Name: בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: למדו לבודד תאי אנדותל מווריד ספנוס אנושי ולגדלם תחת לחץ גזירה ומתיחה מחזורית. פרוטוקול זה מאפשר חקר תגובות תאיות למאמצים מכניים ומנגנוני כשל שתלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JEK נתמך על ידי מענקים מ- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ו- 2013/17368-0] ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ו- 309179/2013-0). AAM נתמך על ידי מענקים של Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (אוניברסלי - 407911/2021-9).

<ol><li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery%3A+the+intimal+hyperplastic+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li>
<li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+responses+to+mechanical+stress%3A+where+is+the+mechanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li>
<li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li>
<li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-%CE%BAB+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133(2020).</li>
<li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li>
<li>Girão-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493(2021).</li>
<li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li>
<li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery%3A+an+exploratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+II.+Representative+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li>
<li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413(2020).</li>
<li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt%2FeNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li>
<li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li>
<li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes%2C+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+%28KLF2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li>
<li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li>
<li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype%3A+implications+for+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

מקטע הוורידים הספנוס צריך להיות לפחות 2 ס"מ כדי לבודד בהצלחה hSVECs. מקטעים קטנים קשים לטיפול וקושרים את קצות כלי הדם כדי לשמור על תמיסת הקולגנאז לבידוד התאים. שטח הפנים המואר המצומצם אינו מניב מספיק תאים כדי להרחיב את התרבית. כדי למזער את הסיכון של זיהום עם שאינם ECs, מניפולציה של קטע הווריד saphenous צריך להיות עדין מאוד במהלך ההליך כולו. חשוב להיות זהירים בעת החדרת קצות פיפטה לתוך משטחים לומינליים כדי להסיר דם במהלך המבוא של פתרון collagenase. החשיפה לתמיסת אנזים צריכה להיות מבוקרת היטב (לא יותר מ 1 שעות) כדי להפחית א...

תפקוד לקוי של תאי אנדותל (EC) הוא שחקן מפתח בכשל השתלת ורידים ספניים 1,2,3,4. העלייה המתמשכת של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית גורמת לפנוטיפ פרו-דלקתי של תאי אנדותל ורידים ספנוסיים אנושיים (hSVECs)3,4,5,6. המסלולים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם מובנים במלואם, ופרוטוקולים סטנדרטיים למחקרי מבחנה עשויים למנף את המאמצים לתובנות חדשות בתחום. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד, אפיון והרחבה של hSVECs וכיצד לחשוף אותם לרמות משתנות של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית, המחקה את התנאים ההמודינמיים הורידיים והעורקים.
hSVECs מבודדים על ידי דגירה של collagenase וניתן להשתמש בהם עד מעבר 8. פרוטוקול זה דורש פחות מניפולציה של כלי הדם בהשוואה לפרוטוקולים הזמינים האחרים7, אשר מפחית זיהום עם תאי שריר חלק ופיברובלסטים. מצד שני, זה דורש קטע כלי גדול יותר של לפחות 2 ס"מ כדי לקבל מיצוי EC יעיל. בספרות, דווח כי ECs מכלי גדול ניתן להשיג גם על ידי הסרה מכנית 7,8. למרות יעילותה, לגישה הפיזית יש את החסרונות של תפוקת EC נמוכה וזיהום פיברובלסטים גבוה יותר. כדי להגביר את הטוהר, נדרשים צעדים נוספים באמצעות חרוזים מגנטיים או מיון תאים, מה שמגדיל את עלות הפרוטוקול עקב רכישת חרוזים ונוגדנים 7,8. לשיטה האנזימטית יש תוצאות מהירות וטובות יותר לגבי טוהר EC וכדאיות 7,8.
ECs הנפוצים ביותר לחקר תפקוד לקוי של האנדותל הם תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). ידוע כי הפנוטיפ EC משתנה במיטות כלי דם שונות, וחיוני לפתח שיטות המייצגות את כלי השיט תחת חקירה 9,10. מבחינה זו, קביעת פרוטוקול לבידוד hSVEC ותרבית שלו תחת לחץ מכני היא כלי רב ערך להבנת התרומה של תפקוד לקוי של hSVEC במחלת השתלת ורידים.

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין-0.02% תמיסת EDTA</td><td>גיבקו</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>15 ומיקרו I 0.4 לואר&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole, דילקטט (DAPI)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>תחנת טעינה שווה ערך של 6 בארות של 25 מ"מ&nbsp;</td><td>תאגיד פלקסל אינטרנשיונל</td><td>LS-3000B25. VJW</td><td></td></tr><tr><td>8 בארות תא שקופיות עם באר נשלפת תרמו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית (קרחון)</td> <td>Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>גיליון אקרילי 1 ס"מ עובי</td><td>פרספקס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD31 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab24590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31, נוגדן FITC</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>MHCD3101</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-VE-cadherin</td><td>איתות תאים</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>צלחות ביופלקס קולגן I</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>BF3001C</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>תפר כותנה EP 3.5 15 x 45 ס"מ</td><td>Brasuture</td><td>AP524</td><td></td></tr><tr><td>Cyclophilin קדימה פריימר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom פריימר</td> הפוך ציקלופילין מעוצב <td></td></tr><tr><td></td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>מעוצב</td><td></td>בהתאמה אישית</tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 בינוני בסיסי</td><td>Lonza</td><td>CC3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 תוספי SingleQuots</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2657-029</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מתח Flexcell FX-5000</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX-5000T</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount מדיום הרכבה מימי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הפרין מרירית מעי חזיר 5000 IU/mL</td><td>Blau Farmac&ecirc; utica</td><td>מק"ט 68027</td><td></td></tr><tr><td>מערכת משאבת איבידי (משאבה + יחידת נוזל)</td> <td>Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr><tr><td>KLF2 פריימר קדימה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>פריימר הפוך KLF2 בעיצוב</td><td></td>אישי</tr><tr><td></td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>בעיצוב</td><td></td>מותאם אישית</tr><tr><td>KLF4 פריימר קדימה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>פריימר הפוך KLF4 בעיצוב</td><td></td>מותאם</tr> אישית <tr><td></td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>מעוצב</td><td></td>בהתאמה אישית</tr><tr><td>NOA 280 מנתח תחמוצת החנקן</td><td>Sievers מכשירים</td><td>NOA-280i-1</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 פריימר קדימה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>מעוצב</td><td></td>בהתאמה אישית</tr><tr><td>NOS3 פריימר הפוך</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>מעוצב</td><td></td>בהתאמה אישית</tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>סט זלוף 15 ס"מ, ID 1.6 מ"מ, אדום, מיכלי 10 מ"ל</td><td>Ibidi</td><td>10962</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered מלח (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן יודיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>QuanTitec SYBR ערכת PCR ירוקה</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת QuantStudio 12K flex&nbsp;</td><td>אפלייד ביוסיסטמס</td><td>4471087</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיקרו RNeasy&nbsp;</td><td>Quiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות (24 מ"מ x 60 מ"מ)</td> <td>Knittel Glass</td><td>VD12460Y1D.01</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ניטריט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31443</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV מערכת סינתזה של גדיל ראשון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091200</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן 0.4%</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג II מ- Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

ניתוח השתלת מעקף עורקים כליליים (CABG) הוא הליך לחידוש שריר הלב האיסכמי. וריד ספנוס נשאר בשימוש כצינור CABG למרות הפטנט המופחת לטווח ארוך בהשוואה לצינורות עורקים. העלייה הפתאומית של מתח המודינמי הקשור לעורק השתל גורמת לנזק לכלי הדם, במיוחד לאנדותל, שעשוי להשפיע על הפטנט הנמוך של שתל הווריד הספנוס (SVG). במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, האפיון וההרחבה של תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). תאים שבודדו על ידי עיכול collagenase מציגים את המורפולוגיה הטיפוסית של אבן מרוצפת ומבטאים סמני תאי אנדותל CD31 ו- VE-cadherin. כדי להעריך את השפעת הלחץ המכאני, נעשה שימוש בפרוטוקולים במחקר זה כדי לחקור את שני הגירויים הפיזיים העיקריים, לחץ גזירה ומתיחה, על SVGs עורקיים. hSVECs מתורבתים בתא זרימה מקביל של לוחות כדי לייצר לחץ גזירה, ומראים יישור בכיוון הזרימה וביטוי מוגבר של KLF2, KLF4 ו- NOS3. hSVECs ניתן גם לתרבית בקרום סיליקון המאפשר מתיחה תאית מבוקרת המחקה מתיחה ורידית (נמוכה) ועורקית (גבוהה). תבנית F-אקטין של תאי אנדותל והפרשת תחמוצת החנקן (NO) מווסתים בהתאם על ידי מתיחה עורקית. לסיכום, אנו מציגים שיטה מפורטת לבידוד hSVECs כדי לחקור את ההשפעה של לחץ מכני המודינמי על פנוטיפ אנדותל.

בדרך כלל, ECs דבק ניתן לראות 3-4 ימים לאחר החילוץ. hSVECs יוצרים בתחילה אשכולות של תאים ומציגים מורפולוגיה טיפוסית של "אבן מרוצפת" (איור 1B). הם מבטאים את סמני EC CD31 (איור 1C,D) ו-VE-cadherin (איור 1D). hSVECs יכולים להיות מופצים בקלות על צלחת תרבית תאים מטופלת ללא ציפוי, והם שומרים על פנוטיפ האנדותל בתרבית עד שמונה מעברים.
hSVECs, כאשר הם מתורבתים תחת לחץ גזירה, מתיישרים בכיוון הזרימה ...

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). אנו מספקים גם שיטות מפורטות לייצור לחץ גזירה ומתיחה כדי לחקור לחץ מכני ב- hSVECs.

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

הווריד הספנוס נחשף לפתע לתנאי עורקים לאחר ניתוח מעקפים של העורקים הכליליים. הבנת תגובת ההסתגלות שלו ללחץ מכני עשויה לסייע בתכנון כלים טיפוליים למניעת כשל השתלת ורידים. פרוטוקול בידוד תאי אנדותל זה הוא פשוט מאוד ודורש רק דגירה עם collagenase.עם מניפולציה מינימלית של כלי הדם, התוצאה היא זיהום מופחת עם תאי שריר חלקים ופיברובלסטים. הפרוטוקול לבידוד SVECs אנושיים ותרבית שלהם תחת לחץ גזירה ומתיחה מחזורית חיוני להבנת תרומתם של כוחות מכניים בתפקוד לקוי של תאי אנדותל הקשורים לכשל השתלת ורידים ספנוסיים. תרבית תאי אנדותל קודמת היא תובענית מאוד במונחים של תוספי מדיה תאית.חובה להוסיף גורמי גדילה כדי לבודד בהצלחה תרבות, ה- SVEC האנושיים. לבידוד תאי אנדותל ראשוניים של ורידים ספניים אנושיים או SVEC אנושיים, יש לאסוף לפחות מקטע ורידים ספניים באורך שניים עד שלושה סנטימטרים. עובדים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי, מעבירים את מקטע הוורידים לצלחת פטרי מלאה PBS שחומם מראש.כדי להסיר את כל הדם מתוך לומן, הכנס קצה פיפטה מחובר פיפטה מלא PBS לתוך קצה אחד של הווריד בעדינות לשטוף אותו. שוטפים אותו עד שזרימת הכביסה הופכת ברורה לחלוטין. ואז לסגור קצה אחד של הווריד עם תפר כותנה סטרילי.בזהירות למלא את הכלי עם מיליגרם אחד לכל מיליליטר collagenase סוג 2 פתרון ולסגור את הקצה השני של הכלי עם תפר כותנה. לדגור על הכלי עם תמיסת collagenase באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן חותכים קצה אחד של הכלי מעל צינור של 15 מיליליטר כדי לאסוף את תמיסת הקולגנאז לפני חיתוך הקצה השני.שטפו את המשטח הלומינלי במיליליטר אחד או שניים של PBS כדי לאסוף את כל תאי האנדותל המנותקים בתוך הצינור עם קולגן. צנטריפוגג את הצינור ב 400G בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את גלולת התא בשלושה עד ארבעה מיליליטרים של תווך תאי אנדותל שלם המכיל תמיסת הפרין נוספת.מקציפים את התאים בצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ המצופה מראש בג'לטין במשקל 3% לכל נפח. לדגור על התאים באטמוספירה לחה במשך ארבעה ימים מבלי לשנות את התווך. לאחר מכן, לשנות את המדיום כל יומיים מבלי להוסיף את תוספת הפרין.בדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שתאי הדם האדומים הוסרו. לאחר יום עד ארבעה ימים לאחר החילוץ, בהתאם לגודל וקוטר של קטע הווריד, לדמיין את SVECs האנושי על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להעריך את מידת המפגש ואת המורפולוגיה מרוצפת שלהם. המשך לשנות את המדיה כל יומיים עד שהתאים מגיעים למפגש של 70% עד 80%.מצפים את תא הזרימה בג'לטין במשקל 0.1% לכל נפח ודגרים במשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לאזן את היחידה הפלואידית ואת מערכת הזילוח הסטרילית בעלת מאגרים של 10 מילימטר, דגרו עליהם למשך הלילה באטמוספירה לחה. עבור ניסוי עקת הגזירה, זרע 200, 000 תאי אנדותל מרחפים ב -100 מיקרוליטר של תווך תרבית לתוך תא זרימה מצופה ג'לטין.לצורך הצמדת התאים למשטח התרבית, דוגרים על התאים במשך ארבע שעות. מניחים את ערכת הזילוח על היחידה הפלואידית. מלאו את המאגרים ואת ערכת הזילוח בכ-12 מיליליטר של תווך תאי אנדותל שלמים שחוממו מראש.הסר בועות אוויר מהזילוח שנקבע כדי לאזן את רמת שני המאגרים בחמישה מיליליטר. הניחו את יחידת הנוזל על מערכת הזילוח המותקנת ללא החלקת התא באינקובטור וחברו את כבל החשמל שלה למשאבה המווסתת על ידי מחשב. על ידי הפעלת הפרוטוקול שהוגדר מראש בתוכנת בקרת המשאבה, הסר את כל בועות האוויר מהמאגרים וממערך הזילוח.קח את היחידה הנוזלית עם זילוח רכוב להגדיר מכסה המנוע זרימה למינרית ולחבר את שקופיות שיש monolayer תא מפגש. לאחר הנחת היחידה כולה עם המגלשות באינקובטור, חבר את כבל החשמל שלה למשאבה. בתוכנת בקרת המשאבה, התאם את הגדרת היחידה הפלוידית על ידי בחירת סוג השקופית והגדרת צמיגות המדיום.בפרמטרים של זרימה, הזן את ערך מתח הגזירה והגדר את משך המחזור ואת סוג הזרימה. לאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה כדי להתחיל את הניסוי. זכור לתחזק את השקופית עם תאים המטופלים באותה מדיה ללא חשיפה לזרימה כפקדים סטטיים.יש למרוח חומר סיכה על בסיס סיליקון על החלק העליון והדפנות של תחנת ההעמסה השווה בקוטר 25 מ"מ עם 6 בארות. זרע 400, 000 תאים מרחפים בשלושה מיליליטר לכל באר של 6 צלחות תרבית בעלות תחתית גמישה המצופה בקולגן אחד. דוגרים על התאים באוויר לח עד שהם מגיעים למפגש של 100%.לפני תחילת פרוטוקול המתיחה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS שחומם מראש והוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום תרבית טרי לכל באר. הכנס את צלחת הבסיס עם כל תחנות הטעינה המשומנות באינקובטור וחבר כראוי את הצינור עם ציוד הבקר של מערכת הביוריאקטור המתיחה של תא המתח. חברו כל צלחת תרבית לאטם אדום אחד המסופק על ידי מערכת הביוריאקטורים.ואז לשים אותם לתוך צלחת הבסיס באינקובטור. הניחו את כל ארבע צלחות התרבית בצלחת הבסיס כדי להשיג ואקום ועומס מתיחה מתאימים. הפעל את ציוד הבקר ואת מערכת המחשב.פתח את תוכנת הבקרה FlexCell והגדר את משטר האימונים הרצוי כולל אחוז ההתארכות, צורת הגל, התדר והזמן. שמור את המשטר. הפעל את מערכת הוואקום, ולאחר מכן בחר את משטר האחסון ולחץ על התחל במסך המחשב כדי להפעיל את המתיחה.בדקו שקרום הסיליקון זז ומותח את התאים. ניתן היה לצפות בתאי האנדותל הדבוקים 4 עד 10 ימים לאחר החילוץ. בתחילה הם יוצרים צבירי תאים המציגים מורפולוגיה טיפוסית של אבני ריצוף.הם ביטאו את סמני EC CD31 ו- VE-cadherin. hSVECs כאשר תרבית תחת לחץ גזירה מיושרים בכיוון הזרימה. לחץ הגזירה של 20 דינים לסמ"ר במשך 72 שעות גורם לביטוי של גנים אופייניים למכנורגישים, KLF2, KLF4 ו-NOS3, מה שמצביע על יעילות גירוי הגזירה.תוצאת המתיחה המחזורית הייתה תלויה בעוצמה שהוחלה על SVEC האנושיים. תאים מתחת למתיחה נמוכה הראו דפוס F-actin קליפת המוח דומה לתאים סטטיים. ללא שינוי בשחרור תחמוצת החנקן למשך עד 72 שעות, רמות המתיחה העורקיות שלנו שיפצו את שלד האקטין לאחר 24 שעות והפחיתו את שחרור NO לאחר 72 שעות.מלבד מחקרי לחץ מכניים, חוקרים יכולים להשתמש בתאים המבודדים כדי לבצע שיטות שונות להרחבת הידע על תפקוד תאי אנדותל ותפקוד לקוי. בעקבות הפרוטוקול שהודגם, ניתן לחקור כל סוג אחר של תאי אנדותל תחת לחץ גזירה ומתיחה.

human-saphenous-vein-endothelial-cell-isolation-exposure-to

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

המנגנונים מובילים להתפתחות של היפרפלזיה אינטימה (IH) וכישלון שתל וריד עדיין לא נחקרו מספיק. מחקר זה מתאר מערכת ex vivo לינקב ורידי אדם תחת זרימה ולחץ מבוקרים. יתר על כן היעילות של חיזוק רשת חיצוני כדי להגביל את פיתוחה של י.ה. הוערך.

נוהל saphenous אדם הוורידים Ex Vivo זלוף וחיצוני חיזוק

ידוע כי רמות ודפוסים שונים של גזירה נוזלית מווסתים את ביטוי הגנים האנדותליים, הפנוטיפ והרגישות למחלות. אנו דנים בהרכבה ושימוש ב'טבעות גזירה': מודל המייצר דפוסי מתח גזירה חד-כיווניים ותקופתיים. טבעות גזירה פשוטות להרכבה, חסכוניות ויכולות לייצר תשואות תאים גבוהות.

האסיפה והיישום של &#39;טבעות Shear&#39;: מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר

כאן מוצג זרימת עבודה עבור ניתוח ביטוי תרבות, גנים של תאי אנדותל תחת גזירה נוזלים. כלול הוא סידור הפיזי בו זמנית דיור וניטור צ'יימברס מרובים זרימה בסביבה מבוקרת, את השימוש RNA אקסוגני עזר עבור ה-PCR כמותי.

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את חדר הזרימה המקביל של לוח הצלחת לשימוש בחקירת הפעלה בזמן אמת של ערוצי יונים מכניטיים הרגישים על ידי הטיית מתח.

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי יונים של תא בודד תחת לחץ הטיה מוגדר היטב

פרוטוקול זה מתאר שיטת ציפוי להגבלת צמיחת תאי אנדותל לאזור מסוים של צלחת 6 בארות ליישום לחץ גזירה באמצעות מודל שייקר מסלולית.

פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים

כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

כאן פיתחנו מודל של איבר על-שבב של תאי שריר חלקים באבי העורקים כדי לשכפל את הזן הביומכני in vivo של תאי שריר חלקים בדופן אבי העורקים האנושי.

בניית מודל של איבר-על-שבב של תא שריר חלק של אבי העורקים לשחזור זן ביומכני בדופן אבי העורקים

מתואר כאן תהליך עבודה פשוט להבדיל בין תאי אנדותל לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ואחריו פרוטוקול מפורט לגירוי המכני שלהם. זה מאפשר לחקור את המכנוביולוגיה ההתפתחותית של תאי אנדותל. גישה זו תואמת לבדיקות במורד הזרם של תאים חיים שנאספו משבב התרבית לאחר גירוי מכני.

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

למדו לבודד תאי אנדותל מווריד ספנוס אנושי ולגדלם תחת לחץ גזירה ומתיחה מחזורית. פרוטוקול זה מאפשר חקר תגובות תאיות למאמצים מכניים ומנגנוני כשל שתלים.

בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה

גלה סרטונים נוספים