סטנדרטיזציה של בדיקת חרוזים ציטומטרית המבוססת על נוגדנים לחלמון ביצה

בין טכניקות החיסון שמטרתן לאבחן מחלות, בדיקת החרוזים הציטומטרית התפתחה כגישה רגישה ואמינה ביותר, המנתחת אלפי חלקיקים בבדיקה אחת. הדיוק הגבוה של ציטומטריית זרימה, יחד עם העלות הנמוכה של חרוזי לטקס, הופכים את הטכניקה שלנו לישימה לניתוח כלים חיסוניים, כגון נוגדנים ואנטיגנים. נוגדני IgY הם בעלי עלות נמוכה, והיתרונות האתיים בייצורם, ויכולים לשמש ככלי זיהוי למחלות נדירות.

התחילו בטבילת הביצים הטריות או בנות ארבעת הימים, מהשושלת הלבנה Gallus gallus deckle, בתמיסה מדוללת של 0.2% של נתרן היפוכלוריט. שטפו אותם במהירות תחת מים זורמים ונגבו בעדינות. שוברים את הביצה בזהירות, מפרידים את החלמון מהלבן בעזרת מפריד חלמונים.

והסר את עודפי הלבן בעזרת נייר סינון. מנקבים את החלמון, ואוספים את חלקו הפנימי לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. אחסנו את החלמון בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות לפני השימוש.

לאחר הפשרת החלמון המאוחסן, מדללים אותו ביחס של אחד עד 10 במילימולר PBS. התאימו את רמת החומציות של התמיסה לחמש, עם חומצה הידרוכלורית רגילה אחת, ודגרו על התמיסה בארבע מעלות צלזיוס למשך שש עד 24 שעות. צנטריפוגו את התמיסה ב-3000 גרם למשך 40 דקות, וסננו את הסופרנאטנט המשוחזר באמצעות מסנן תאית 0.7 מילימטר, לפני התאמת ה-pH של הסופרנאטנט לחמישה.

מוסיפים חומצה קפרילית לריכוז סופי של 8.7% תוך ערבוב מתמיד, למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה של הדגימות במשך 15 דקות, להפריד את supernatant מן החומר המושקע. התאם מחדש את ה- pH של התמיסה ל- 7.4 באמצעות נתרן הידרוקסידי מולרי אחד.

ולכמת את הנוגדנים באמצעות בדיקת ברדפורד, לפני אחסונם במינוס 20 מעלות צלזיוס. הוסף 21 מיקרוליטר של EDC, ו 21 מיקרוליטר של NHS, ל 21 מיקרוליטר של חרוזי לטקס. והתכוונן לנפח סופי של 2.1 מיליליטר, עם PBS מסונן של 10 מילימולרי.

לדגור על התמיסה ב 22 מעלות צלזיוס, עם רעידות מהירות, במשך שלוש שעות. הוסף את נוגדן הלכידה שחולץ בעבר, IgY PfHRP2, למיקרו צינורות שונים המכילים 100 מיקרוליטר של פתרון זה. ולדגור שוב במשך 16 שעות.

לאחר צנטריפוגה של הדגימות והשלכת הסופרנאטנטים, שטפו את חרוזי הלטקס פעמיים עם 500 מיקרוליטר של PBS 10 מילימולרי מסונן, באמצעות מחזורי צנטריפוגה ותרחיף. לחסימת החרוזים, השהה מחדש את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ חוסם, ופעל באותו הליך שהוצג קודם לכן כדי לדגור עליו במשך שעתיים. לאחר שטיפת החרוזים עם PBS, השהה אותם שוב במאגר PBS של 10 מילימולרי.

הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן פלואורסצנטי נגד עוף, מדולל לאחד עד 2000 בתערובת 10 מילימולרית של PBS ו- BSA, לכל מיקרו. לדגור על הדגימות בחושך במשך 30 דקות. לאחר שטיפת החרוזים, להשעות אותם שוב עם 250 מיקרוליטר של PBS מסונן 10 מילימולרי.

קבע את גבול הזיהוי על ידי הפצת 100 מיקרוליטר של הכנת החרוזים החסומים, לתוך צינורות המכילים כמויות שונות של חלבון רקומביננטי מדולל PfHRP2 במשולש. לדגור על תמיסות החרוזים עם החלבון ב 22 מעלות צלזיוס, עם רעידות מהירות, במשך שעה אחת. לשטוף את החרוזים עם 500 מיקרוליטר של PBS מסונן 10 מילימולרי, עם צנטריפוגה, כפי שהודגם בעבר.

לאחר השלכת הסופרנאטנט יש להוסיף שני מיקרוגרם של נוגדן IgG עכברי כנגד החלבון הרקומביננטי, מדולל ב-PBS ו-BSA של 10 מילימולר לכל דגימה, ולבצע את אותו הליך לדגירה. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן פלואורסצנטי מדולל נגד עכבר לכל דגימה. לאחר הדגירה, להשעות מחדש את הדגימה ב 250 מיקרוליטר של PBS מסונן 10 מילימולרי.

הפעל את המחשב ואת ציטומטר הזרימה והמתן מספר דקות עד שהציוד יתחבר למחשב. לחץ על תוכנת הציטומטריה המותקנת במחשב והיכנס אליה. מסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer, ואחריו Fluidics Startup, Cleaning Modes ו-SIT Flush.

הגדירו את אסטרטגיית ה-gating בהתבסס על המאפיינים המורפומטריים והפלואורסצנטיים של חלקיק הבקרה השלילי. כדי לקבוע את מורפומטריית התא, בחר גרפיקת התוויית נקודה לניתוח פרמטרי פיזור קדימה A באמצעות פיזור צד A. קבע את התאים הבודדים לפי פיזור צד באמצעות גרפיקת התוויית נקודה לניתוח פיזור צד W בציר Y, ופיזור צד H בציר X. ולקבוע את התאים הבודדים על ידי פיזור קדימה, באמצעות גרפיקת התוויית התוויית נקודות, לניתוח פיזור W קדימה בציר Y, ופיזור קדימה H בציר X.

לניתוח פלואורסצנטיות, בחר תרשימי תרשים נקודות FL1 באמצעות פיזור קדימה A. השתמש בשפופרת פוליסטירן עצורה המכילה דגימות ללא תווית, ודגימות שסומנו בעבר עם אלקסה פלואור 488 בצבע יחיד וערבב בזהירות את תכולת הצינור. חבר את הצינור לבדיקת ציטומטר הזרימה, ולחץ לחיצה שמאלית על Acquire. כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים, לחץ על פרמטרים, ובאפשרויות שלהלן, התאם את מתח הפיזור הקדמי ל -182 וולט, ואת מתח הפיזור הצדדי ל -236 וולט.

כדי להגדיר את הסף על ציטומטר, לחץ על סף, ובאפשרויות הבאות, להתאים את FSC ל 500 וולט. הגדר את שער הניתוח כדי לאפיין חלקיקים לפי גודל ומורכבות, כמו גם לבצע ניתוח תא בודד. הסר אוטופלואורסצנטיות על ידי ניתוח הדגימה נטולת הצבע המכילה רק את חרוזי הלטקס, והתאמת המתח של הגלאי FL1 FITC ל -332 וולט.

הגדר את שער ניתוח הפלואורסצנטיות בתבנית מרובעת, מהנקודה השלילית המוצגת בגרף תרשים תרשים הנקודות. לאחר התאמת הניתוחים המורפומטריים והפלואורסצנטיים, הגדר את המכשיר עבור 50, 000 אירועים ולחץ על הקלט. הפרופילים האלקטרופורטיים של נוגדן IgY PfHRP2, עקב ההפרדה באמצעות חומצה קפרילית, מוצגים כאן.

מנתון זה ניתן לראות כי הנוגדנים לפני ואחרי הפרדת החומצה הקפרילית הראו פרופילים אלקטרופורטיים דומים, עם רצועות אופייניות של 65 קילודלטון ו -27 קילודלטון, המתייחסות לשרשראות הקלות והכבדות של ה- IgY. בנוסף לאלה, ניתן לראות גם להקות אחרות, ככל הנראה בשל מבשר חלבון חלמון ביצה מסוג C terminal protein vitellogenin II. הערכת ריכוז רוויית הנוגדנים בחרוזי לטקס, חיונית לפיתוח בדיקה חיסונית עם החרוזים.

עקומה של אחוז הפלואורסצנטיות של ריכוזים שונים של נוגדנים, המצומדים לכל מיקרוליטר של חרוזי לטקס מסחריים בשימוש, מוצגת כאן. ככל שהריכוז עלה, גם ערכי האחוזים עלו, והגיעו לשני מיקרוגרם של ריכוז נוגדנים, מה שקבע אותו כריכוז הצימוד האופטימלי לאימונואסי האנטיגן המטרה. מגבלת הזיהוי נקבעה על ידי הערכת אחוז הפלואורסצנטיות של תגובתיות מהירות לטקס כנגד ריכוזים משתנים של חלבון rPfHRP2.

מאימונואסיית סנדוויץ', נצפה כי הפלואורסצנטיות הוגדלה מ -0.01 מיקרוגרם של חלבון PfHRP2, ומישורית ב -0.1 מיקרוגרם. לא היה הבדל משמעותי בפלואורסצנטיות באפס מיקרוגרם ו-0.01 מיקרוגרם. עם זאת, הבדל משמעותי בפלואורסצנטיות נצפה ב -0.01 מיקרוגרם, 0.1 מיקרוגרם ו -10 מיקרוגרם.

שלב הכביסה של פרוטוקול זה הוא קריטי כדי למנוע אובדן חרוזים. המד חייב להיות מוגדר היטב, כך שלא יהיו טעויות בתוצאה שהושגה. השלבים המתוארים כאן מייצגים סטנדרטיזציה חשובה, הנחוצה כדי להבטיח את אמינות בדיקות האבחון באמצעות חרוזי לטקס המוערכים באמצעות ציטומטריה מלאה.

לכן, מתודולוגיה זו היא חלופה למודלים הקלאסיים של בדיקת סנדוויץ'. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים שונים של בדיקות, ועשויה להתאים להתמודדות של מספר מולקולות על פני השטח של החרוזים, כמו גם לזיהוי של אנליטים שונים.