צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

פרוטוקול זה משלב גישה פשוטה לייעול צעדי התרבית, השגת צמחים באיכות גבוהה ויתרום לחקר וחשיפת מנגנונים מולקולריים של תאי שבלול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא טיפול ישיר מינימלי באיברים על ידי תיאום שלבי הדיסקציה, ציפוי פני השטח הפולימרי המתאים, נפח בינוני אופטימלי וזמן החיבור של העציצים. טכניקה זו מייצגת גישה חוץ-גופית פופולרית לחקר ליקוי שמיעה תחושתי-עצבי.

זה יכול לשמש כדי להקים מודלים ototoxic, לבצע ניתוח מבני, להעריך מסלולי איתות, ולבצע מחקרים סינון סמים. באופן עקרוני, שיטה זו יכולה לחול על רקמות שונות explants. ניתן להשתמש בו גם במחקר האוזן הפנימית כדי לקבל תובנה לגבי שלבי התפתחות עובריים.

כדי להתחיל, הניחו את ראשה של החולדה הערופה על הכרית הסטרילית. השתמש מספריים ומלקחיים כדי להסיר את הלסת התחתונה, ולאחר מכן להרים את העור ולקלף אותו בחזרה מן הגולגולת. הניחו את המלקחיים בחללים המסלוליים כדי להחזיק את הגולגולת.

בעזרת להב אזמל חד, חותכים בזהירות את הגולגולת לאורך תפר הקשת ולאחר מכן את אזור התפר העטרתי מבלי לפגוע בשבלול. כעת, הוציאו את המוח משני חצאי הגולגולת. תחת המיקרוסקופ, מקמו את השבלול בעצם הרקתית, ושחררו את הרקמה שמסביב בין השבלול לעצם הרקתית.

לאחר מכן הניחו את המלקחיים בתעלה החצי עגולה העליונה. משכו בעדינות את העצם הרקתית מהשבלול והחזיקו את השבלול מחובר לפרוזדור עם העצם הרקתית. הכניסו את קצות המלקחיים לאזור הקודקוד הנראה כקו לבן, והסירו את קפסולת השבלול הסחוסית פיסה אחר חתיכה כדי לחשוף את צינור השבלול.

מניחים את המלקחיים מתחת לשבלול, ומנתקים אותם מאיבר שיווי המשקל ומהעצם הרקתית. מעבירים את השבלול לצלחת חדשה בקוטר 60 מ"מ המכילה PBS קר כקרח. כדי לבודד את איברי קורטי העציצים, החזיקו את האיבר בבסיס ואת צינור השבלול באזור וו הבסיס, ושחררו בעדינות את צינור השבלול מהמודיולוס מבלי לקרוע אותו.

לאחר מכן החזיקו את צינור השבלול בבסיס ומשכו משם את הרצועה הספירלית ואת סטריה וסקולריס. לבידוד צמחי שבלול, השתמשו במלקחיים כדי לנתק את הגנגליון הספירלי מהלמינה הספירלית האוסאוסית, ושחררו את המודיולוס במהלך הניתוק. בעזרת מלקחיים, אחוז באזור הקרס והסר את הרצועה הספירלית עם כלי הדם של הסטריה.

יתר על כן, משוך את הממברנה של רייסנר חתיכה אחר פיסה. כדי להעביר את החצילים של השבלול, טבלו מרית מעבדה בצלחת המכילה את החציל. הרימו את החציל כשתאי השערה פונים כלפי מעלה יחד עם כמה מיקרוליטרים של PBS על ידי נפנוף מרית.

הכניסו את החציל למגלשה בעלת שמונה בארות על ידי נפנוף עדין של המרית בתווך. הניחו לעציץ להחליק לתוך התא. באמצעות פיפטה 100 מיקרוליטר, להסיר 80 מיקרוליטר של בינוני ולהשליך אותו.

בדוק את הנראות של תאי שיער ותאי נוירון גנגליון ספירלי מתחת למיקרוסקופ. במידת הצורך, השתמש במלקחיים כדי לדחוף רקמות חופפות. מוציאים את התווך שנותר מהבאר.

האקספלנט ישכב כעת שטוח יותר על פני החדר. לאחר 10 שניות, פיפטה חזרה טיפה אחת או שתיים של המדיום ממש ליד explant, ואת המדיום הנותר במרחק מה כדי למנוע ניתוק explant. ודא שהצמחים אינם זזים בעת הוספת המדיום.

דוגרים על התא במשך שעתיים כדי לחבר את האיברים בחוזקה לתחתית החדר. לאחר הדגירה, שואפים את המדיום. ובאמצעות פיפטה של 100 או 200 מיקרוליטר, מוסיפים בזהירות 300 מיקרוליטר של מדיום שלם טרי ומחומם מראש.

התמונות המיקרוסקופיות הקונפוקליות של הדיסק המסתובב הראו כי איבר החולדה של קורטי שמר על המבנה והאורך הכולל שלו בתנאים רגילים ובתנאי סטרס. בנוסף, מיקרוסקופ קונפוקלי סורק הדגים תאי שיער ששרדו של צמחים מאיברי העכברים יחד עם תאי שיער שעברו אפופטוזיס. הפרוטוקול איפשר ניטור של מעבדים ביולוגיים בתאי שבלול חיים באמצעות גשושיות מתאימות החדירות לתאים ומיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב.

התרבית של צמחי השבלול הללו משפרת את ניתוח האינטראקציה בין תאי השערה לתאי גנגליון ספירליים. תאי השערה של שתלי השבלול זוהו באמצעות סמן תאי השערה, MYO7A. באופן דומה, זוהו גופי תאי גנגליון ספירליים בריאים ופגועים באמצעות הסמן העצבי, Tuj 1.

בסקירה המוגדלת, נראו גופי התאים של תאי השערה המסומנים בנוגדן MYO7A. זוהו סטריאוסיליה של תאי שיער חיצוניים, ותמונות מפותלות של סטריאוסיליה של תאי שיער פנימיים בודדים המסומנים בפלואידין. יש להקפיד במהלך ההליכים תחת המיקרוסקופ, במיוחד כאשר מפרידים את הגנגליון הספירלי מהלמינה הספירלית של בוני.

יש להעביר את הצמחים השלמים וליישר אותם בזהירות. פרוטוקול זה מיטוב מחקרי מבחנה על חצילים באוזן הפנימית. התוצאות של מחקרים אלה, כגון מסלולי איתות ורעילות סמים, יכולות להנחות את התכנון של מחקרים פנימיים רחוקים יותר.