Name: בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: למד שיטות לבדיקת תפקוד מיטוכונדריה בתנאי היפוקסיה בתאי יונקים באמצעות ספקטרומטריית מסה ומעקב איזוטופים יציבים. הפרוטוקולים מאפשרים למדוד פעילות מיטוכונדרית ללא תלות בצריכת חמצן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

האיורים המופיעים בכתב יד זה נוצרו BioRender.com. אנו אסירי תודה לאיימי ווקר על מתן משוב על מאמר זה. J.B.S. נתמך על ידי קרן וורצ'סטר למחקר ביו-רפואי Grant.

מעקב איזוטופים יציב וניתוח LC-MS למדידת פעילויות DHODH ו-SDH

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Chandel, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+generated+at+mitochondrial+complex+III+stabilize+hypoxia-inducible+factor-1alpha+during+hypoxia%3A+A+mechanism+of+O2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).</li>
<li>Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+radicals+and+hydrogen+peroxide+by+NADH-ubiquinone+reductase+and+ubiquinol-cytochrome+C+reductase+from+beef-heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>Spinelli, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarate+is+a+terminal+electron+acceptor+in+the+mammalian+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain.</a> Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox+cycle+with+complex+II+prioritizes+sulfide+quinone+oxidoreductase-dependent+H%282%29S+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435(2022).</li>
<li>Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+growth+of+cancer+cells+in+media+in+which+glucose+is+replaced+by+galactose%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%27s+Zeitschrift+f%C3%BCr+Physiologische+Chemie%22%5BJournal%5D)">On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose.</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).</li>
<li>Attardi, G., King, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+Repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
<li>Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory-deficient+human+fibroblasts+exhibiting+defective+mitochondrial+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication.</a> Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).</li>
<li>Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+auxotrophy+for+pyrimidines+of+respiration-deficient+chick+embryo+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).</li>
<li>Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+metabolism+using+LC-MS+and+isotope+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers.</a> Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).</li>
<li>Heinrich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+natural+isotope+abundance+and+tracer+impurity+in+MS-%2C+MS%2FMS-+and+high-resolution-multiple-tracer-data+from+stable+isotope+labeling+experiments+with+IsoCorrectoR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17910(2018).</li>
<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+can+shuttle+reducing+power+from+the+hypoxic+retina+to+the+O%282%29-rich+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium.</a> Cell Reports. 31 (2), 107606(2020).</li>
<li>Angebault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idebenone+increases+mitochondrial+complex+I+activity+in+fibroblasts+from+LHON+patients+while+producing+contradictory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration.</a> BMC Research Notes. 4, 557(2011).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
<li>Murphy, E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+and+mitochondrial+sodium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease.</a> Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52076(2015).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+measuring+reactive+oxygen+species+and+oxidative+damage+in+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).</li>
<li>Xiao, Y., Meierhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+hydroethidine-based+probes+reliable+for+reactive+oxygen+species+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).</li>
<li>DeBerardinis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+aerobic+glycolysis%3A+Transformed+cells+can+engage+in+glutamine+metabolism+that+exceeds+the+requirement+for+protein+and+nucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).</li>
<li>Keeley, T. P., Mann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+physiological+normoxia+for+improved+translation+of+cell+physiology+to+animal+models+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).</li>
<li>Ast, T., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+mammalian+cell+culture%3A+Are+we+repeating+the+experiment+of+Dr.+Ox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox.</a> Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).</li>
<li>Gu, C., Jun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+hypoxia+decrease+the+metabolic+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Does hypoxia decrease the metabolic rate.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 668(2018).</li>
<li>Voorde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+metabolic+fidelity+of+cancer+models+with+a+physiological+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Advances%22%5BJournal%5D)">Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium.</a> Scientific Advances. 5 (1), 7314(2019).</li>
<li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+medium+rewires+cellular+metabolism+and+reveals+uric+acid+as+an+endogenous+inhibitor+of+UMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase.</a> Cell. 169 (2), 258-272 (2017).</li>
<li>MacPherson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+T+cell+expansion+media+activate+distinct+metabolic+programs+uncoupled+from+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function.</a> Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).</li>
<li>Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+cell+culture+media+tune+mitochondrial+bioenergetics+and+drug+sensitivity+in+cancer+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models.</a> Cancers. 14 (16), 3917(2022).</li>
<li>Chan, S. W., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mtDNA+damage+using+a+supercoiling-sensitive+qPCR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach.</a> Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).</li>
<li>Doherty, E., Perl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+mass+by+flow+cytometry+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Reactive+Oxygen+Species%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress.</a> Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).</li>
<li>Birsoy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+cell+proliferation+is+to+enable+aspartate+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis.</a> Cell. 162 (3), 540-551 (2015).</li>
<li>Beigneux, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-citrate+lyase+deficiency+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ATP-citrate lyase deficiency in the mouse.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).</li>
<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
<li>Fendt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+glutamine+metabolism+is+a+function+of+the+alpha-ketoglutarate+to+citrate+ratio+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells.</a> Nature Communications. 4, 2236(2013).</li>
<li>Lee, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+studies+of+isolated+mitochondria+from+normal+and+diseased+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לדווח עליהם.

מכיוון שמחקרים חדשים מראים כי מיטוכונדריה של יונקים יכולים לתפקד מבלי לצרוך חמצן מולקולרי, יש חשיבות עליונה לחוקרים להשתמש בבדיקות אורתוגונליות, מעבר למדידות OCR, כדי לכמת במדויק את תפקוד המיטוכונדריה. כאן, ריכזנו סדרה של בדיקות שניתן להשתמש בהן כדי להעריך ישירות את הפעילויות של קומפלקס I, קומפלקס II, קומפלקס V ו- DHODH על ידי מדידת מאזן NAD+/NADH במיטוכונדריה, ניצול של קולטי אלקטרונים טרמינליים אדפטיביים, ייצור ATP, ביוסינתזה של דה נובו פירימידין ו-ROS שמקורו במיטוכונדריה. יש לציין כי בדיקות אלה מודדות באופן ישיר יותר את תפקוד המיטוכונדריה מאשר מדידות של זיהוי תווים אופטי (OCR). יתר על כן, בדיקות אלה מספקות לחוקרים דרכים פזיזות לכמת את תפקוד המיטוכונדריה במהלך היפוקסיה, שעבורן מדידות OCR אינן רלוונטיות במידה רבה בשל השימוש בפומרט כמקבל האלקטרונים הסופי המועדף. לבסוף, השיטות מבוססות ההתרבות המתוארות כאן חסכוניות יותר מניסויי רספירומטריה קלאסיים, ובכך מספקות דרך נגישה באופן נרחב לחקר תפקוד המיטוכונדריה במערכות יונקים.
ישנם שיקולים מרכזיים בעת שימוש בבדיקות אלה למדידת תפקוד המיטוכונדריה בתאים בתרבית. לגבי מבחני ההתפשטות, חשוב להתאים את מספר התאים שנזרעו לקצב ההכפלה של כל קו תא. התאים צריכים להיות נזרעים לפחות 10% מפגש עם מספיק מקום כדי לאפשר שלוש עד ארבע הכפלות כך שניתן יהיה לכמת את ההבדלים בהתפשטות. שיקול נוסף עבור כל בדיקה הוא ריכוז המולקולות הקטנות המשמשות כבקרות לפעילות של כל קומפלקס ETC. מכיוון שקווי תאים שונים עשויים להפגין רגישויות שונות למעכבים אלה, חיוני לבדוק את המינון של מולקולות קטנות אלה כדי לזהות את הריכוז האופטימלי.
מגבלה אוניברסלית של בדיקות החוקרות את תפקוד המיטוכונדריה במבחנה, כולל מדידות OCR וכל הבדיקות המתוארות כאן, היא ההרכב המטבולי של מדיום התרבית. מדיום תרביות תאים סטנדרטי נוטה להטות מערכות לרמות גבוהות באופן שטחי של תפקוד מיטוכונדריאלי. לדוגמה, רמות גלוטמין על-פיזיולוגיות מגבירות את האנפלרוזיס של מחזורTCA 25, אשר מזין סינתזת NADH מיטוכונדריאלית, וכתוצאה מכך, מגביר זרחן חמצוני. באופן דומה, הלחץ החלקי של חמצן נע בין 3 מ"מ כספית ל-100 מ"מ כספית (כ-0.1%-13% O2) ברקמות יונקים, אך הוא אטמוספרי (140 מ"מ כספית, כ-21%) במבחנה26,27. עודף O2 זה ממקסם את יכולת הנשימה המיטוכונדריאלית ואת ייצור הסופראוקסיד28. לאחרונה נעשו מאמצים לעצב את מדיית התרבות כך שתהיה פיזיולוגית יותר29,30. יש לציין כי תרבית תאים במדיה דמוית פלזמה אנושית מפחיתה את הנשימה המיטוכונדריאלית בחלק משורות התאים הסרטניים30, ROS מיטוכונדריאלי בתאי T31, והסתגלות מיטוכונדריאלית לטיפולים בסרטן32. לכן, זה קריטי להיות מודעים להרכב של מדיה תרבותית בשימוש ולהבין איך זה עשוי להשפיע על תפקוד המיטוכונדריה.
מגבלה חשובה ואוניברסלית נוספת בפענוח תפקוד המיטוכונדריה היא הפוטנציאל להבדלים במספר המיטוכונדריה. לכן, חיוני למדוד את תכולת המיטוכונדריה באמצעות כימות של mtDNA33, מדידת המסה המיטוכונדריאלית עם צבעים רגישים לפוטנציאל הממברנה34, או כתמים מערביים של סמנים מיטוכונדריאליים. זוהי בקרה קריטית כדי שלא יטעו לחשוב שירידה במספר המיטוכונדריה היא ירידה בתפקוד המיטוכונדריה.
קיימות גם מגבלות ספציפיות ופתרון בעיות החלות על הבדיקות המתוארות כאן. ראשית, בהתחשב בכך שתאים ממוינים אינם מתרבים, הבדיקות מבוססות ההתרבות לא יהיו שימושיות להערכת תפקוד המיטוכונדריה בהקשר זה. מגבלה מרכזית של פרוטוקול מעקב 13C 4-aspartate למדידת פעילות DHODH היא שספיגת אספרטט בתאים יכולה להיות מאוד לא יעילה35. כדי להתגבר על מגבלה פוטנציאלית זו, החוקרים יכולים לבטא יתר על המידה את טרנספורטר האספרטט, SLC1A3, כדי להקל על ספיגה של 13C 4-aspartate35.
מגבלה של הפרוטוקול המשתמש במעקב 13C 5-גלוטמין למדידת פעילות SDH היא שבדיקה זו דורשת מתאים לנצל את מסלול הקרבוקסילציה הרדוקטיבי כדי להעשיר את איזוטופולוגים M+3 על מנת למדוד את הפעילות ההפוכה. קווי תאים מסוימים אינם מסוגלים לשטף קרבוקסילציה רדוקטיבי עקב ביטוי ATP ציטראט ליאז נמוך36, ייצוב HIF לא מספיק 37, או יחס α-KG:ציטראט נמוך מדי38. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להשתמש במעקב 13C 4-aspartate כדי למדוד את פעילויות SDH קדימה ואחורה7. בבדיקה זו, ניתן למדוד את הפעילות קדימה של SDH על ידי היחס של fumarate M+2:succinate M+2 ואת התגובה ההפוכה על ידי succinate M+4:fumarate M+4. יש לציין כי מעקב זה עוקף את רוב האנזימים במסלול הקרבוקסילציה הרדוקטיבי.
מגבלה של בדיקת פעילות I מורכבת באמצעות הפחתת DCPIP כקריאה היא שהמיטוכונדריה אינם שלמים מבחינה מבנית. תהליך ההפשרה בהקפאה של המיטוכונדריה כדי לאפשר ספיגת NADH שלהם לבדיקה יכול בהחלט להכתים את השלמות המבנית של קרום המיטוכונדריה39. בדיקה זו צריכה להתבצע במקביל לבדיקות כגון בדיקת התפשטות I מורכבת כדי להבטיח שהשינויים בפעילות I מורכבת שנצפתה נכונים גם עם תאים שלמים.
במחקרים עתידיים, חלק מהטכניקות הללו יכולות להיות מותאמות למדידת תפקודים מיטוכונדריאליים in vivo באמצעות אורגניזמים מודל כגון עכברים ו- Caenorhabditis elegans. השיטות הנוכחיות המשמשות למדידת תפקוד המיטוכונדריה in vivo מתמקדות בזיהוי תווים אופטי (OCR) ברמת האורגניזם, במיוחד בקצב החליפין של דרכי הנשימה בעת שימוש במודלים של עכברים. מגבלה ברורה של שיטה זו היא שהחמצן משמש פונקציות ביוכימיות ואיתות רבות מעבר לתפקידו כקולט אלקטרונים טרמינליים הנמצאים בכל מקום במיטוכונדריה וכו'. לדוגמה, חמצן "נצרך" על ידי הפעילות הקטליטית של אנזימים ממשפחת הדיאוקסיגנאז. למרות שאנזימים אלה תורמים לקצב צריכת החמצן בתאים, הם אינם משתתפים, מווסתים או משקפים את תפקוד המיטוכונדריה. ניסויי רספירומטריה קלאסיים במבחנה בדרך כלל שולטים ב"OCR לא מיטוכונדריאלי", בעוד שניסויי יחס חילופי נשימה אורגניזם (RER) אינם יכולים לשלוט בכך, ומגבילים את הפרשנות של RER כמדד לתפקוד מיטוכונדריאלי in vivo. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקולים למדידת פעילות DHODH באמצעות מעקב 13 C 4-aspartate, פעילות מורכבת II באמצעות מעקב 13C5-גלוטמין, פעילות I מורכבת על מיטוכונדריה מטוהרת מרקמות, ו-ROS מיטוכונדריאלי באמצעות תרכובות ידידותיות LC-MS כגון MitoB על מנת למדוד את תפקוד המיטוכונדריה in vivo . בדיקות ישירות אלה לחקירת תפקודי מיטוכונדריה, בשילוב עם ניסויי רספירומטריה קלאסיים, מספקים לחוקרים הערכה מקיפה ומדויקת יותר של תפקוד המיטוכונדריה בתאים וברקמות של יונקים.

תפקוד המיטוכונדריה הוא מדד קריטי לבריאות התאים, שכן הוא מקיים פונקציות ביו-סינתטיות, ביו-אנרגטיות ואיתות מרכזיות בתאי יונקים1. הרוב המכריע של תפקודי המיטוכונדריה דורשים זרימת אלקטרונים דרך שרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), ושיבושים בזרימת האלקטרונים ב-ETC גורמים למחלה מיטוכונדריאלית חמורה2. ה-ETC מורכב מסדרה של תגובות חיזור וחמצון (חמצון-חיזור) המוטבעות בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי, ותגובות העברת אלקטרונים אלה משחררות אנרגיה חופשית שניתן לרתום לתמיכה בסינתזה של ATP, תהליכים פיזיולוגיים כגון תרמוגנזה, מסלולים ביוסינתטיים כגון ביוסינתזה של פירימידין דה נובו, ואיזון מצב החיזור של קו-פקטורים כגון NADH. קומפלקס ETC I ו- III מייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS)3,4,5, אשר, בתורם, מווסתים מסלולי איתות מרכזיים כגון HIF, PI3K, NRF2, NFκB ו- MAPK 6. כתוצאה מכך, מדדים של זרימת אלקטרונים ב-ETC משמשים באופן קלאסי כפרוקסי לתפקוד מיטוכונדריאלי בתאי יונקים.
ניסויי רספירומטריה משמשים לעתים קרובות למדידת תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים. מכיוון ש-O2 הוא מקבל האלקטרונים הסופיים הנפוץ ביותר עבור היונקים ETC, ההפחתה שלו משמשת כפרוקסי לתפקוד המיטוכונדריה. עם זאת, ראיות חדשות מראות כי מיטוכונדריה של יונקים יכולים להשתמש בפומרט כמקבל אלקטרונים כדי לקיים תפקודים מיטוכונדריאליים התלויים ב-ETC, כולל ביוסינתזה של דה נובו פירימידין 7, חמצון NADH7 וניקוי רעלים של מימן גופרתי 8. לכן, בהקשרים מסוימים, במיוחד בסביבות היפוקסיות, מדידות של שיעור צריכת O2 (OCR) אינן מספקות אינדיקציה מדויקת או מדויקת לתפקוד המיטוכונדריה.
כאן, אנו מתארים סדרה של בדיקות שניתן להשתמש בהן כדי למדוד את תפקוד המיטוכונדריה ללא תלות ב- OCR. אנו מספקים בדיקות למדידה ישירה של חמצון NADH מורכב בתיווך I, ביוסינתזה של דיהידרורוט דהידרוגנאז בתיווך דה נובו פירימידין, סינתזת ATP מורכבת תלוית V, כיווניות נטו של קומפלקס סוקצינאט דהידרוגנאז (SDH) ו-ROS שמקורו במיטוכונדריה. בדיקות אלה נועדו להתבצע על תאי יונקים בתרבית, אם כי רבים מהם יכולים להיות מותאמים לחקר תפקודים מיטוכונדריאליים in vivo. יש לציין כי הבדיקות המתוארות בפרוטוקול זה הן מדידות ישירות יותר של תפקודי מיטוכונדריה מאשר OCR. יתר על כן, הם מאפשרים מדידה של תפקוד מיטוכונדריאלי בהיפוקסיה, הקשר שבו OCR אינו מדידה אינדיקטיבית. יחד, בדיקות אלה, בשילוב עם ניסויי רספירומטריה קלאסיים, יספקו לחוקרים הערכה מקיפה יותר של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; צינור 1.5 מ"ל</td><td>טיפול בתא</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>צינור 2.0 מ"ל</td><td>טיפול בתא</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>טיפול בתא</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12 צלחת</td><td>טיפול תאים</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C4-aspartate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-Glutamine</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>טיפול בתא</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל Cell</td><td>Treat 667421</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 150 מ"מ</td><td>Cell Treat 229651</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x תמיסת מלח חוצצת פוספט</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6- דיכלורופנולינדופנול</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום קרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>אנטימיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>מסנן בקבוק עליון 500 מ"ל, 0.22 ומיקרו; m, PES 9 9 מ"מ קוטר ממברנה</td><td>טיפול בתא</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr>מרים תאים, <td>טיפול בתאי</td><td>להב שטוח וצר בקצה כפול</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 מלכודת קרה</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז שלם טבליות</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>כוסות נגד קולטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>דצילוביקווינון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf צנטריפוגה 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>גלקטוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>ללא גלוקוז</td><td>DMEM Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>ללא גלוטמין DMEM</td><td>תרמו פישר</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מומת בחום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPLC כיתה 35% אמוניום הידרוקסיד</td><td>Thermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td> בדרגת HPLC <td>900667</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>בדרגת</td> HPLC 366927 <td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית בדרגת HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>בדרגת</td> HPLC 563935 <td></td></tr><tr>MeOH <td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>בדרגת HPLC</td><td></td>900688</tr><tr><td>מים בדרגת HPLC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים אוסטאוסרקום אנושי 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>320331-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מאגר איזוטוני</td><td>בקמן קולטר</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>מניטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox אדום</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>אוליגומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>מטחנת רקמות Potter-Elvehjem, גודל 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>מדיה DMEM נטולת פירובט</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus ספקטרומטר מסה</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver חממה</td><td>אופה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקורר Centrivap ספסל ואקום רכז</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu; M 150 x 2.1 mm טור אנליטי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שומר SeQuant ZIC-pHILIC</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד, כדורי</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טרט-בוטיל הידרופרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 קולטר ספירת חלקיקים וגודל מנתח</td><td>בקמן קולטר</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

זרימת האלקטרונים בשרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה (ETC) תומכת בפונקציות ביו-סינתטיות, ביו-אנרגטיות ואיתות רב-פנים בתאי יונקים. מכיוון שחמצן (O 2) הוא מקבל האלקטרונים הסופניים הנפוץ ביותר עבור יונקים ETC, קצב צריכת O2 משמש לעתים קרובות כפרוקסי לתפקוד המיטוכונדריה. עם זאת, מחקרים חדשים מראים כי פרמטר זה אינו תמיד מעיד על תפקוד מיטוכונדריאלי, שכן ניתן להשתמש בפומרט כמקבל אלקטרונים חלופי כדי לקיים תפקודים מיטוכונדריאליים בהיפוקסיה. מאמר זה אוסף סדרה של פרוטוקולים המאפשרים לחוקרים למדוד את תפקוד המיטוכונדריה ללא תלות בקצב הצריכה של O2. בדיקות אלה שימושיות במיוחד כאשר חוקרים תפקוד מיטוכונדריאלי בסביבות היפוקסיות. באופן ספציפי, אנו מתארים שיטות למדידת ייצור ATP מיטוכונדריאלי, ביוסינתזה של דה נובו פירימידין, חמצון NADH על ידי קומפלקס I, וייצור סופראוקסיד. בשילוב עם ניסויי רספירומטריה קלאסיים, בדיקות אורתוגונליות וחסכוניות אלה יספקו לחוקרים הערכה מקיפה יותר של תפקוד המיטוכונדריה במערכת העניין שלהם.

ניתן להעריך את הפעילויות של DHODH, קומפלקס I ו- V מורכב באמצעות מבחני התפשטות. עם מניעת אורידין ממדיום התרבית, התאים הופכים תלויים יותר במסלול דה נובו לביוסינתזה של פירימידין. לכן, כאשר תאים אותגרו להתרבות בתווך נטול אורידין, הם היו רגישים יותר לעיכוב פעילות DHODH על-ידי ברקינר מאשר תאים שגודלו בתווך המכיל אורידין (איור 6A). באופן דומה, שלילת פירובט ממדיום התרבית הופכת את התאים לתלויים יותר בפעילות I מורכבת לצורך התפשטות. לכן, כאשר תאים אותגרו להתרבות בתווך נטול פירובט, הם היו רגישים יותר לעיכוב של פעילות קומפלקס I על-ידי רוטנון מאשר תאים שגודלו בתרבית בתווך המכיל פירובט (איור 6B). ניתן להעריך את פעילות קומפלקס V על ידי אתגר תאים להתרבות בתווך המכיל גלקטוז במקום גלוקוז. מכיוון שגלקטוז מניב אפס ATP נטו בגליקוליזה, תאים הגדלים בדלק זה מסתמכים יותר על סינתזת ATP מיטוכונדריאלית באמצעות פעילות V מורכבת. לפיכך, תאים שהתרבו בתווך המכיל גלקטוז היו רגישים יותר לעיכוב V מורכב על-ידי אוליגומיצין מאשר תאים שהתרבו בתווך המכיל גלוקוז (איור 6C).
ניתן למדוד את פעילות SDH באמצעות מעקב 13C 5-גלוטמין ועל ידי ניטור שילובו באיזוטופולוגים fumarate ו- succinate. בתנאים שטופלו ברכב, קומפלקס SDH העדיף את הפעילות קדימה, והשילוב של 13 C 4-succinate לתוך 13 C4-fumarate היה גבוה יותר מאשר שילוב של 13 C 3-fumarate לתוך 13C 3-succinate (איור 7). בתנאים שטופלו באנטימיצין, קומפלקס SDH העדיף את הפעילות ההפוכה, והשילוב של 13 C 3-fumarate לתוך 13 C3-succinate היה גדול יותר מאשר שילוב של 13 C 4-succinate לתוך 13C 4-fumarate (איור 7).
ניתן למדוד את ייצור הסופראוקסיד בתוך המיטוכונדריה באמצעות כתב הפלואורסצנטי MitoSox, אשר מייצר 2-הידרוקסי-מיטואתידיום בתגובה עם סופראוקסידיום. במחקר זה, תאים שטופלו במיטוסוקס בנוכחות טרטבוטיל מי חמצן היו רמות גבוהות יותר של 2-הידרוקסי-מיטואתידיום באופן שדוכא על-ידי תוספת של NAC, נוגד חמצון שמרווה ROS תאי (איור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> איור 1: הבסיס המכניסטי לבדיקת התפשטות V המרוכבת. חמצון גלוקוז וגלקטוז באמצעות גליקוליזה. גלוקוז מניב נטו שני ATP מגליקוליזה, בעוד שגלקטוז מניב אפס ATP נטו מכיוון שסינתזת UTP נדרשת עבור UDP-גלקטוז. לפיכך, תאים הגדלים בגלקטוז תלויים יותר בסינתזה של ATP מיטוכונדריאלי בשל מחסור ב- ATP המיוצר מגליקוליזה. קיצורים: GALK = galactokinase; GALT = גלקטוז-1-פוספט uridylyltransferase; PGM1 = phosphoglucomutase 1; GPI = גלוקוז-6-פוספט איזומראז, UGP = UDP-גלוקוז pyrophosphorylase; GALE = UDP-גלקטוז-4-אפימראז; NDK = נוקלאוטיד דיפוספט קינאז; UMPK = אורידין מונופוספט קינאז; HK = hexokinase; PFK = phosphofructokinase; ALDO = aldolase; TPI = איזומראז טריוזפוספט; GAPDH = גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז; PGK = פוספוגליצראט קינאז; PGM = phosphoglucomutase; ENO = אנולאז; PK = פירובט קינאז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> איור 2: הבסיס המכניסטי לבדיקת ההתפשטות המורכבת I. סכמטי של המסלולים המטבוליים המשתנים עם עיכוב פעילות I מורכבת. במדיה עתירת פירובט, מעכב קומפלקס I נעקף באמצעות חמצון NADH בתיווך LDH. במדיה עם מעט פירובט, הסתגלות זו פחות אפשרית, מה שהופך את התאים לתלויים יותר בפעילות I מורכבת כדי לחמצן מחדש NADH. קיצורים: LDH = dehydrogenase לקטט; מחזור TCA = מחזור חומצה טריקרבוקסילית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> איור 3: סכמטיות של תגובת DHODH במעקב 13C 4-aspartate. Brequinar מעכב חמצון dihydroorotate כדי orotate, ובכך מונע את הסינתזה במורד הזרם של UMP. 13C 4-aspartate משולב לתוך 13C3-UMP באמצעות פעילות DHODH. קיצורים: OMM = קרום מיטוכונדריאלי חיצוני; IMM = קרום מיטוכונדריאלי פנימי; DHODH = dihydroorotate dehydrogenase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> איור 4: מדידת פעילות מורכבת II קדימה ואחורה באמצעות מעקב 13C 5-גלוטמין. כדי למדוד קדימה פעילות מורכבת II (משמאל), שילוב של 13 C 5-גלוטמין לתוך 13 C 4-succinate ו 13C 4-fumarate מנוטר. כדי למדוד פעילות II מורכבת הפוכה (מימין), מנוטר שילוב של 13 C 5-גלוטמין לתוך 13 C 3-succinate ו- 13C 3-fumarate. קיצורים: SDH = succinate dehydrogenase; CytC = cytochrome C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> איור 5: תגובת MitoSox Red עם סופראוקסיד. התגובה של MitoSox עם סופראוקסידים מיטוכונדריאליים ליצירת 2-OH-MitoE2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> איור 6: בדיקות מבוססות התפשטות למדידת תפקוד מיטוכונדריאלי (A) התפשטות של תאי אוסטאוסרקומה 143B שטופלו בברקינר 5 uM, מעכב DHODH, בתווך עם ±100 מ"ג/מ"ל אורידין. הנתונים הם ± SEM; N = 3 לכל תנאי. (B) התפשטות של תאי אוסטאוסרקומה 143B שטופלו ברוטנון 2 uM, מעכב קומפלקס I, בתווך עם פירובט של ±5 מילימטר. הנתונים הם ± SEM; N = 3 לכל תנאי. (C) התפשטות של תאי אוסטאוסרקומה 143B שטופלו באוליגומיצין 5 uM, מעכב V מורכב, בתווך עם גלוקוז של 10 מילימטר או גלקטוז של 10 מילימטר כמקור הפחמן המרכזי היחיד. הנתונים הם ± SEM; N = 3 לכל תנאי. * מציין p &lt; 0.05 באמצעות בדיקת ANOVA חד-כיוונית בפריזמת Graphpad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> איור 7: מעקב אחר 13C 5-גלוטמין למדידת פעילות II מורכבת. חמצון סוקצינאט והפחתת פומרט (SDH הפוך) ב-DMSO ובתאי Caki1 ו-DLD1 שטופלו באנטימיצין ב-A ב-500 ננומטר. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM; N = 3 לכל תנאי. מציין p &lt; 0.05 באמצעות מבחן t לא מזווג ב- GraphPad Prism. קיצורים: SDH = חמצון סוקצינאט; SDH הפוך = הפחתת fumarate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> איור 8: בדיקת MitoSox מבוססת LCMS לזיהוי סופראוקסיד. כרומטוגרמת יונים מחולצת של 2-OH-Mito E2+ שבודדה מתאי Caki1 שטופלו ב-MitoSox במשך 30 דקות בנוכחות tBuOOH ±-NAC. קיצורים: LCMS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה; NAC = N-אצטיל ציסטאין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: הרכב ריאגנטים, מאגרים ומדיה המשמשים בפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

המחקר שלנו מתמקד באופן שבו מיטוכונדריה חשים ומסתגלים לגורמי עקה מטבוליים. גורם עקה מטבולי מרכזי אחד הוא היפוקסיה, המתרחשת כאשר תאים מורעבים מחמצן. אנו מפתחים בדיקות טובות יותר לחקר תפקוד המיטוכונדריה בסביבות דלות חמצן.ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה יותר שימשה לחקר רמות מטבוליטים של תאים ורקמות. השתמשנו במחקרי מעקב אחר איזוטופים יציבים כדי לעקוב אחר גורלם של מטבוליטים ספציפיים ולחשוף מסלולים מטבוליים חדשים הרלוונטיים לפיזיולוגיה של יונקים בריאים וחולים. הקבוצה גילתה כי מיטוכונדריה של יונקים יכולים לקיים תפקודים קריטיים בסביבות דלות חמצן.מבחינה מכניסטית, הם משתמשים בפומרט כשרביט אלקטרוני חלופי לשרשרת הובלת האלקטרונים. פרוטוקול זה אוסף מספר בדיקות שחוקרים יכולים להשתמש בהן כדי להעריך טוב יותר את תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים. חשוב לציין, פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לחקר תפקוד המיטוכונדריה בהיפוקסיה, מכיוון שניסויי רספירומטריה קלאסיים לא יספיקו.

oxygen-independent-assays-to-measure-mitochondrial-function-in-mammals

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca...

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

השוואה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות מניבה מידע רב ערך על מצב התא. מתוארים שלבים מפורטים לבידוד מיטוכונדריה והערכת תגובה למעכבים ומנתקים באמצעות פלואורסצנטיות. השיטה והתועלת של פרוטוקול זה מומחשות על ידי שימוש בתרבית תאים ומודל בעלי חיים של מתח תאי.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

השיטות המוצגות מספקות הוראות שלב אחר שלב לביצוע אוסף של בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרו-צלחת באמצעות מיטוכונדריה מבודדת מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר. מבחנים אלה מסוגלים למדוד שינויים/התאמות מכניסטיות בצריכת החמצן המיטוכונדריאלית במודל נפוץ של בעלי חיים.

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

פיתחנו פרוטוקול מעשי וגישה אנליטית להערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי ויכולת העברת אלקטרונים בהומוגנטים של גידול טרי. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לסקור פונקציות מיטוכונדריאליות שונות התורמות ייזום סרטן, התקדמות, תגובה לטיפול.

קביעה אנליטית של תפקוד מיטוכונדריאלי של הומוגנטים של גידול מוצק מובחר

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג 'ל agarose פיגור.

פרוטאין tRNA Agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה

למד שיטות לבדיקת תפקוד מיטוכונדריה בתנאי היפוקסיה בתאי יונקים באמצעות ספקטרומטריית מסה ומעקב איזוטופים יציבים. הפרוטוקולים מאפשרים למדוד פעילות מיטוכונדרית ללא תלות בצריכת חמצן.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

גלה סרטונים נוספים