Name: יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: חקור יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי מקווי תאים סרטניים תלויי-תליה לחקר תפקיד המיטוכונדריה בהתקדמות סרטן. שיטה זו מאפשרת לבחון את השפעת הגנוטיפ המיטוכונדריאלי על אגרסיביות התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענק מספר PID2019-105128RB-I00 ל- RSA, JMB ו- AA, ו- PGC2018-095795-B-I00 ל- PFS ו- RML, שניהם מומנו על ידי MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ומספרי מענקים B31_20R (RSA, JMA ו- AA) ו- E35_17R (PFS ו- RML) ומומנו על ידי Gobierno de Aragón. העבודה של RSA נתמכה על ידי מענק של Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. המחברים מבקשים להכיר בשימוש ב-Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

הערה: כל מדיית התרבות והרכבי החיץ מפורטים בטבלה 1. לפני יצירת ציבריד יש להקליד פרופילי דנ"א מיטוכונדריאלי וגרעיני מתאי התורם והמקבל כדי לאשר את קיומם של הבדלים גנטיים בשני הגנומים בין שורות התא. במחקר זה נעשה שימוש בקו תאי L929 זמין מסחרית וקו התאים הנגזר ממנו, L929dt, שנוצר באופן ספונטני במעבדה שלנו (ראו13 למידע נוסף). קווי תאים אלה מציגים שני הבדלים ברצף הגן mt-Nd2 שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאשר את טוהר mtDNA לאחר השלמת תהליך cybridization13. במקרה זה, טוהר הרקע הגרעיני אושר על ידי רגישות לאנטיביוטיקה, שכן, בניגוד לתאי L929dt, L929 היו עמידים לגנטיקה.
1. דלדול מיטוכונדריאלי על ידי טיפול רודאמין 6G (תאים מקבלים)
הערה: הצעד הראשון ליצירת ציבריד מוצלח הוא ביטול מוחלט ובלתי הפיך של תפקודי המיטוכונדריה בתאים המקבלים. לשם כך, יש צורך לקבוע בעבר, עבור כל קו התא, את הריכוז המתאים ואת משך הטיפול עם רודאמין 6G. ריכוז נאות זה צריך להיות מעט מתחת למוות תאי הנגרם על ידי תרופות (הגבוה ביותר שאינו הורג את התאים במהלך הטיפול). בצע את הפעולות הבאות לאחר הגדרת התנאים האופטימליים.
<ol><li>זרעו 106 תאים בצלחת של 6 בארות באמצעות מדיום תרבית שלם (ראו טבלה 1 לפרטים) וטפלו בהם מדי יום עם הריכוז האופטימלי של רודמין 6G במשך 3-10 ימים, בהתאם לקו התא. ריכוזים מסורתיים נעים בין 2 ל 5 מיקרוגרם / מ"ל במשך 3-10 ימים20,21. במחקר זה, עבור תאים שמקורם ב-L929, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל רודאמין 6G במשך 7 ימים היה הטיפול שנבחר13,22.</li>
	<li>כדי לשמור על התאים בחיים, להשלים את מדיום תרבית התאים עם 50 מיקרוגרם / מ"ל של אורידין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של פירובט ולחדש אותו כל 24 שעות.</li>
	<li>לאחר הטיפול ולפני האיחוי, לשנות את התווך של תאים שטופלו ברודמין 6G כדי להשלים את תרבית התאים מדיום ללא רודאמין 6G, ולהשאיר אותם בתווך זה במשך 3-4 שעות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2. הערה: ההשפעה הרעילה של רודמין 6G היא בלתי הפיכה, ותאים עם מיטוכונדריה לא מתפקדים לא אמורים להתאושש20. לכן, לאחר הטיפול, תאים שאינם מקבלים מיטוכונדריה פונקציונלית צריכים למות אפילו בתווך תרבית בתוספת אורידין. לכן, אין צורך בברירה גרעינית. עם זאת, מומלץ לבצע איחוי מבוקר של תאים שטופלו ברודקמין 6G ללא מיטוכונדריה.</li>
</ol>2. הרחבה ובידוד מיטוכונדריאלי (תאי תורם)
<ol><li>הרחיבו את תאי תורם המיטוכונדריה במהלך פרק הזמן של הטיפול ברודמין 6G כדי להשיג סביב 25 x 106 תאים.</li>
	<li>ביום השביעי, קצרו תאים הגדלים באופן אקספוננציאלי בצינור של 50 מ"ל ואספו אותם באמצעות צנטריפוגה במהירות של 520 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את התאים 3x במי מלח חוצצי פוספט קר (PBS) ושקעו אותם בצנטריפוגה במהירות של 520 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. מעתה ואילך, בצע את כל השלבים של מיצוי מיטוכונדריאלי ב 4 ° C, באמצעות ריאגנטים קרים ושמירה על צינורות עם תאים או מיטוכונדריה על קרח.</li>
	<li>לאחר הצנטריפוגה השלישית, יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי שאיפה באמצעות פיפטה מזכוכית המוצמדת למשאבת ואקום ולהשהות מחדש את התאים הארוזים בנפח של חיץ היפוטוני השווה לפי 7 מנפח כדורי התא. לאחר מכן, להעביר את תרחיף התא לתוך צינור homogenizer ולתת לתאים להתנפח על ידי דגירה אותם על קרח במשך 2 דקות.</li>
	<li>שברו את קרומי התא על ידי ביצוע 8 עד 10 פעימות בהומוגנייזר המחובר למזיק מונע מנוע המסתובב ב-600 סל"ד. הערה: השלב של הפרעה בקרום התא עשוי להשתנות בין סוגי תאים; לכן, זה צריך להיות מותאם עבור כל סוג התא.</li>
	<li>הוסף את אותו נפח של חיץ היפרטוני לתרחיף התא (פי 7 מנפח כדורי התא) כדי ליצור סביבה איזוטונית.</li>
	<li>מעבירים את ההומוגנאט לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגות אותו ברוטור קבוע ב 1,000 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, אספו רק 3/4 מהסופרנאטנט שמשאיר שוליים גדולים מהכדורית, כדי למנוע זיהום בגרעין או בתאים שלמים, והעבירו אותו לצינור אחר. חזור על אותו תהליך פעמיים. שימו לב שיש לשמור את הסופרנאטנט ולהשליך את הכדור.</li>
	<li>שמור את החלק המיטוכונדריאלי (supernatant). העבר אותו לצינורות 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות מרבית (18,000 x גרם) למשך 2 דקות ב- 4 ° C.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה המועשרת במיטוכונדריה עם חיץ A, תוך שילוב התוכן של שני הצינוריות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 2.7. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.</li>
	<li>בצע שטיפה נוספת עם 300 μL של חיץ A וכמת את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות בדיקת ברדפורד23. עבור כל בדיקת cybridization, יש לקבוע את הכמות האופטימלית של מיטוכונדריה עבור הליך ההעברה (במקרה שלנו, ריכוז בין 10-40 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לכל 106 תאים).</li>
	<li>במקביל, הכינו את התאים המטופלים ברודמין 6G לאיחוי על ידי איסופם בצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 520 x גרם למשך 5 דקות ב- RT. שים לב שהגלולה מקבלת צבע ורוד ניאון עקב טיפול ברודמין 6G.</li>
	<li>כדי להבטיח שגם ביטול תפקוד המיטוכונדריה בתאי הקולטן וגם טיהור אברונים מתורמים בוצעו כראוי, זרעו מספר קטן של תאים שטופלו ברודמין 6G ובודדו מיטוכונדריה באמצעות מדיום התרבית המלא בצלחת של 6 בארות ותרבו אותם במשך חודש כדי לבדוק שלא נותרו תאים ששרדו באף אחת מהבארות (איור 2).</li>
	<li>במקביל, להעריך את היעדר מזהמי גרעינים בחלק המיטוכונדריאלי על ידי זיהוי חיסוני של חלבונים גרעיניים (כלומר, למין בטא, היסטון H3 וכו ') או על ידי הגברה כמותית של תגובת שרשרת פולימראז (qPCR) של גן גרעיני (כלומר, SDH, 18S rRNA, וכו '). הערה: כדי למנוע זיהומים, מומלץ לבצע את כל השלבים בתנאים אספטיים בעבודה תחת מכסה מנוע זרימה למינרית.</li>
</ol>3. היתוך ויצירת סייבריד
<ol><li>כדי להמשיך עם האיחוי, הוסיפו בזהירות 106 תאים שטופלו ברודמין 6G לגלולת המיטוכונדריה המבודדת (10-40 מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי) וצנטריפוגה ב 520 x גרם למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתערבב עם המיטוכונדריה.</li>
	<li>הוסף 100 μL של פוליאתילן גליקול (PEG, 50%) והשהה בעדינות את הגלולה למשך 30 שניות. לאחר מכן, לאפשר לנוח ללא פגע עוד 30 שניות.</li>
	<li>לבסוף, מעבירים את התערובת לצלחת בת 6 בארות עם מדיום תרבית תאים שלמה טרייה ומניחים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2. לאחר כמה ימים (בדרך כלל שבוע אחד), ציברידים טרנסוכונדריאליים אמורים להתחיל לגדול (איור 2), מה שמוליד שיבוטים שניתן לבחור בנפרד או לערבב בבריכה לפני הניתוח שלהם.</li>
</ol>4. אימות הרקע המיטוכונדריאלי והגרעיני
הערה: לאחר שקו התאים החדש התבסס והתאים מתחילים לגדול באופן אקספוננציאלי, יש לאמת את טוהר הדנ"א המיטוכונדריאלי והגרעיני שלהם. לפיכך, קווי התאים המקוריים צריכים להכיל מוטציות או פולימורפיזמים שונים בתוך הגנום שלהם כדי להפוך אותם לניתנים לזיהוי.
<ol><li>בידוד DNA מוחלט<ol><li>לבודד את הדנ"א הגנומי של כל קווי התאים המשמשים לייצור ציבריד על ידי שימוש בערכת מיצוי DNA גנומית מסחרית (ראה טבלת חומרים) או על ידי ביצוע פרוטוקול סטנדרטי באמצעות מיצוי אלכוהול פנול-כלורופורם-איזואמיל ומשקעים אלכוהוליים24.</li>
	</ol></li>
	<li>הערכת mtDNA (איור 3) הערה: ניתן לבצע מספר טכניקות, כגון ריצוף, ניתוח פולימורפיזם אורך מקטע הגבלה (RFLP), או qPCR ספציפי לאלל, כדי לנתח את טוהר mtDNA. כדי לאשר את נוכחותם של וריאציות רצף mtDNA על ידי RFLP, בצע את שלבי הפרוטוקול הבאים.<ol><li>להגביר מקטע mtDNA המכיל את שינוי הנוקלאוטידים על ידי PCR.<ol><li>כאן, תאי L929dt מציגים מוטציה mtDNA במיקום 4206, בתוך גן mt-Nd2 (m.4206C>T) שחסר בתאי L929. כדי לאשר את נוכחותו של תחליף זה בציברידים הטרנסוכונדריאליים, להגביר קטע 397 bp על ידי PCR באמצעות פרוטוקול סטנדרטי ואת הפריימרים הבאים: 1) 5'-AAGCTATCGGG CCCATACCCCG-3' (עמדות 3862-3884) ו-2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (עמדות 4236-4258).</li>
		</ol></li>
		<li>לנתח את נוכחותו של החלפת הנוקלאוטידים הרצויה על ידי RFLP, באמצעות אנדונוקלאז ספציפי המזהה את שינוי הרצף ומייצר דפוס חיתוך שונה עבור שני קווי התא. הערה: כאשר קיים וריאנט mtDNA L929dt (4206T), האמפליקון המתקבל בשלב 4.2.1 מכיל שני אתרי הגבלה עבור SspI (ראה טבלת חומרים) המייצרים שלושה מקטעי DNA של 306 bp, 52 bp ו- 39 bp. אתר ההגבלה שמייצר את התדרים 52 ו-39 משתבש כאשר קיימת גרסת ה-Wild-type (WT) C4206, ומופיעה להקה חדשה של 91 bp. לכן, בקרה פנימית לעיכול מלא עבור SspI נכלל בניתוח. תגובת העיכול מבוצעת ב 37 מעלות צלזיוס, בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>הפרידו את מקטעי ההגבלה על ידי אלקטרופורזה והשוו את תבנית הפס.<ol><li>לאחר ביצוע העיכול, נתח את קטעי ההגבלה המתקבלים על ידי אלקטרופורזה בג'לים 10% polyacrylamide-Tris-borate-EDTA (TBE) (ראה טבלה 1 עבור הרכב TBE 1x). הפעל את האלקטרופורזה ב- 80 V למשך שעה אחת ב- RT. דמיין את מקטעי ה- DNA לאחר צביעת ג'ל בתמיסה של אתידיום ברומיד ב- 1x TBE למשך 15 דקות ב- RT (ראה טבלה 1 להרכב תמיסת צביעת ג'ל).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>גנוטיפ DNA גרעיני הערה: גנוטיפ DNA גרעיני חייב להתבצע באמצעות דגימת מיצוי ה- DNA הקודמת ששימשה לניתוח RFLP.<ol><li>הגבר 16 אתרים (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 ו- AMEL) באמצעות מאגר של אוליגונוקלאוטידים ספציפיים למסחר (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>לבצע אלקטרופורזה באמצעות מנתח גנטי על מנת להפריד את השברים שהתקבלו בעבר. הערה: לאחר הגברתם, המוקדים השונים מנותחים על ידי אלקטרופורזה באמצעות מערכת קפילרית (ראה טבלת חומרים). השברים מופרדים בקפילר באורך 50 ס"מ המלא בפולימר מסחרי. מאגרי קתודה ואנודה זמינים גם הם באופן מסחרי, כפי שמוצג בטבלת החומרים. אלקטרופורזה מבוצעת ב 19.5 kV במשך 20 דקות ב 60 ° C.</li>
		<li>השתמש בכלים ביואינפורמטיים כדי לקבוע את האללים המתאימים לכל מוקד מוגבר (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>השוו את הנתונים שהתקבלו בשלב 4.3.3 עם מסד הנתונים של פרופיל הדנ"א הגרעיני (טבלה 1), כדי לבדוק אם פרופיל הדנ"א הגרעיני תואם לפרופיל קו התא של קולטן המיטוכונדריה (איור 4).</li>
	</ol></li>
</ol>

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי מתאי סרטן הגדלים בתרחיף

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

מאז שאוטו ורבורג דיווח כי תאים סרטניים משנים את חילוף החומרים שלהם ומעצימים "גליקוליזה אירובית"3,4 תוך הפחתת הנשימה המיטוכונדריאלית, העניין בתפקיד המיטוכונדריה בטרנספורמציה ובהתקדמות סרטן גדל באופן אקספוננציאלי. בשנים האחרונות, מוטציות ב- mtDNA ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה הונחו כסימני היכר של סוגי סרטן רבים25. עד כה, מחקרים רבים ניתחו את השונות mtDNA של גידולים ספציפיים 6,26,27,28,29,30,31,32...

תכנות מחדש של מטבוליזם אנרגיה הוא סימן ההיכר של סרטן1 שנצפה לראשונה על ידי אוטו ורבורג בשנות השלושים2. בתנאים אירוביים, תאים נורמליים ממירים גלוקוז לפירובט, שמייצר אצטיל-CoA, מתדלק את המנגנון המיטוכונדריאלי ומקדם נשימה תאית. עם זאת, ורבורג הראה כי גם בתנאים נורמוקסיים, רוב התאים הסרטניים ממירים פירובט המתקבל מתהליך הגליקוליזה ללקטט, ומשנים את דרכם להשגת אנרגיה. התאמה מטבולית זו ידועה בשם "אפקט ורבורג" ומאפשרת לחלק מתאי הסרטן לספק את דרישותיהם האנרגטיות לגדילה וחלוקה מהירה, למרות ייצור ATP ביעילות פחותה מהתהליך האירובי 3,4,5. בעשורים האחרונים, עבודות רבות תמכו במשמעות של תכנות מחדש של חילוף החומרים בהתקדמות הסרטן. לפיכך, אנרגיית הגידול נחשבת למטרה מעניינת נגד סרטן1. כמרכז מרכזי בחילוף חומרים אנרגטי ובאספקת מבשרים חיוניים, מיטוכונדריה ממלאים תפקיד מפתח בהסתגלויות התאים הללו, שעד היום אנו מבינים רק באופן חלקי.
בהתאם לאמור לעיל, מוטציות DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) הוצעו כאחד הגורמים האפשריים לתכנות מחדש מטבולי זה, אשר עלול להוביל לפגיעה בביצועי שרשרת הובלת אלקטרונים (ETC)6 ויסבירו מדוע תאים סרטניים מסוימים משפרים את חילוף החומרים הגליקוליטי שלהם כדי לשרוד. ואכן, דווח כי mtDNA צובר מוטציות בתוך תאים סרטניים, להיות נוכח לפחות 50% של גידולים7. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה על ידי יואן ואחרים דיווח על נוכחות של מולקולות mtDNA hypermutated וקטוע בסרטן הכליות, המעי הגס ובלוטת התריס8. יתר על כן, עבודות רבות הוכיחו כי מוטציות מסוימות mtDNA קשורות לפנוטיפ גידול אגרסיבי יותר ולעלייה בפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים 9,10,11,12,13,14,15,16.
למרות הרלוונטיות לכאורה של הגנום המיטוכונדריאלי בהתקדמות הסרטן, המחקר של מוטציות אלה ותרומתן למחלה היה מאתגר בשל מגבלות במודלים ובטכנולוגיות הניסוי הזמינות כיום17. לכן, יש צורך בטכניקות חדשות כדי להבין את ההשפעה האמיתית של DNA מיטוכונדריה על התפתחות מחלות סרטן והתקדמותן. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול לייצור ציבריד טרנסוכונדריאלי מתאי סרטן הגדלים בתרחיף, המבוסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת, המתגבר על האתגרים העיקריים של שיטות גישור מסורתיות18,19. מתודולוגיה זו מאפשרת שימוש בכל תורם גרעינים ללא קשר לזמינות קו תאי ρ0 המתאים להם ולהעברת מיטוכונדריה מתאים אשר, בעקבות הטכניקות המסורתיות, יהיה קשה לחנך (כלומר, קווי תאים שאינם דבקים).

<table><tbody><tr><td>מנתח גנטי 3500XL&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4406016</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>AmpFlSTR מזהה בתוספת ערכת הגברת PCR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4427368</td><td></td></tr><tr><td>מיכל חיץ אנודה 3500 סדרה</td><td>ביו-מערכות יישומיות</td><td>4393927</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>PanReac</td><td>131015</td><td></td></tr><tr><td>ברדפורד מבחן</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>קתודה מיכל 3500 סדרת</td><td>Applied Biosystems</td><td>4408256</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131026</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>גנטיצין</td><td>Gibco</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר עלי טפלון</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>L929 קו תאים</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean Tetra4 מערכת ג'ל</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PCR פריימרים</td><td>Sigma-Aldrich</td> מוצרים <td></td><td>מותאמים אישית</td></tr><tr><td>תמיסת פוליאקרילאמיד 30%</td> <td>PanReac</td><td>A3626</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>POP-7</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>4393714</td><td></td></tr><tr><td>פירובט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>QIAmp DNA מיני קיט</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>רודמין-6G</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>SspI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>R3132</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין/פניצילין</td><td>PAN ביוטק</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>טריס</td><td>פנריאק</td><td>P14030b</td><td></td></tr><tr><td>אורידין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>U3750</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

בשנים האחרונות חלה עלייה משמעותית במספר המחקרים המוקדשים לבירור הקשר בין מיטוכונדריה לסרטן. עם זאת, עדיין נדרשים מאמצים נוספים כדי להבין באופן מלא את הקשר הכרוך בשינויים במיטוכונדריה ובגידולים, כמו גם לזהות פנוטיפים מיטוכונדריאליים הקשורים לגידול. לדוגמה, כדי להעריך את תרומתם של מיטוכונדריה בתהליכי גידולים וגרורות, חיוני להבין את השפעת המיטוכונדריה מתאי הגידול בסביבות גרעיניות שונות. לשם כך, גישה אפשרית אחת כוללת העברת מיטוכונדריה לרקע גרעיני אחר כדי להשיג את מה שמכונה תאי ציבריד (cybrid). בטכניקות הציברידגיזציה המסורתיות, קו תאים חסר mtDNA (ρ0, תא תורם גרעיני) מאוכלס מחדש במיטוכונדריה שמקורה בתאים או טסיות דם. עם זאת, תהליך ההדבקה של התאים דורש הידבקות טובה של התאים לצלחת התרבית, תכונה שאובדת באופן חלקי או מלא במקרים רבים בתאים פולשניים. בנוסף, קושי נוסף שנמצא בשיטות המסורתיות הוא השגת הסרה מלאה של mtDNA אנדוגני מקו התאים המקבל המיטוכונדריאלי כדי לקבל רקע DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי טהור, תוך הימנעות מנוכחות של שני מיני mtDNA שונים בציבריד שנוצר. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חילופי מיטוכונדריה המיושם על תאים סרטניים הגדלים בתרחיף, בהתבסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו מראש ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להתגבר על מגבלות הגישות המסורתיות, ובכך יכולה לשמש ככלי להרחבת הבנת התפקיד המיטוכונדריאלי בהתקדמות סרטן וגרורות.

לאחר ביצוע הפרוטוקול שהוצג לעיל, יש לקבל קו תאי ציבריד הומופלסמיים עם רקע גרעיני שמור אך עם גנוטיפ מיטוכונדריה חדש, כפי שמיוצג בסכמות באיור 1 ובאיור 2. טוהר הדנ"א המיטוכונדריאלי והגרעיני שנמצא בציברידים יכול להיות מאושר על-ידי RFLP, כפי שמוצג באיור 3, ועל-ידי ניתוח גנוטיפ של דנ"א גרעיני, כפי שמוצג באיור 4.
אם העברת המיטוכונדריה נעשתה בהצלחה, התוצאות שהתקבלו בניתוח RFLP עבור ק...

פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

מחקר זה נועד להבין טוב יותר את תרומתם של המיטוכונדריה בהתקדמות סרטן וגרורות. יצירת הציבריד הטרנסוכונדריאלי יכולה לעזור לנו להבהיר כיצד ובאיזו רמה גנוטיפים מיטוכונדריאליים מעורבים באגרסיביות של תא סרטני. אחת הטכנולוגיות לקבלת מידע על תפקיד המיטוכונדריה בסרטן היא יצירת ציברידים.אנו משלבים כלי זה עם מגוון שיטות אחרות הכוללות אלקטרופורזה תורמת, ניתוח נשימה ובדיקות תפקודיות מיטוכונדריאליות אחרות, ציטומטריית זרימה, פרוטאומיקה וכו '. הפלסטיות של תאים סרטניים יחד עם רשתות האינטראקציה בין גנים גרעיניים ומיטוכונדריאליים, מגבירה את מורכבות הניסויים ופרשנות הנתונים שלנו. זוהי אחת הסיבות מדוע יש צורך לפתח גישות ניסיוניות חדשות.אחד הממצאים המרגשים ביותר מהמחקר שלנו היה גילוי של שתי מוטציות בדנ"א המיטוכונדריאלי הקשורות לניתוק תאים מצלחת המשחק הדומה ליצירת גרורות והפיכת התאים לתלויים לחלוטין בגליקוליזה אירובית, וגם הפיכתם ליותר גידוליים וגרורתיים במודלים in vivo. פרוטוקול החלפת מיטוכונדריה זה יכול להיות מיושם על תאים סרטניים הגדלים תרחיף. הכרונולוגיה יכולה להתגבר על המגבלות של גישות מסורתיות שבהן תהליך הנוקלציה וההסרה המלאה של DNA מיטוכונדריאלי משורות התאים המקבלים המיטוכונדריה הופכים לעתים קרובות לאתגר אמיתי.

transmitochondrial-cybrid-generation-using-cancer-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של ​​הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.

דור של שורות תאים אנושיות יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) shRNA או ביטוי cDNA

הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 בתאים סרטניים שעברו מיטוזה תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal חי. סרטן PJ-34 להכחיד אנושי שד מד"א-MB-231 תאי מחסה Extra-centrosomes במיטוזה. בניגוד למיטוזה דו מוקדי רגילים, את centrosomes במיוחד לא התקבצו בשני קטבי הכישור בנוכחות של PJ-34.

מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

כתב יד זה מפרט שיטה המשמשת ליצירת קסנוגרפלים שמקורם בחולי סרטן הערמונית (PDX) מתאי גידול במחזור (CTCs). יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חלופי לחקר סרטן הערמונית; הגידול המאובחן השכיח ביותר וסיבת מוות שכיחה מסרטן אצל גברים.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

כאן, פרוטוקול (MitoCeption) מוצג להעביר המיטוכונדריה, מבודדת מתאי גזע mesenchymal אדם (MSC), לתאי גזע גליובלסטומה (GSC), במטרה ללמוד ההשפעות הביולוגיות שלהם על מטבוליזם ופונקציות GSC. פרוטוקול דומה ניתן להתאים להעביר המיטוכונדריה בין סוגי תאים אחרים.

MitoCeption: העברת המיטוכונדריה MSC אדם מבודד בתאי גזע Glioblastoma

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת סרטן התא שיבוטים המכיל תגית רצף MS2 ב subtelomere יחיד. גישה זו, בהסתמך על מערכת MS2-GFP, מאפשרת הדמיה של התרשימים אנדוגני של telomeric המכילים חוזר RNA (TERRA) הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים.

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

ציברידים טרנסברוכונדריאליים הם תאים היברידיים המתקבלים על ידי התמזגות של תאים מיטוכונדריאליים מיטוכונדריאליים (mtDNA) מדולדלים (תאי rho0 ) עם ציטופלסטים (תאים מלוכדים) שמקורם בחולים הסובלים מהפרעות מיטוכונדריאליות. הם מאפשרים לקבוע את המקור הגרעיני או המיטוכונדריאלי של המחלה, הערכה של פעילות ביוכימית, ואישור של התפקיד הפתוגנטי של גרסאות הקשורות ל- mtDNA.

גישה חוץ גופית לחקר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה: מודל Cybrid

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הכולל מעקב מיטוכונדריאלי, הליכי תרבית משותפת ישירה של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) ותאי אפיתל פיגמנט ברשתית (ARPE19), כמו גם שיטות לצפייה וניתוח סטטיסטי של היווצרות ננו-צינוריות מנהור (TNT) והעברה מיטוכונדריאלית כדי לאפיין חילופי מיטוכונדריה באמצעות TNT בין MSCs ותאי ARPE19.

העברה מיטוכונדריאלית באמצעות ננו-צינוריות מנהור בין תאי גזע מזנכימליים ואפיתל פיגמנט ברשתית במבחנה

פרוטוקול זה מתאר את התפתחות במבחנה האנושי פרה מודל של osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי עם שורות תאים של סרטן השד כדי לחקות את האינטראקציה תא-אוסטאוקלסט סרטן. המודל יכול לשמש כדי לקדם את ההבנה שלנו של עצם היווצרות גרורות ולשפר את אפשרויות טיפוליות.

התפתחות מודל פרה האנושית של Osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי משותף עם שורות תאים של סרטן השד

עמידות לטיפולים בסרטן תורמת התקדמות המחלה והמוות. קביעת את הפסיכולוגי מכניסטית של ההתנגדות היא קריטית לשיפור תגובה טיפולית. כתב היד הזה פרטים הפרוטוקול ליצירת תאים עמידים taxane מודלים של סרטן הערמונית (PC) כדי לעזור לנתח את המסלולים מעורבים סדר דוסטקסול ההתנגדות בחולים PC.

דור של סרטן הערמונית תאים מודלים של ההתנגדות דוסטקסול סוכן אנטי mitotic

כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

חקור יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי מקווי תאים סרטניים תלויי-תליה לחקר תפקיד המיטוכונדריה בהתקדמות סרטן. שיטה זו מאפשרת לבחון את השפעת הגנוטיפ המיטוכונדריאלי על אגרסיביות התאים.

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

גלה סרטונים נוספים