ייצור של מיקרו-חלקיקים פולימריים פולסטיליים העוטפים אנטיגן כלבת

המשמעות של גישה זו היא שניתן להשתמש בה למתן חיסונים במנות מרובות בזריקה אחת, מה שעשוי להציל מיליוני חיים, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית שבהן יילודים אינם מחוסנים בשל אתגרי גישה. שיטת ייצור זו מאפשרת לחיסון נגד כלבת לשמור על צורתו המעניקה חסינות טבעית כאשר הוא עטוף במיקרו-חלקיקים ששחרורם מחקה את לוחות הזמנים הנוכחיים של החיסון בזריקה אחת בלבד. כלבת היא מחלה קטלנית, הדורשת עד חמש זריקות חיסון חוזרות במקרים מסוימים כדי למנוע מוות.

עם זאת, מתן משטר חיסונים מלא בביקור אחד יכול לשפר את ההיענות ולהציל חיים. טכניקה זו מייצגת טכנולוגיית פלטפורמה המסוגלת לספק טיפולים מגוונים או מניעה למחלות שונות. כדי להתחיל, לטפל משטח תבנית אב מודפס 3D על ידי הצבתו בתא ואקום המכיל שקופית זכוכית עם 40 מיקרוליטר של trichlorosilane על פני השטח.

הפעל את שואב האבק למשך שעה. ערבבו את הבסיס הפרה-פולימרי PDMS ואת חומר הריפוי ביחס מסה של 9:1 לתוך פלסטיק. לאחר מכן, להעביר את התמיסה לתוך צינור 50 מיליליטר צנטריפוגה 300 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגה, ודא שהפתרון ברור. לאחר השלמת הטיפול במשטח, הניחו את תבנית האב בכלי רדיד אלומיניום ושפכו את ה-PDMS שלא נרפא על התבנית, כדי להבטיח שהתכונות שקועות לחלוטין. הניחו את צלחת רדיד האלומיניום בתא ואקום ומשכו את השואב למשך שעה כדי להסיר בועות אוויר.

לאחר הסרת צלחת רדיד האלומיניום, הניחו ספייסרים בגודל 800 מיקרומטר בכל קצה של תבנית האב והניחו מגלשת זכוכית נקייה על תבנית המאסטר, תוך הימנעות מבועות. השתמשו במהדקי קלסרים כדי להדק את התבנית מעל הספייסרים של 800 מיקרון. לרפא את prepolymer בתנור ב 120 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות.

ברגע שהוא נרפא, בזהירות לשחרר את קטעי קלסר. השתמש בסכין גילוח כדי להפריד את תבנית האב מתבנית PDMS שנרפאה. להכנת סרט PLGA, מניחים 450 מיליגרם של PLGA על יריעת פולימר נון סטיק בתוך טבעת shim.

לאחר מכן, שכבו יריעת פולימר נון-סטיק שנייה על ה-PLGA והשתמשו במהדק C בקוטר 101.6 מ"מ כדי לדחוס את הערימה בין שני בלוקי אלומיניום עד לחוזק האצבע. מניחים את המכלול המהודק C בתנור ואקום. לאחר 30 דקות בתנור, מהדקים את המהדק ומחזירים אותו לעוד 30 דקות.

לאחר מכן, מעבירים את המכלול למייבש למשך ארבע שעות לקירור. לאחר הקירור, שחררו את המהדק, הסירו את סרט ה-PLGA מיריעות הפולימר הנון-סטיק והניחו אותו בצלחת פטרי מסומנת. אחסנו את צלחת הפטרי בתוך מייבש לשימוש מאוחר יותר.

כדי ליצור חלקיקי PLGA, התייחס למשטח תבנית PDMS כפי שהודגם קודם לכן. בעזרת פינצטה או אזמל, חתכו את יריעת ה-PLGA בגודל 250 מיקרון כך שתהיה בערך בגודל מערך החלקיקים והניחו אותה על תבנית PDMS המטופלת. הנח שקופית מיקרוסקופ זכוכית נקייה על סרט PLGA על גבי תבנית PDMS וחבר אותם יחד על ידי הצבת מהדק קפיץ מעל המערך וסרט PLGA.

שומרים את מכלול התבנית המהודק בתנור הוואקום למשך שעה, ואז מקררים אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הקירור, הפעילו בעדינות את הלחץ באמצעות סכין גילוח כדי להפריד את תבנית PDMS ממערך חלקיקי PLGA ואחסנו את חלקיקי PLGA במייבש לשימוש נוסף. כדי למלא את החלקיקים באנטיגן מרוכז נגד חיסון כלבת, הכינו את המתקן הפיזואלקטרי והניחו את השקופית המכילה את חלקיקי PLGA באזור הניפוק.

טען את האנטיגן המרוכז על הצלחת, ולאחר מכן הזן את פרמטרי הגדרת היעד ולחץ על הפעל. הרובוט הפיזואלקטרי ימלא את החלקיקים. לאחר השלמתו, השתמש בסטריאוסקופ כדי לוודא שהחלקיקים מולאו.

לאיטום החלקיק המלא, הניחו גוש נירוסטה על פלטה חמה ושתי שקופיות מיקרוסקופ מקבילות על גוש הנירוסטה. לאחר פילוס בלוק הנירוסטה, הפעל את הצלחת החמה וקבע את הטמפרטורה על 205 מעלות צלזיוס. לאחר שמגיעים לטמפרטורת פני השטח הרצויה של הנירוסטה, השהה את חלקיקי ה- PLGA המלאים בשתי שקופיות הזכוכית והפעל מיד טיימר למשך 18 שניות.

לאחר הסרת מערך החלקיקים האטום מהפלטה החשמלית, תלו אותו על שתי שקופיות זכוכית על ספסל המעבדה וקררו אותו למשך דקה. כדי לקצור חלקיקים אטומים, החזק את להב האזמל בזווית של 45 מעלות למגלשה והפעל לחץ על בסיס החלקיקים כדי להפריד אותם מהמגלשה. בעזרת אזמל, העבירו את החלקיקים שנקטפו לתוך צינור בעל קשירת חלבון נמוכה של 0.5 מיליליטר.

הוסף 250 מיקרוליטר של PBS המכיל אלבומין בסרום בקר וגלוקוז כדי לשמור על יציבות החיסון נגד כלבת הניחו את הדגימה מתחת לסטריאוסקופ ומעכו את החלקיקים באמצעות שיניים אחת על זוג פינצטות בעלות קצה דק. במהלך מילוי החלקיקים, נדרש זמן ייבוש מספיק לממס מלא או אידוי מים. לאחר הייבוש, מחסן מומסים נשאר בתחתית ליבת החלקיקים.

המורפולוגיה האידיאלית של חלקיקים נצפתה בין זמני תקרה של 18 ו-24 שניות עבור PLGA זה, שכן חלקיקים שהכילו מטען נאטמו לחלוטין באותם זמנים מבלי לאבד את מבנה החלקיקים. החלקיקים היו קטנים מספיק כדי להיכנס בקלות למחט של 19 מד כאשר נארזו ונאטמו כראוי. יתר על כן, 10 חלקיקים זרמו באופן עקבי דרך מחט של 19 מד כאשר הזריקו אותם בתמיסה צמיגה, כגון 2% קרבוקסימתיל צלולוז.

מיקרוגרף אלקטרונים ההולכה הצביע על וריאנטים שלמים של כלבת בדגימת האנטיגן המרוכזת, ואלה היו מרוכזים בערך פי 4.4 מתמיסת המלאי ההתחלתי. לאחר האיטום, כ-69% מהאנטיגן נשאר עטוף בצורתו הביו-אקטיבית, מה שמרמז על כך שעקת חום גורמת לאובדן משמעותי במהלך האיטום, אך רוב האנטיגן הנגיפי נשאר שלם. מילוי מיקרו-חלקיקים הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר.

אם חלקיקים אינם מלאים כראוי, אין זה סביר שהחלקיקים ייאטמו כראוי. כדי להבין את היציבות, יהיה צורך בפיתוח פורמולציות נוספות, כולל חומרים פעילים וחומרים ביולוגיים רלוונטיים אחרים בליבת החלקיק.