אוטומציה של עיבוד Citrus Budwood לזיהוי פתוגנים במורד הזרם באמצעות הנדסת מכשירים

הטכניקה שהודגמה משתמשת במכשיר בעלות נמוכה כדי לעבד במהירות רקמת הדרים עשירה בפלום, ומבטלת את הצורך בפרוטוקולים עתירי עבודה ובציוד מעבדה מיוחד. זה מאפשר זיהוי וניהול מהיר במורד הזרם של וירואידים הדרים, וירוסים וחיידקים. שיטה זו עשויה להגדיל את התפוקה ולשפר את האיכות והאחידות של שירותי הבדיקה, לטובת ענף ההדרים ועשויה לסייע באבחון וטיפול במחלות במשתלה ובשטח.

צמחי הדר נגועים בפתוגן, גורמים להפסדים כלכליים משמעותיים ברחבי העולם. טכניקות מתקדמות לזיהוי פתוגנים, כמו Budwood Tissue Extractor, או BTE, נחוצות לייצור חומרי ריבוי שנבדקו בפתוגן לייצור עצים בקנה מידה גדול. למרות שנבדק ואומת עם דגימות הדרים, השיטה יכולה להיות מיושמת במעבדות אבחון ופעולות שדה עבור גידולים רבים אחרים.

מתחילים המבצעים טכניקה זו חייבים להכיר את הפרוטוקול, לעקוב אחר ההוראות במדויק ולהיות סבלניים. כדי להתחיל, השתמש ביישום הטלפון Test Tracker כדי לבחור עץ והחזק תג צווארון של Near-Field Communication, או NFC, לטלפון כדי לטעון את פרטי העץ לתג. הכניסו שלוש עד ארבע דוגמאות של עצי ניצן מפירות הדר למנשא שקיות הניילון התואם, Budwood Tissue Extractor, או BTE, וסגרו אותו עם האטב.

לאחר הבטחת איכות הדגימה על-ידי ביצוע השלבים המתוארים בטקסט, השתמש באפליקציית הטלפון Test Tracker כדי לסרוק את תג צווארון NFC של העץ, ולקשר אותו לתג קליפ NFC בשקית הדגימה. בתוך מכסה אדים שעבר חיטוי כראוי, הפוך את המתג בחלק האחורי של בסיס חילוץ הרקמות. ודא שהמתג בצד שמאל של התיבה נלחץ כלפי מטה בחלק העליון, והמתן עד שהנורית הירוקה המהבהבת תציין שהתא מוכן.

כדי להכין את תא BTE, חבר שקית דגימה ריקה לחלק האחורי של התא על ידי אבטחתו לפייה האחורית באמצעות טבעת O. בדוק את הלהב לאיתור סימני בלאי או נזק, כגון חתכים על הלהב הממשיכים לתוך הפלסטיק, או חתכים בקצה. ודא שהחץ על הלהב מיושר עם סמל המנעול היחיד, וששחרור האוויר בתחתית התא מופנה לכיוון סמל O.

הניחו את המכסה השקוף מעל פתח התא. באמצעות המסילה בצד ימין של התא, החלק את מגלשת ה- BTE השקופה אל התא, תוך דחיפת המנעול בתחתית התא ככל שהוא יכול להיכנס למגלשה. ודא שמכסה הבוכנה מותקן בחלק העליון של המגלשה.

כדי להעמיס את תא ה-BTE על בסיס ה-BTE, הניחו את התא המוכן על הבסיס כאשר פיית בסיס ה-BTE בולטת לחלק האחורי של החדר. טען את הדגימה על בסיס BTE על-ידי הזזת המדבקה הלבנה על תג הקליפ של NFC בתנועה מעגלית איטית ל-Z בצד ימין של הקופסה עד שהאור הצהוב יתחיל להבהב. לאחר הצמדת הדגימה לבסיס, יש לוודא שבשקית הדגימה אין חורים.

לאחר מכן הניחו את טבעת ה-O מעל שקית הדגימה כדי לאבטח אותה לקדמת פיית ה-BTE. כדי לטעון את ערכת המזרקים שאינה בשימוש, ראשית, קרעו את סט המזרקים. לאחר מכן מניחים את המזרק שאינו בשימוש על מגדל סולם השקילה.

הסר את ערכת המזרקים כאשר נורה אדומה מתחילה להבהב, או כאשר קנה המידה מציג אפס. מוציאים את הבוכנה עם הפילטר מהמזרק תוך וידוא שהנוזל נשאר במזרק התחתון. הניחו את הבוכנה על מגבת נייר, או על המגדל, במקום שבו היא אינה נוגעת בשום משטח.

לבסוף, חבר את המזרק ליציאת השקופיות על ידי לחיצה על יציאת היציאה לתוך המזרק וסובב אותו 90 מעלות. כדי להתחיל לעבד את דוגמת budwood, לחץ על הלחצן השחור העליון כדי להפעיל את המכונה. קח מקל Budwood אחד מהשקית, ולשים אותו דרך החלק העליון של זרבובית BTE.

תפסו את מקל הבודווד בצד השני של התא ביד השנייה והורידו לאט לאט לתוך הלהב. הזיזו את הניצן באיטיות קדימה ואחורה תוך כדי סיבוב שלו. כאשר נשמע זמזום קל, הזיזו את הענף עמוק יותר לתוך המכונה כדי להתמקד בפלום.

לאחר השלמת אותו הדבר עבור כל הסניפים, לחץ על הכפתור השחור העליון כדי לעצור את העיבוד, והמתן עד שהאור יתחיל להבהב שוב בצהוב. כדי לאמת את משקל הדגימה, סובב את המזרק 90 מעלות ומשוך אותו למטה. מניחים את הבוכנה בחזרה על המזרק ומניחים את המזרק על המגדל.

לאחר שהסולם מזהה אוטומטית את הדגימה, נורית LED ירוקה מהבהבת מציינת שמשקל הדגימה נמצא בטווח המתאים. אם הנורית האדומה מהבהבת, דבר המציין משקל דגימה נמוך מדי, חזור על עיבוד הדגימה. אם המשקל גבוה מדי, הסר כמה דגימות, והבהוב הנורית הצהובה יהפוך איטי יותר.

כדי ליצור הומוגניות של הדגימה, הסר את הבוכנה מהמזרק המכיל את הדגימה. דוחפים את הנוזל לתוך המזרק ומכניסים את הבוכנה בחזרה. דחפו את הבוכנה כדי להעביר את החיץ ושתלו לשד דרך מסנן הרשת דרך צינור הגומי לתוך המזרק הריק.

מערבבים את הדגימה על ידי דחיפת החיץ והלשד הצמח קדימה ואחורה שלוש עד ארבע פעמים ממזרק אחד למשנהו עד שהדגימה הופכת לנוזל ירוק הומוגני. לאחר הומוגניות טובה, דוחפים את דגימת לשד הצמח לתוך המזרק ללא מסנן הרשת, ומנתקים ממנו את צינור הגומי ואת המזרק עם הפילטר. לאחר מכן להוציא את דגימת לשד הצמח מן המזרק לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי שני מיליליטר.

לאחר תיוג הדגימה במספר השקית באמצעות טוש קבוע, אחסנו אותה בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. חטא את התא הנשלף BTE לאחר עיבוד הדגימה העשירית והנורית הירוקה תמשיך להבהב במקום להחליף לכחול. כדי לפרק את התא ולנקות את כל המזהמים, הסר את מכסה הפלסטיק השקוף, את מגלשת התא השקוף ואת יציאת הסתימה במגלשת התא.

לאחר מכן סובב את שסתום שחרור האוויר בתחתית התא לסימן המנעול הפתוח. לאחר הכנסת רכיבי התא לשואב האולטרסוני של ההתקנה, הניחו את התא באמבטיה עם המכסה מתחתיו כדי למנוע מהמכסה לצוף. הפעל את השואב הקולי במשך 15 דקות.

שטפו את רכיבי התא באמבט המים למשך 30 שניות לפחות לפני העברת רכיבי התא לתחנת הייבוש. כדי להתחיל להתייבש, מקם את אקדח האוויר בקו אחד עם החריץ של הפתח העליון של התא, ולחץ על הדק האקדח כדי לשחרר אוויר למשך כ -30 שניות. סובב את אקדח האוויר לעבר החרירים העליונים של החדר, ולאחר לחיצה על ההדק, עקוב לאט אחר שלושה מעגלים מלאים של כל כניסה לזרבובית.

מקם את אקדח האוויר במרכז ה- BTE, והחל מהנקודה הפנימית ביותר החזק את ההדק למטה ונע עד שאקדח האוויר מצביע לכיוון המגלשה. העבירו במהירות אוויר על כל התא מלפנים ומאחור כדי להרחיק את המים העיליים מבחוץ. השוואה בין BTE לבין פרוטוקול מעבדה קונבנציונלי לעיבוד רקמת הדרים הצביעה על כך שריכוזי חומצות הגרעין שחולצו שנקבעו על ידי מדידת ספיגה של 260 ננומטר בשני המקרים היו דומים.

טוהר חומצות הגרעין שהופקו על ידי BTE נקבע כי יחס הספיגות ב 260 ו 280 ננומטר היה גבוה עם זיהום חלבון נמוך. שלמות חומצות הגרעין שנותחה על ידי RT-qPCR והתמקד ב-mRNA של הגן NADH dehydrogenase בהדרים הייתה דומה מאוד הן עבור BTE והן עבור הפרוטוקול הידני הסטנדרטי. הליך המעבדה הקונבנציונלי דרש כמעט שבע עד 10 דקות לקיצוץ ידני לכל דגימה, ויותר זמן לעיבוד רקמות, כולל ייבוש בהקפאה, טחינה וצנטריפוגה.

עם זאת, BTE עיבד כל דגימה למיצוי חומצת גרעין תוך שלוש דקות, כולל שלבי הכנה, שקילה וניקוי. אף אחת מ-72 הדגימות הבריאות מעיבוד דגימות ה-BTE הראשון לא יצרה עקומות הגברה עבור פתוגני ההדרים שנבדקו, ובכך אימתה את עיבוד ה-BTE של רקמת הדרים. בעיבוד הדגימה השני של BTE, עם שתי דגימות נגועות בתערובת שהוכנסו, חומצות הגרעין שחולצו הראו נוכחות של וירוסי הדרים ווירואידים שונים בקבוצות אחת וחמש.

עם זאת, לא זוהה זיהום צולב בין ראשים, או תוצאות חיוביות כוזבות, או שליליות. בזמן העיבוד, השארת הענף במקום אחד למשך זמן רב מדי עלולה לחתוך עמוק מדי לתוך הענף, להגדיל את הסיכוי לסתימה, ולאסוף חומר סיבי אצלולרי. לאחר עיבודו, החומר מוכן לרוב פרוטוקולי מיצוי וטיהור הדנ"א והרנ"א, וניתן לבדוק אותו בכל בדיקה מולקולרית לפתוגנים צמחיים.

פיתוח מחלץ רקמות Budwood פתח את הדלת לאזור תפוקה גבוהה וסינון ברחבי החורשה. יחד עם מחלץ רקמת העלים, הוא מאפשר עיבוד בקנה מידה גדול של רקמות צמחים שבעבר נחשבו קשות לעיבוד, כגון שורשים ופדונקים.