מערך ההרדמה הסדרתי לחקירה בתפוקה גבוהה של חומרים נדיפים באמצעות Drosophila melanogaster
February 24th, 2023
זבוב הפירות (Drosophila melanogaster) נמצא בשימוש נרחב למחקר ביולוגי וטוקסיקולוגי. כדי להרחיב את התועלת של זבובים, פיתחנו מכשיר, מערך הרדמה סדרתית, שחושף בו זמנית דגימות זבובים מרובות להרדמה כללית נדיפה (VGAs), מה שמאפשר לחקור את ההשפעות הנלוות (רעילות ומגוננות) של VGAs.
SAA מאפשר עיבוד בתפוקה גבוהה לחקר הפרמקולוגיה של חומרים נדיפים באורגניזמים מודל חסרי חוליות שניחנו במוח מתוחכם וברפרטואר רחב של התנהגויות. בשילוב עם ארגז הכלים הגנטי הזמין ב- Drosophila melanogaster, טכניקה זו מאפשרת לחקור את הפרמקוגנטיקה של חומרים נדיפים במהירות ובמחיר סביר. אנשים רבים נחשפים לחומרים נדיפים כמזהמים או כחומרים טיפוליים.
בנוסף להרדמה, להרדמה נדיפה יש השפעות נלוות רעילות ומועילות רבות. מידת ההשפעה נקבעת בחלקה על ידי גנטיקה, שנותרה במידה רבה בלתי נחקרת. לאחר הכנת מסגרת העץ, שנה מכסי צינור כרוניקה של 50 מיליליטר על ידי קידוח שני חורים בכל כובע עם מקדח 9/32 אינץ '.
חול את החורים כדי לנקות את הפלסטיק המרופט. כמו כן חול את החלק העליון של הכובע כדי לחספס את פני השטח. לאחר מכן חתכו פיפטות סרולוגיות של חמישה מיליליטר לגודל על ידי ניקוד הפלסטיק ושבירתו הנקייה בקו הניקוד.
חול את הקצוות של פיפטות חתוכות או שבורות. לאחר מכן, מדביקים רשת לצינורות וחותכים את הרשת לגודל הצינור ברגע שהדבק מתייבש. הכנס את הצינורות לתוך החורים של הכובעים החרוטיים כאשר שני הצינורות נמשכים מעל המכסה.
ודא שצינור הזרימה נמשך זמן רב יותר לתוך הצינור מאשר היציאה. מרחו דבק על החלק העליון של הפקקים סביב הצינורות כדי להצמיד את החלקים זה לזה ולאפשר להם להתייבש. חבר למסגרת אזיקוני כבלים דביקים.
הדביקו את הכובעים למסגרת באמצעות אזיקונים וגזרו את קצוות תג האזיקון קצר. חתכו וחברו את אורך צינורות הטיגון לצינורות הזרימה והזרימה בכל מכסה שונה. החל מהקצה במעלה הזרם, חבר את הצינור תחילה לזרימה, ולאחר מכן מהזרימה החוצה לזרימה של המיקום הבא.
לאחר מכן, הוסף מחוון זרימה לזרימה במורד הזרם. שים צינור חרוטי 50 מיליליטר במיקום הראשון וסמן את סימן מילוי המים. הסר את הצינור.
מלאו אותו במים מתחת לצינור הזרימה והחזירו אותו למקומו. הכינו את התממשקות למכשיר האידוי. הסירו את הבוכנות, חתכו חריצים משני מזרקי ניפוק של 10 מיליליטר, והכניסו אותם לזרם הוופורייזר והחוצה כשהחריצים פונים ישירות לכיוון חזית הוופורייזר כדי ליישר קו עם החורים.
חבר את המערכת כולה. השתמש בצינורות טייגון כדי לחבר את מיכל הגז המוביל לווסת, מד זרימה ספציפי לגז, וופורייזר ו- SAA. מלא עמדות ריקות במערך עם צינורות כרוניקה ריקים של 50 מיליליטר.
עכשיו להפעיל את מיכל הדלק. פתח את מד הזרימה לשני ליטר לדקה והפעל את הוופורייזר ל- 0% אשר את זרימת הגז במערכת על ידי בדיקת מד הזרימה במעלה הזרם של הוופורייזר ומחוון הזרימה במורד הזרם של התא האחרון של SAA לזרימה. לחלופין, הכניסו את קצה הצינור במורד הזרם למים וחפשו בועות.
24 שעות או יותר לפני החשיפה להרדמה מיין את קבוצות הזבובים לפי הצורך לניסוי בשיטה המועדפת. מעבירים זבובים מבקבוקוני מזון לצינורות חרוטיים ריקים של 50 מיליליטר. ספור ותעד זבובים מתים לפני החשיפה.
לפתוח ולהבריג צינורות חרוטי 50 מיליליטר עם זבובים על SAA. הפעל את גז המוביל והגדר אותו לקצב הזרימה הרצוי. כוונו את מכשיר ההרדמה לריכוז הרצוי וחשפו את הזבובים למשך הזמן הרצוי.
בתום החשיפה שוטפים את המערכת בזרימת גז טרי בנפח של 1.5 ליטר לדקה למשך חמש דקות, המקביל לנפחים של כפי 10 מנפח SAA הכולל. פתח את וסת הלחץ הגבוה לחלוטין ולאחר מכן סגור אותו חצי סיבוב כדי להבטיח זרימת גז מוביל. יש לעקוב אחר הצינוריות לכל קו אל מדי הזרימה והוופורייזר, ולבדוק את רמת ההרדמה במכשירי האידוי.
ודא שכאשר גז זורם, הוא מציין זרימה במד הזרימה ובמחוון הזרימה במורד הזרם. בסוף הניסוי, יש לאפשר ארבע עד חמש דקות של זרימת אוויר כדי לשטוף את חומר ההרדמה. שבעה קווים שבודדו מאוכלוסייה אחת באמצעות מפגשים של זוג יחיד הראו שונות בתמותה כתוצאה מרעילות איזו-פלואור כתוצאה מלחץ אבולוציוני בזבובי ND23 60114.
טיסה מוקדמת עם 15 דקות של 2% ISO פלואור לפני פגיעה מוחית טראומטית הפחיתה את מדד התמותה לאחר 24 שעות בזנים לבנים 1118 וצהובים/לבנים. מדד התמותה לאחר 24 שעות לא היה נמוך משמעותית בקווי אורגון R וקנטון S שהיו לפני כן. במהלך ההרכבה, החריצים במזרקים ששונו חייבים להתיישר עם החורים של יציאות הוופורייזר.
במהלך החשיפה, לבדוק מעת לעת כי יש זרימה דרך המערכת. ניתן לבצע הליך זה במגוון רחב של מחקרים התנהגותיים, הישרדותיים ומולקולריים שיכולים להוביל לתובנות לגבי הפרמקולוגיה של חומרים נדיפים.
סקירה
מערך ההרדמה הסדרתי (SAA) הוא מכשיר חדשני שנועד לעיבוד תפוקה גבוהה של Drosophila melanogaster לחקר הפרמקולוגיה של חומרי הרדמה כלליים נדיפים (VGAs). שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות הרעילות והמגנות של VGAs על זבובי פירות, תוך ניצול המגוון הגנטי שלהם.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- פרמקולוגיה
- טוקסיקולוגיה
רקע
- Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל נפוץ במחקר ביולוגי.
- ל-VGAs יש השפעות לוואי שונות המושפעות מגנטיקה.
- ה-SAA מאפשר חשיפה בו זמנית של דגימות מרובות ל-VGAs.
- הבנת ההשפעות של VGAs יכולה לספק מידע על ההשלכות הטיפוליות והטוקסיקולוגיות שלהם.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לחקירת תפוקה גבוהה של VGAs בזבובי פירות.
- לחקור את הבסיס הגנטי של התגובות ל-VGAs.
- להעריך את ההשפעות הרעילות והמגנות של VGAs על Drosophila.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של ה-SAA באמצעות מכסי צינורות כרוניים שונים בגודל 50 מיליליטר ופיפטות סרולוגיות.
- הגדרת מערכת זרימת גז למסירת VGAs לדגימות הזבובים.
- חשיפה של Drosophila ל-VGAs בתנאים מבוקרים.
- ניטור של תמותת זבובים ותגובות התנהגותיות לאחר החשיפה.
תוצאות עיקריות
- נצפתה שונות בתמותה הנגרמת מרעילות של איזו פלוארין בין קווי זבובים שונים.
- מיזוג מראש עם איזו פלוארין הפחית את התמותה בזנים מסוימים.
- שיטת ה-SAA מאפשרת בדיקה יעילה וניתנת לשחזור של VGAs.
- התובנות שהושגו יכולות להוביל להבנה טובה יותר של הפרמקולוגיה של חומרים נדיפים.
מסקנות
- ה-SAA הוא כלי יעיל לחקר ההשפעות של VGAs ב-Drosophila.
- גורמים גנטיים משחקים תפקיד משמעותי בתגובה ל-VGAs.
- מחקר זה יכול להיות בעל השלכות להבנת ההשפעות של VGAs בהקשרים ביולוגיים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The Serial Anesthesia Array (SAA) enables high-throughput, quantitative investigation of volatile general anesthetics (VGAs) in Drosophila, supporting rapid pharmacogenetic and mechanistic de-risking in early discovery. By allowing simultaneous, controlled exposure of multiple genotypes or biological variables, the SAA advances predictive confidence in target validation and portfolio triage for neuropharmacology and toxicology pipelines. This platform addresses the need for scalable, reproducible systems to interrogate genetic and environmental determinants of drug response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of genetic determinants influencing VGA response in a controlled in vivo system.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying pharmacodynamic and pharmacogenetic interactions across diverse fly models.
- Facilitates functional target validation through reproducible, parallelized exposure and outcome measurement.
- Improves predictive confidence for advancing neuroactive compound programs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, scalable biological systems for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Standardizes exposure conditions and quantitative outputs across multiple cohorts and genotypes.
- Enables reproducible, high-throughput assessment of behavioral, survival, and molecular endpoints.
- Supports assay readiness for evaluating compound efficacy and toxicity in genetically tractable models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical model systems with disease-relevant genetic and environmental variables.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of neuropharmacological hypotheses.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, comparative data across genotypes and conditions.
- Supports translational biomarker exploration in neuroinflammation and injury models.
Pipeline & Workflow Integration
The SAA integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing and target validation through lead identification and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of VGA effects and genetic modifiers in a scalable in vivo system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for cross-cohort comparison and compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical analysis of mortality, behavioral, and molecular endpoints to inform decision-making.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by modeling disease-relevant genetic and injury variables.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, modular platform adaptable to diverse pharmacological and genetic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroactive compound development.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput for pharmacogenetic and toxicological studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, comparative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuropharmacology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, behavioral assays, and pharmacology.
- Needs access to vaporizer instrumentation, gas flow control, and analytical infrastructure for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of exposure protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various genotypes, biological variables, and experimental endpoints.
- Practical limitations include scalability to other model organisms and translation to mammalian systems.
