שיפור של Bacillus subtilis ספירת נבגים וניתוח תוויות בציטומטריית זרימה

מונה תאים של נבגי Bacillus subtilis בשיטות מסורתיות יכול להיות משימה מייגעת, שכן שיטות אלה יכולות להיות ידניות לחלוטין ואת הדיוקים שלהם בהתאם לניסיון של המפעיל. פרוטוקול זה מאפשר ספירה של נבגים רדומים ונובטים. בנוסף, הטכניקה גם מאפשרת לקבוע את אחוז ההתמודדות של חלבונים פלואורסצנטיים על פני השטח שלה.

בהינתן שלב ההגדרה הקיים בפרוטוקול זה, החזון מדגים עם המתקנים וההבנה הטכנית ופרטי הטיפול בביצוע זה. התחל על ידי כניסה לתוכנת הציטומטר. בסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer, ואחריו Fluidic Startup.

לאחר מכן בחרו 'מצבי ניקוי'. ולבסוף, ליזום SIT סומק. קח 50 מיקרוליטר של נבגי autoclave ודגר אותם עם ethidium bromide בגורם דילול של 0.05% נפח על ידי נפח במשך 30 דקות מוגן מפני אור.

שטפו את הנבגים שלוש פעמים עם PBS על ידי צנטריפוגה ב-17, 949 גרם למשך 10 דקות, והשהיה מחדש ב-PBS. לאחר מכן, להוסיף 10 מיקרוליטר של חרוזים בעקבות המלצות היצרן לדילול ולנתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה. הגדר את אסטרטגיית הגאטינג בהתבסס על המאפיינים המורפו-מטריים והפלואורסצנטיים של החלקיקים תוך שימוש בבקרה השלילית כנקודת ייחוס.

לאחר מכן מערבבים את הצינור בעדינות. חבר אותו לבדיקת ציטומטר הזרימה ולחץ על רכישה. כדי להגדיר את עוצמת הלייזר, עבור אל הכרטיסייה פרמטרים בחלון הציטומטר, התאם את הפיזור קדימה ל -375 ואת פיזור הצד ל -275.

לאחר מכן בחר את כרטיסיית הסף והגדר אותה ל- 500. לאחר מכן, לנתח את הדגימה ללא צבע המכיל רק נבגים כדי למנוע autofluorescence. בלשונית הפרמטרים, התאימו את המתחים של גלאי המסנן שלוש ל-603 ואת המתחים של גלאי המסנן חמש ל-538 כדי להבדיל בין אוכלוסיות שליליות וחיוביות באמצעות פלואורסצנטיות בבקרות.

לאחר מכן לחץ על פיצוי, והגדר את גלאי המסננים 5 על 3 היסט הגדרה לאחד. כדי להגדיר את ההתקן לרכישה, בחר ניסוי, בחר את פריסת הניסוי והגדר את הרכישה ל- 30, 000 אירועים. לאחר התאמת הפרמטרים, רכוש נתונים עבור הדגימות המסומנות ומכילות חרוזים בציטומטר הזרימה.

צנטריפוגה 50 מיקרוליטר של נבגים ב 17, 949 גרם במשך 10 דקות. לאחר מכן, להשעות מחדש את הנבגים באמצעות 25 מיקרוליטר של 1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide ולדגור במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 25 מיקרוליטר של N-hydroxysulfosuccinimide בריכוז של 50 מילימולר לתרחיף הנבג.

דוגרים על תרחיף הנבגים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את הנבגים שלוש פעמים עם PBS על ידי צנטריפוגה כפי שהוצג קודם לכן. הוסיפו חלבון פלואורסצנטי לדגימות ודגרו במשך הלילה בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס.

הוסף 10 מיליגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד מדולל ב 1 עד 50, ולאחר מכן להשאיר את הדגימות על קרח במשך שעה אחת, מוגן מפני אור. לאחר שטיפת הנבגים והגדרת השערים כפי שהוצג קודם לכן, שנו את הפרמטרים עבור גלאי מסנן שלוש על ציר x, וגלאי מסנן חמש על ציר Y של תרשים הנקודות. שיטת ספירת החרוזים זיהתה פעמיים 10 עד השלישי נבגים למיקרוליטר בדגימות נבגים אוטוקלאביים.

צביעת אתידיום ברומיד של דגימות נבגים אוטוקלאביים הראתה עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת גבוהה יותר מאשר צביעה של נבגים שאינם אוטוקלאבים, מה שמצביע על צביעה גדולה יותר של חומר גנטי. משטח נבג האוטוקלאב, יחד עם נוגדן אינטרלוקין 10 אנטי-אנושי שכותרתו APC, הראה יעילות צימוד גבוהה יותר בהשוואה לנבגים שאינם אוטוקלאביים. נוכחותם של נבגים חדירים לאתידיום ברומיד הצביעה על נוכחות אפשרית של נבגים מונבטים בכלל האוכלוסייה.

בהתבסס על ניתוחי ציטומטריית הזרימה, נצפה כי הנוגדן הפלואורסצנטי הראה אחוז גבוה יותר של צימוד עם הנבגים הרדומים בהשוואה לנבגים הנבוטים. יתר על כן, ככל שריכוז הנוגדנים הפלואורסצנטיים עלה, נצפתה עלייה באחוז הנבגים המצומדים ובעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת. חשוב לבצע הומוגניזציה יסודית של החרוזים הנוכחיים כדי להבטיח קריאות מדויקות באמצעות ציטומטריית זרימה וספירה מדויקת של נבגים.

על מנת לתקנן את ריכוז האנטיגנים המחוברים לנבגים, מחקרים קנדיים מנתחים את השימוש בנבגים כנוגדנים לחיסון.