Name: צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: חקור תרבית אקספלנטים של שבלול לחקר אוזן פנימית ואובדן שמיעה סנסורינורלי במודל עכברוש. שיטה זו מאפשרת ניתוח מולקולרי מדויק של תאי שערה ותאי גנגליון ספירלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות למתקן בעלי החיים של המחלקה לביו-רפואה של אוניברסיטת באזל על תמיכתם בטיפול בבעלי חיים, מתקני הליבה של מיקרוסקופיה וכן לשירות טכנולוגיית המידע של המחלקה לביו-רפואה על עזרתם הטכנית, והקרן הלאומית למדע שוויצרית (SNSF) לתמיכה כספית (מלגת MD-PhD ל- M.C., מענק מספר 323530_191222).

<ol><li>Mukherjea, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+screening+of+drugs+to+prevent+acquired+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).</li>
<li>Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+cell-based+therapies+for+the+treatment+of+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss.</a> Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).</li>
<li>Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+and+aminoglycoside+antibiotics%3A+Hearing+loss+and+its+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685(2010).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+mouse+Stat1+gene+results+in+compromised+innate+immunity+to+viral+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease.</a> Cell. 84 (3), 443-450 (1996).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Etournay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cells+undergo+an+apical+circumference+remodeling+constrained+by+the+hair+bundle+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape.</a> Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).</li>
<li>MacDonald, G. H., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+intact+mouse+cochlea+by+fluorescent+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy.</a> Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).</li>
<li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Deconvolution microscopy.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).</li>
<li>Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+learning+approach+to+quantify+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">A deep learning approach to quantify auditory hair cells.</a> Hearing Research. 409, 108317(2021).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Ershov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate+7%3A+Integrating+state-of-the-art+segmentation+algorithms+into+tracking+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines.</a> Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+A+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
<li>Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+mammalian+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+of+Science+B%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of mammalian inner ear hair cells.</a> Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

מטרת עדכון פרוטוקול זה הייתה לייעל את השלבים מבידוד הצמחים ועד להדמיית תאי השבלול החיים והקבועים. שיפרנו כמה שלבים במהלך הבידוד והצגנו כמה כלים חדשניים במטרה לבסס פרוטוקול יעיל וחלק להשגת צמחים באיכות גבוהה. השיטה המתוארת היא פרוטוקול אופטימלי מדוחות קודמים 4,5. בנוסף, בחלק מהמחקרים הנוכחיים חסר פרוטוקול מעודכן בשלבים. עם שלבי תרבית explant פשוטים, פרוטוקול זה מספק טיפול קל בצמחים שמורים היטב, החיוניים לנתונים הניתנים לשחזור. הכנסת תאים מרובי בארות עם כיסוי פולימרי עבור צמחים באוזן הפנימית משפרת את חיבור האיברים ואת השימור של צמחים שלמים. במאמר זה אנו מציגים מספר דוגמאות לניסויים בתנאי עקה כדי להדגים שהאיברים בתרבית שומרים על הארגון התאי שלהם למרות אובדן תאי השערה והנזק לנוריטים.
אחד האתגרים בטיפוח איברי האוזן הפנימית הוא הימנעות מניתוק וציפה של האיברים, שכן הדבר משפיע על שלמות העצילים, התגובה לטיפול והבדיקות שלאחר מכן. בעבר, צמחים תורבתו על כיסויי זכוכית 4,5. למרות שנראה כי תרבות על משטחי זכוכית היא חלופה טובה, ציפוי הזכוכית גוזל זמן, והכיסויים עצמם שבירים ועדינים. פרוטוקול חלופי המשתמש בתרבית תאי מיליסל מוסיף ניסיונות לפתור בעיה זו6. עם זאת, חיתוך והעברת הממברנה עם הצמחים נראה צעד עדין בפרוטוקול זה. בנוסף, העציצים עלולים להיפגע במהלך הרכבה ואיטום של הכיסוי. לפי הגישה המוצעת שלנו, ברגע שהחצילים מועברים לתאים המצופים בפולי-D-ליזין ומניחים אותם במיקום הנכון, אין צורך בהעברה או כיסוי נוספים בכיסויים. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש בתאים עם כיסוי פולימרי דק חדיר לגז המספק תנאי תרבית אופטימליים לצמחי האיברים. פולימר זה הוא בעל איכות אופטית דומה לזכוכית, ולכן הוא מתאים לדימות תאי במיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה.
הוספת סרום למדיום משמשת ברוב הפרוטוקולים לתרבית תאים ורקמות, כולל תרבית של חצילים באוזן הפנימית עם 1%-10% FBS 4,5,6,16. נוכחות הסרום משפיעה על תנאי התרבית של הניסויים; לכן, במצבים מסוימים, תרבות ללא סרום עדיף. היעדר סרום בתרבית של צמחי שבלול הוחלף על ידי תוספת של N2 ל- DMEM או על ידי תוספת של N2 למדיום Neurobasal-A 5,6. בהקשר זה, בדקנו את תנאי התרבית של הצמחים עם ובלי סרום. בשני התנאים, תאי האוזן הפנימית היו חיוניים והגיבו לתנאים אוטוטוקסיים. בדקנו את התנאים האלה במשך 72 שעות, אבל הצמחים יכולים להישמר בתרבית אפילו יותר זמן, במיוחד כאשר הם מודגרים עם מדיום ללא סרום יחד עם N2, B27, וגורמי גדילה, כפי שהוצע במחקרים אחרים 5,16.
בנוסף לשלבים הקריטיים הכלליים בבידוד של חצילים באוזן הפנימית, כגון משך בידוד האיברים והאנטיביוטיקה בה משתמשים, ישנם גם כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה, אשר עם זאת, ניתנים לניהול. אחד השלבים הקריטיים בשיטה זו קשור לנפח המדיום שנותר בחדר לאחר החדרת האיבר. זה עבר אופטימיזציה כדי לשמור על הצמחים בחיים ומחוברים למשטח התחתון. שלב קריטי נוסף קשור לזמן הדגירה הנדרש כדי לאפשר לצמחים להיצמד לתחתית החדר. זמני דגירה ארוכים משעתיים עם כמה מיקרוליטרים של מדיום עלולים להשפיע על בריאות הצמחים. ניתן להשתמש גם בזמני דגירה קצרים יותר, כגון שעה אחת, כל עוד מקפידים שלא לנתק את הצמחים. היבט חשוב נוסף הוא שאריות של poly-D-lysine. יש להקפיד על שלבי הכביסה של פולי-D-ליזין, מכיוון ששאריות מלח הברומיד של פולי-D-ליזין יכולות להיות רעילות לתאים. לאחר ביצוע מדויק של שלבי הכביסה, הציפוי בפולי-D-ליזין מאפשר הדבקה חלקה של הצמחים לתאים, כך שניתן לתקן את המיקום לפני שהם מחוברים היטב לתחתית החדר.
אחת המגבלות של שיטה זו היא הדמיה של תאים באמצעות מיקרוסקופ זקוף. זה יכול להיות נושא חשוב עבור אותן מעבדות עם מיקרוסקופים הפוכים. שקופיות זכוכית עם תאי סיליקון נשלפים ניתן להשתמש עבור מיקרוסקופיה זקופה הפוכה; עם זאת, תנאי הציפוי שלנו עם פולי-D-ליזין צריכים להיבדק תחילה. מגבלה נוספת היא אחסון החדרים, מכיוון שהתוספות אינן ניתנות להסרה, והגובה הכולל של תא אחד עם מכסה הוא כמעט 11 מ"מ לעומת גובה 1 מ"מ של שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית. עם זאת, תא 8 בארות משתמש פחות מקום מאשר לוחות 4 בארות הציע לפני16.
אנו מציגים כאן תמונות שנרכשו באמצעות שני מיקרוסקופים. בעוד המיקרוסקופ הקונפוקלי הסורק נקודה מספק תמונות ברזולוציה גבוהה של רקמות בשל החלק האופטי הדק שלו, המיקרוסקופ הקונפוקלי של הדיסק המסתובב מספק זמן הדמיה מהיר יותר עם רזולוציה טובה. הסטריאוסיליה של תאי השערה הפנימיים (IHCs) ותאי השערה החיצוניים (OHCs) מומחשת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. מכיוון שהסטריאוסיליה של IHCs גדולה יותר מזו של OHCs, הם הודגמו שוב ושוב והיטב בעבודה זו. עבור סטריאוסיליה של OHC, מיקרוסקופים חלופיים אחרים יכולים לשפר את ההדמיה, כגון מיקרוסקופ ברזולוציית על (SRM). תמונות explant שנרכשו במיקרוסקופ דיסק מסתובב מספיקות לשילוב קל של ספירת תאי שיער אוטומטית באמצעות גישת למידה עמוקה12. יתר על כן, זמן הרכישה הקצר חשוב לניסויים בתאים ורקמות חיים. בנוסף, פרוטוקול זה אינו מוגבל לחצילי שבלול בילוד. עם כמה אופטימיזציות, צמחים אחרים כגון איברים שיווי משקל או רקמות עובריות יכול גם להיות בתרבית.
כימות תאי השבלול, כגון תאי שיער ונוירונים, במבחנה חשוב להערכת כדאיות התא, ולפיכך, אחוז התאים הפגומים או האבודים. חקירות של מסלולי איתות ותפקודי תאים עוזרות לחשוף את מנגנוני המוות וההישרדות. בדיקות של רקמות שבלול עובריות ויילודים שימושיות לחקר שלבי ההתפתחות של השבלול. לכן, פרוטוקול זה יסייע לייעל מחקרי מבחנה של חצילים באוזן הפנימית, למשל, כדי לבסס מודלים אוטוטוקסיים, לחקור שלבים התפתחותיים, להעריך מסלולי איתות ולבצע מחקרי סינון תרופות.

רוב המקרים של ליקוי שמיעה תחושתי-עצבי נובעים מניוון של תאי שיער חושיים, תאי עצב שמיעתיים ו/או סינפסות שמיעתיות1. תהליך ניווני זה בתאי החישה הוא פרוגרסיבי ובדרך כלל בלתי הפיך, ולכן גורם לאובדן שמיעה2. לכן, מידע על יכולת הקיום של תאי חישה ושינויים במסלולי איתות בתנאי עקה הוא חיוני להגנה על התאים מפני נזק, ולכן אובדן. חקירת צמחי השבלול בתרבית מאפשרת שחזור של קומפלקס הרקמה ושמירה על רשת תאים תקינה, המאפשרת תיאור טוב יותר של תהליכי האיתות. כדי להקים מודלים ניסיוניים של ototoxicity, אנטיביוטיקה gentamicin ואת סוכן כימותרפי cisplatin שימשו לעתים קרובות, כי הם ידועים יש תופעות לוואי ototoxic3.
מערכות תרבית חוץ גופיות של צמחי שבלול פותחו ושונו עם הזמן; עם זאת, תיאור של פרוטוקול Stepwise לתרבית של צמחי שבלול שלמים חסר לעתים קרובות במספר פרסומים. אחד מפרוטוקולי הווידאו הראשונים לתרבות הראשונית של איבר המורין של קורטי פורסם על ידי פרקר ואחרים, שבו המחברים תיארו את השלבים לבידוד האפיתל החושי, תרבית על כיסויי זכוכית, ואלקטרופורציה של צמחים לניסויי טרנספקציה4. בעבר פורסם גם פרוטוקול נוסף באמצעות כיסויי זכוכית, שבו ארגון המבנה התאי באוזן הפנימית נחשב5. פרוטוקול חלופי המשתמש בקרום מיליסל לתרבית של צמחי עכבר של איבר קורטי ואיבר שיווי המשקל דווח6. דיווחי וידאו אלה תרמו לשיפור השיטה, אך עדיין ישנם אתגרים שיש לפתור. כדי לטפל במספר בעיות הנובעות מהשימוש בכיסויי זכוכית ותוספות, הפרוטוקול הנוכחי נועד לייעל את צעדי תרבית האיברים ולגדל איברים באיכות גבוהה לקבלת נתונים אמינים. זה מושג על ידי מזעור הטיפול הישיר של האיבר במהלך הליכי הניסוי והימנעות מהעברת איברים לפני קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה של התאים החיים והקבועים.
הפרוטוקול הנוכחי מעדכן מערכות תרבות חוץ גופית שפורסמו בעבר ומציג מספר אופטימיזציות בבידוד האיבר של קורטי והעברתו לתאי התרבות, כמו גם שילוב תא שקופיות חדש לשיפור תנאי התרבות וניתוח נוסף. פרוטוקול אופטימלי זה מפחית את הסיכון לפגיעה באיבר, אשר יכול להתרחש בעת שימוש בכיסויי זכוכית במהלך השינוי הבינוני או במהלך העברת האיבר מכיסויים או ממברנות לניתוח נוסף 4,5,6. כיסויי הזכוכית הם בעלי אינדקס השתקפות טוב יותר מאלה הפלסטיים; עם זאת, הם שבירים ויכולים להישבר בקלות רבה יותר. התאים מרובי הקידוחים המשמשים כאן מחוברים לשקופית מיקרוסקופ, המתאימים היטב לתרבית איברים ולהדמיה ברזולוציה גבוהה. העברת האיברים המבודדים מתבצעת עם מרית, המאפשרת להביא את האיבר בכיוון הנכון ולהחליק לתוך החדר, במקום להפעיל כוח עם פיפטה כפי שהומלץ קודם לכן 4,5,6.
התאים מרובי הבאר המצופים בפולי-D-ליזין, אשר אמורים להכיל מדיום מספיק, מאפשרים את העברת האיברים ואת המיקום הנכון של הצמחים מבלי להפעיל לחץ דבק ותוך הימנעות מחפיפת איברים, כאמור6. בנוסף, איברים חופפים מקריים ומבנים לא אחידים נפתרים באמצעות מחסנית Z קונפוקלית. פרוטוקול זה הותאם ליישומים שונים, כגון צמחים של עכברים וחולדות, צמחים של איבר קורטי ושבלול, תרבית בתווך המכיל סרום וללא נסיוב, הערכות אוטוטוקסיות וניסויים כלליים בתגובה לתרופות. צמחי השבלול מורכבים ומודגרים בתאים עם תחתית כיסוי, המאפשרת היצמדות של צמחי השבלול לתאים לטיפול מיטבי במהלך ניסויי המבחנה , העיבוד שלאחר הצמחים וההדמיה של צמחי שבלול חיים וקבועים. הדמיה של כל אורך האיבר של קורטי ואת כימות של תאי שיער הם יעילים. בנוסף, ההערכות של התאים התומכים, תאי העצב של גנגליון ספירלי ותאי עצב מדויקות. לכן, פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח מקיף של תאי שבלול יונקים.

<table><tbody><tr><td>צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל בהירות גבוהה 17 x 120 מ"מ סגנון</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>45&deg; מלקחיים זוויתיים&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן 30 x 115 מ"מ סגנון</td><td>FALCON</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Antifade הרכבה בינונית</td><td>VECTASHIELD</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 phalloidin</td><td>Thermofisher</td><td>2151755</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-בטא III טובולין [TUJ-1]</td> <td>Abcam</td><td>ab14545</td><td></td></tr><tr><td>Antifade הרכבה בינונית עם DAPI</td><td>VECTASHIELD</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-מיוזין VII ארנב פוליקלונלי</td><td>Abcam</td><td>ab3481</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף (50x), מינוס נוגדי חמצון</td><td>Thermofisher</td><td>10889038</td><td></td></tr><tr><td>להבים כירורגיים מפלדת פחמן 23</td><td>Swann Moiton</td><td>210</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent&trade; Caspase-3/7 מגיב זיהוי ירוק</td><td>Thermofisher</td><td>C10723</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX</td><td>Thermofisher</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>מרית כפולה, קצה מעוקל אחד</td><td>VWR</td><td>RSGA038.150</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי 70% V/V 1,000 מ"ל</td><td>bichsel</td><td>160 0 106 00</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך</td><td>Thermofisher</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה מקבעת 4% פרפורמלדהיד שהוכן ב-PBS</td><td>Thermofisher</td><td>201255309/201255305</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור הלוגן קר בעוצמה גבוהה&nbsp;</td><td>Intralux&reg; &nbsp;</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>Huygens גרסה מקצועית 21.10</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Slide 8 well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>LEICA</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>LEICA</td><td>MS5</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX&trade; מחוון סופראוקסיד מיטוכונדריאלי אדום, להדמיית תאים חיים</td> תוסף <td>Thermofisher</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N2 (100x)</td><td></td>מיקרוסקופ <td>Thermofisher</td> 17502048 <td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti עם יחידה קונפוקלית של דיסק מסתובב Yokogawa CSU-W1, ומצלמת Photometrics Prime 95B.</td><td>מיקרוסקופ Nikon</td> Eclipse Ti של NIKON <td></td><td></td></tr><tr><td>עם יחידה קונפוקלית לסריקת נקודות A1</td><td>מספריים הפעלה של NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science</td><td>Tools 14005-16</td><td></td></tr><tr><td>מספריים הפעלה</td><td>Fine Science</td><td>Tools 14088-10</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td> הפעלה <td>כלי מדע עדינים</td><td>11008-15</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1x), 500 מ"ל</td><td>תרמופישר</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>פולי-די-ליזין הידרוברומיד מול WT GT 30</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7405</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>סטרי 250 סטריליזטור שני</td><td>סיימון קלר AG</td><td>&nbsp; 031100</td><td></td></tr><tr><td>סטריליזטור, כדורי ייבוש</td><td>סיימון קלר AG</td><td>31120</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 60 x 15 מ"מ</td><td></td> צלחת תרבית רקמות 353802 <td></td><td>FALCON</td></tr><tr><td>60 x 15 מ"מ</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Trito&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>מחקרי התפתחות</td><td>לא קונבנציונליים של מיוזין-VIIa</td> בנק היברידומה <td>138-1s</td><td></td></tr><tr><td>WFI לתרבית תאים[-]אנטי מיקרוביאלי, 500 מ"ל</td><td>תרמופישר</td><td>A12873-01</td><td></td></tr></tbody></table>

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

ליקוי שמיעה שאינו מטופל מטיל עלויות משמעותיות על מערכת הבריאות העולמית ופוגע באיכות החיים. ליקוי שמיעה תחושתי-עצבי מאופיין באובדן מצטבר ובלתי הפיך של תאי שיער חושיים ועצבי שמיעה בשבלול. חצילי שבלול שלמים וחיוניים הם אחד הכלים הבסיסיים בחקר השמיעה לאיתור נשירת תאי שיער ולאפיון המנגנונים המולקולריים של תאי האוזן הפנימית. לפני שנים רבות פותח פרוטוקול לבידוד שבלול בילוד, ולמרות שהוא השתנה עם הזמן, הוא עדיין טומן בחובו פוטנציאל לשיפור. 
מאמר זה מציג פרוטוקול אופטימלי לבידוד וטיפוח צמחי שבלול שלמים בילודים בתאי תרבית מרובי בארות, המאפשר לחקור תאי שיער ותאי נוירון גנגליון ספירלי לכל אורך השבלול. הפרוטוקול נבדק באמצעות צמחי שבלול מעכברים וחולדות. צמחי שבלול בריאים התקבלו כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי שיער, תאי נוירון גנגליון ספירלי והתאים התומכים שמסביב. 
אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא שהיא מפשטת את שלבי תרבית האיברים מבלי להתפשר על איכות החצילים. כל שלושת הסיבובים של האיבר של קורטי מחוברים לתחתית החדר, מה שמאפשר ניסויים במבחנה וניתוח מקיף של הצמחים. אנו מספקים כמה דוגמאות של תמונות שבלול מניסויים שונים עם צמחים חיים וקבועים, המוכיחות כי הצמחים שומרים על המבנה שלהם למרות חשיפה לתרופות אוטוטוקסיות. פרוטוקול אופטימלי זה יכול להיות בשימוש נרחב לניתוח אינטגרטיבי של שבלול היונקים.

הפרוטוקול הנוכחי נבדק על השבלול של עכברים וחולדות בילודים. מאמר זה מציג תמונות של צמחים מניסויים שונים. הצמחים של האיבר של קורטי נחשפו לגנטמיצין או ציספלטין, ונשירת תאי שיער נראתה. הצמחים של איבר קורטי שמרו על המבנה והאורך הכולל שלהם גם בתנאי עקה נורמליים וגם בתנאי עקה (איור 1 ואיור 2). תאי השערה ששרדו לכל אורכם של צמחי החולדה שנחשפו בעבר לציספלטין היו ניתנים לזיהוי בנפרד (איור 1). בנוסף לזיהוי תאי שיער ששרדו, התגלו גם תאי שיער שעברו אפופטוזיס (איור 2). גישה זו מאפשרת הדמיה וספירה של תאים שורדים, אשר ניתן לבצע באמצעות גישת למידה עמוקה, כפי שתואר קודם לכן12. אפשר היה גם לזהות את התהליכים הביולוגיים בתאי שבלול חיים באמצעות גשושיות מתאימות שחדירות לתאים (איור 3).
במקרה של צמחי שבלול המכילים נוירונים של גנגליון ספירלי, ניתן לחתוך את הצמחים לשני חלקים, או לחתוך את אזור הקודקוד כדי לספק תנאי תרבית טובים יותר. כאן בחרנו להפריד את אזור הקודקוד, מכיוון שהוא מושפע פחות בתנאי לחץ. איור 4 מראה את אזורי הבסיס והאזורים המדיאליים של צמחי השבלול. תאי שיער המסומנים בסמן תא השערה MYO7A זוהו. באופן דומה, זוהו גופי תאי גנגליון ספירליים בריאים ופגועים ונוירוטים המסומנים בסמן העצבי TuJ1. ניתוח אזורי גנגליון ספירלי יכול להתבצע באופן ידני או באמצעות תוכנות קוד פתוח כגון FIJI עם תוסף NeuronJ עבור מעקב עצבי13 או הרחבות כגון TrackMate ו Cellpose עבור סגמנטציה מורפולוגית14,15. בחינה מדוקדקת יותר של צמחי העכבר חשפה את הרזולוציה הגבוהה של תאי השבלול והסטריאוסיליה של תאי השערה (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig01.jpg"> איור 1: צמחים של איבר קורטי מחולדות שנחשפו לגנטמיצין. תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של (A) בקרה ו-(B) צמחים שנחשפו לגנטמיצין (200 מיקרומטר למשך 24 שעות). תאי השערה מסומנים בפלואידין וניתן לדמיין אותם לכל אורך השבלול. להמחשה טובה יותר, התמונה היא בגוונים אפורים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם מטרה של 20x (צמצם מספרי: 0.75). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig02.jpg"> איור 2: צמחים של איבר קורטי מעכברים שנחשפו לציספלטין. תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של (A) בקרה ו-(B) צמחים שנחשפו לציספלטין (160 מיקרומטר למשך 48 שעות). תאי השערה מסומנים בפלואידין (אדום), ותאי השערה האפופטוטיים מסומנים בפלואורסצין. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודתי ומטרה פי 20 (צמצם מספרי: 0.75). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig03.jpg"> איור 3: צמחים של האיבר של קורטי מניסויי הדמיה חיים. תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של צמחים מעכברי בר המציגות (A) צמחי ביקורת ו-(B) צמחים עם חשיפה לציספלטין של 125 מיקרומטר במשך 18 שעות. תאי השערה מסומנים במיטו-הידרואתידין ובקספאז-3. התמונות נרכשו באמצעות דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי ומטרה של פי 20 (צמצם מספרי: 0.75). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig04.jpg"> איור 4: צמחי שבלול מעכברי נוקאאוט מסוג STAT1 שנחשפו לציספלטין. תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של (A) צמחי בקרה ו-(D) צמחים שנחשפו לציספלטין של 40 מיקרומטר במשך 48 שעות. גופי תאי השערה מסומנים בנוגדן MYO7A (ירוק), ותאי הגנגליון הספירליים מסומנים בנוגדן TuJ1 (אדום) ותיוג גרעיני DAPI (כחול). התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודתי ויעד של 20x (צמצם מספרי: 0.75) עם זום נוסף של 2.15 (B,C,E,F). סרגל קנה מידה = (B,C,E,F) 50 מיקרומטר ו- (A,D) 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig05.jpg"> איור 5: איבר עכבר של צמחי קורטי. (A-D) תמונות מייצגות (הקרנה בעוצמה מרבית) של צמחים באורך מלא מעכברי בר. (א,ב) הצמחים סומנו בנוגדן MYO7A, פאלואידין ותיוג גרעיני DAPI. (B) בסקירה המוגדלת, גופי התאים של תאי השערה המסומנים בנוגדן MYO7A (ירוק) נראים בבירור. (ג,ד) פלואדין מתייג את הסטריאוסיליה ואת הצלחת הקוטיקולרית של תאי השערה. הצמחים סומנו בפלואידין. (D) בסקירה המוגדלת, תמונות מפותלות של סטריאוסיליה של תאי שיער פנימיים בודדים מזוהים היטב (שורה תחתונה), בעוד שסטריאוסיליה של תאי שיער חיצוניים בודדים קשה יותר לתיחום (שורה עליונה). התמונות בלוחות A ו- C נרכשו במיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם מטרה של 20x (צמצם מספרי: 0.75). התמונה בלוח B נרכשה באותו מיקרוסקופ אך עם מטרת אוויר פי 40 (צמצם מספרי: 0.95). התמונה בלוח D נרכשה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודתי ומטרת שמן 100x (צמצם מספרי: 1.45) עם זום נוסף של 3.46. הסריקות בוצעו בממוצע ארבע פעמים לכל קטע XY, וגודל הפיקסל היה 0.02 מיקרומטר. פסי קנה מידה = (D) 3 מיקרומטר, (B) 100 מיקרומטר ו- (A,C) 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

הפרוטוקול הנוכחי מעדכן פרוטוקולים קודמים ומשלב גישות פשוטות יחסית לגידול צמחי שבלול באיכות גבוהה. זה מספק איסוף נתונים אמין והדמיה ברזולוציה גבוהה בתאים חיים וקבועים. פרוטוקול זה תומך במגמה המתמשכת של חקר תאי האוזן הפנימית.

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

פרוטוקול זה משלב גישה פשוטה לייעול צעדי התרבית, השגת צמחים באיכות גבוהה ויתרום לחקר וחשיפת מנגנונים מולקולריים של תאי שבלול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא טיפול ישיר מינימלי באיברים על ידי תיאום שלבי הדיסקציה, ציפוי פני השטח הפולימרי המתאים, נפח בינוני אופטימלי וזמן החיבור של העציצים. טכניקה זו מייצגת גישה חוץ-גופית פופולרית לחקר ליקוי שמיעה תחושתי-עצבי.זה יכול לשמש כדי להקים מודלים ototoxic, לבצע ניתוח מבני, להעריך מסלולי איתות, ולבצע מחקרים סינון סמים. באופן עקרוני, שיטה זו יכולה לחול על רקמות שונות explants. ניתן להשתמש בו גם במחקר האוזן הפנימית כדי לקבל תובנה לגבי שלבי התפתחות עובריים.כדי להתחיל, הניחו את ראשה של החולדה הערופה על הכרית הסטרילית. השתמש מספריים ומלקחיים כדי להסיר את הלסת התחתונה, ולאחר מכן להרים את העור ולקלף אותו בחזרה מן הגולגולת. הניחו את המלקחיים בחללים המסלוליים כדי להחזיק את הגולגולת.בעזרת להב אזמל חד, חותכים בזהירות את הגולגולת לאורך תפר הקשת ולאחר מכן את אזור התפר העטרתי מבלי לפגוע בשבלול. כעת, הוציאו את המוח משני חצאי הגולגולת. תחת המיקרוסקופ, מקמו את השבלול בעצם הרקתית, ושחררו את הרקמה שמסביב בין השבלול לעצם הרקתית.לאחר מכן הניחו את המלקחיים בתעלה החצי עגולה העליונה. משכו בעדינות את העצם הרקתית מהשבלול והחזיקו את השבלול מחובר לפרוזדור עם העצם הרקתית. הכניסו את קצות המלקחיים לאזור הקודקוד הנראה כקו לבן, והסירו את קפסולת השבלול הסחוסית פיסה אחר חתיכה כדי לחשוף את צינור השבלול.מניחים את המלקחיים מתחת לשבלול, ומנתקים אותם מאיבר שיווי המשקל ומהעצם הרקתית. מעבירים את השבלול לצלחת חדשה בקוטר 60 מ"מ המכילה PBS קר כקרח. כדי לבודד את איברי קורטי העציצים, החזיקו את האיבר בבסיס ואת צינור השבלול באזור וו הבסיס, ושחררו בעדינות את צינור השבלול מהמודיולוס מבלי לקרוע אותו.לאחר מכן החזיקו את צינור השבלול בבסיס ומשכו משם את הרצועה הספירלית ואת סטריה וסקולריס. לבידוד צמחי שבלול, השתמשו במלקחיים כדי לנתק את הגנגליון הספירלי מהלמינה הספירלית האוסאוסית, ושחררו את המודיולוס במהלך הניתוק. בעזרת מלקחיים, אחוז באזור הקרס והסר את הרצועה הספירלית עם כלי הדם של הסטריה.יתר על כן, משוך את הממברנה של רייסנר חתיכה אחר פיסה. כדי להעביר את החצילים של השבלול, טבלו מרית מעבדה בצלחת המכילה את החציל. הרימו את החציל כשתאי השערה פונים כלפי מעלה יחד עם כמה מיקרוליטרים של PBS על ידי נפנוף מרית.הכניסו את החציל למגלשה בעלת שמונה בארות על ידי נפנוף עדין של המרית בתווך. הניחו לעציץ להחליק לתוך התא. באמצעות פיפטה 100 מיקרוליטר, להסיר 80 מיקרוליטר של בינוני ולהשליך אותו.בדוק את הנראות של תאי שיער ותאי נוירון גנגליון ספירלי מתחת למיקרוסקופ. במידת הצורך, השתמש במלקחיים כדי לדחוף רקמות חופפות. מוציאים את התווך שנותר מהבאר.האקספלנט ישכב כעת שטוח יותר על פני החדר. לאחר 10 שניות, פיפטה חזרה טיפה אחת או שתיים של המדיום ממש ליד explant, ואת המדיום הנותר במרחק מה כדי למנוע ניתוק explant. ודא שהצמחים אינם זזים בעת הוספת המדיום.דוגרים על התא במשך שעתיים כדי לחבר את האיברים בחוזקה לתחתית החדר. לאחר הדגירה, שואפים את המדיום. ובאמצעות פיפטה של 100 או 200 מיקרוליטר, מוסיפים בזהירות 300 מיקרוליטר של מדיום שלם טרי ומחומם מראש.התמונות המיקרוסקופיות הקונפוקליות של הדיסק המסתובב הראו כי איבר החולדה של קורטי שמר על המבנה והאורך הכולל שלו בתנאים רגילים ובתנאי סטרס. בנוסף, מיקרוסקופ קונפוקלי סורק הדגים תאי שיער ששרדו של צמחים מאיברי העכברים יחד עם תאי שיער שעברו אפופטוזיס. הפרוטוקול איפשר ניטור של מעבדים ביולוגיים בתאי שבלול חיים באמצעות גשושיות מתאימות החדירות לתאים ומיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב.התרבית של צמחי השבלול הללו משפרת את ניתוח האינטראקציה בין תאי השערה לתאי גנגליון ספירליים. תאי השערה של שתלי השבלול זוהו באמצעות סמן תאי השערה, MYO7A. באופן דומה, זוהו גופי תאי גנגליון ספירליים בריאים ופגועים באמצעות הסמן העצבי, Tuj 1.בסקירה המוגדלת, נראו גופי התאים של תאי השערה המסומנים בנוגדן MYO7A. זוהו סטריאוסיליה של תאי שיער חיצוניים, ותמונות מפותלות של סטריאוסיליה של תאי שיער פנימיים בודדים המסומנים בפלואידין. יש להקפיד במהלך ההליכים תחת המיקרוסקופ, במיוחד כאשר מפרידים את הגנגליון הספירלי מהלמינה הספירלית של בוני.יש להעביר את הצמחים השלמים וליישר אותם בזהירות. פרוטוקול זה מיטוב מחקרי מבחנה על חצילים באוזן הפנימית. התוצאות של מחקרים אלה, כגון מסלולי איתות ורעילות סמים, יכולות להנחות את התכנון של מחקרים פנימיים רחוקים יותר.

whole-neonatal-cochlear-explants-as-an-in-vitro-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

סרטון זה מדגים את התהליך לבידוד צמחי גנגליון ספירליים מהאוזן הפנימית וטיפוחם יחד עם איבר קורטי במערך מרובה אלקטרודות. גרעיני ספירלה מופקים בקפידה ונחתכים לחלקי רקמות קטנים יותר או לצמחים. צמחים אלה מתורבתים על האזור הפעיל של מערך האלקטרודות כדי לקדם צמיחה של תהליכים עצביים.

גידול נוירונים של גנגליון ספירלי מורין על מערכים מרובי אלקטרודות

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר...

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

חזירים מיניאטוריים (מיני חזירים) הם מודל אידיאלי של בעלי חיים גדולים למחקר על שתלי שבלול. ניתן להשתמש בניתוח השתלת שבלול במיני חזירים כדי לספק ראיות ראשוניות לבטיחות ולביצועים הפוטנציאליים של מערכי אלקטרודות חדשניים וגישות ניתוחיות במערכת חיה הדומה לבני אדם.

החזיר המיניאטורי: מודל חייתי גדול לחקר שתל שבלול

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

חקור תרבית אקספלנטים של שבלול לחקר אוזן פנימית ואובדן שמיעה סנסורינורלי במודל עכברוש. שיטה זו מאפשרת ניתוח מולקולרי מדויק של תאי שערה ותאי גנגליון ספירלי.

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

גלה סרטונים נוספים