטונית לרזולוציה תת-תאית ללא סימון.

הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות

גלה סרטונים נוספים