Name: שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: למדו שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון לניתוח התנהגות הימנעות מדשא ב-C. elegans באמצעות תיבת LED וסקריפט Python. שיטה זו מאפשרת תצפית ארוכת טווח בחקר תפקודי נוירונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לדאוק ג'ונג לי על קריאה ביקורתית של כתב היד ובדיקת קוד פייתון. מחקר זה נערך בחסות קרן המחקר הלאומית של קוריאה 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) ו-2019R1C1C1008708 (K.-h.Y).

1. הגדרת מכשיר הדימות (איור 1A-E)
<ol><li>ודא שמצלמת טלפון חכם עם דרישות המינימום הבאות זמינה: 12 מגה פיקסל (MP) מצלמה וידאו ברזולוציית 1080p שטח אחסון של 5 GB (וידאו של 20 דקות הוא 3-4 Gb) אפליקציית וידאו עם קיטועי זמן מחנות האפליקציות (אפליקציות זמינות בחינם)</li>
	<li>מקם את תיבת תאורת ה- LED על המדף התחתון של האינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס שבו תתבצע הבדיקה.</li>
	<li>כדי להסתיר את התבנית המנוקדת על משטח תאורת ה-LED, פרשו שתי יריעות של רקמות כדי לכסות את כל פני השטח של קופסת ה-LED.</li>
	<li>צרו שלב מוגבה עבור הדגימה (איור 1A,D). השלב המוגבה הוא יריעת פלסטיק שקופה הנתמכת על ידי מנהרות מלבניות חלולות. מנהרות מתפקדות כמו מעבה כדי למקד אור, ומספקות ניגודיות טובה יותר לדגימה (איור 1C). ודאו שדפנות המנהרה חשוכות במקצת כדי למזער את פיזור האור. במחקר זה נעשה שימוש בקופסאות נייר חומות. מידות המנהרה 5.5 ס"מ x 17 ס"מ x 4.5 ס"מ (רוחב x אורך x גובה). תיבת תאורת הלד יכולה להכיל עד חמש מנהרות.</li>
	<li>מקם מדף נוסף מעל הבמה כדי למקם את הטלפונים להקלטה (איור 1B,E). כל טלפון יקליט שלוש עד שש צלחות (שורה אחת עד שתיים של שלוש צלחות), לכן התאם את גובה ארון התקשורת בהתאם. זה יהיה בערך 15 ס"מ מעל הדגימה (איור 1B).</li>
	<li>שים מפצל חשמל בתוך האינקובטור כדי לחבר את הטלפונים במהלך הקלטת הלילה.</li>
</ol>2. הכנת מאגרים ומדיה
<ol><li>הכינו את מאגר M9 על ידי הוספת 3 גרם של KH 2 PO 4, 6 גרם של Na 2 HPO4 ו-5 גרם של NaCl ל-1 ליטר של H2O מזוקק. יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג ב-121°C למשך 20 דקות. מצננים את המאגר ולאחר מכן מוסיפים 1 מ"ל של 1 M MgSO4.</li>
	<li>הכן מאגר KPO 4 של 1 M על ידי הוספת 108.3 גרם של KH 2 PO 4 ו- 35.6 גרם של K 2 HPO4 עד 1 L של H 2O. התאם את ה- pH ל- 6.0 על ידי הוספת KOH. לעקר על ידי autoclaving.</li>
	<li>הכינו תמיסת הלבנת תולעים על ידי ערבוב 1 מ"ל אקונומיקה, 0.4 מ"ל של 1 מ"ל NaOH ו-2.6 מ"ל של H2O.</li>
	<li>הכינו צלחות אגר של מדיה לגידול נמטודות (NGM).<ol><li>הוסף 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של פפטון bacto, ו 17 גרם של אגר bacto בבקבוק 3 L. מוסיפים 975 מ"ל מים מזוקקים ומכניסים מוט ערבוב.</li>
		<li>יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג, ואז לקרר ל-55°C ולהוסיף 1 מ"ל כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל באתנול), 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 1 M MgSO 4 ו-25 מ"ל של 1 M KPO4 buffer (pH 6.0). מערבבים לערבוב טוב. יוצקים לצלחות בקוטר 6 ס"מ. תנו לצלחות להתייבש לפחות יומיים.</li>
	</ol></li>
	<li>זרע צלחות אגר NGM עם OP50 E. coli על ידי pipeting כ 1 מ"ל של תרבית לילה של OP50 כדי ליצור דשא של חיידקים. יש להשאיר בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש מוכן.</li>
</ol>3. הכנת לוחות NGM עתירי פפטון (עבור PA14)
הערה: לוחות אלה צריכים להיעשות לפחות 5 ימים לפני הבדיקה.
<ol><li>מייצרים גז טבעי טבעי המכיל 0.35% פפטון. מערבבים 0.3 גרם של NaCl, 0.35 גרם של בקטו פפטון, ו 1.7 גרם של אגר bacto בבקבוק Erlenmeyer 250 מ"ל. מוסיפים 97.5 מ"ל מים מזוקקים ומכניסים מוט ערבוב.</li>
	<li>מכסים את הפה של בקבוק עם רדיד אלומיניום autoclave ב 121 ° C במשך 20 דקות.</li>
	<li>יש לקרר עד 55°C ולהוסיף 0.1 מ"ל כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל באתנול), 0.1 מ"ל של 1 M CaCl 2, 0.1 מ"ל של 1 M MgSO 4,ו-2.5 מ"ל של 1 M KPO4 buffer (pH 6.0). מערבבים לערבוב טוב.</li>
	<li>מוזגים גז טבעי עתיר פפטון לצלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ.</li>
	<li>יבש את הצלחות לפחות 2 ימים.</li>
</ol>4. סנכרון תולעים על ידי הלבנה
הערה: התחל שלב זה 3 ימים לפני הבדיקה.
<ol><li>קח צלחות עם תולעים בוגרות gravid ולאסוף אותם לתוך microtube 1.7 מ"ל על ידי שטיפת הצלחות עם חיץ M9.</li>
	<li>מוציאים כמה שיותר נוזלים, ואז מוסיפים 400 מיקרוליטר של תמיסת הלבנה. ממתינים כ-4-5 דקות עם מערבולות לסירוגין, עד שגופי התולעים הבוגרות נשברים ומשחררים את הביצים.</li>
	<li>הוסף חיץ M9 כדי למלא את שאר המיקרו-צינורית כדי לדלל את תמיסת ההלבנה. סחרור במהירות מרבית (12,000 עד 13,000 x גרם) למשך 1-2 שניות. הסירו את הסופרנאטנט ושטפו שלוש פעמים נוספות עם חיץ M9.</li>
	<li>מעבירים את הביצים לצלחת פטרי ריקה בקוטר 35 מ"מ המכילה חיץ M9. תן את הביצים לבקוע לילה ב 20 °C (75 °F). בהיעדר מזון, התולעים שבקעו יעצרו בשלב הזחל L1, ויסנכרנו את השלב ההתפתחותי של כל התולעים. הערה: ציפוי צלחת פטרי 35 מ"מ בתמיסת ג'לטין (0.05% ג'לטין במים אוטוקלאביים) יכול למנוע מהביצים להידבק לתחתית ולמזער את אובדן הביצים.</li>
	<li>למחרת, העבירו תולעים בשלב L1 לצלחות NGM עם זרעי OP50.</li>
	<li>דוגרים על התולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 53-54 שעות עד שהתולעים מגיעות לשלב הזחל L4.</li>
</ol>5. הכנת חיידקים (Pseudomonas aeruginosa, PA14)
הערה: התחל שלב זה 4 ימים לפני הבדיקה.
<ol><li>פסים חיידקים מופשרים מ -80 ° C על צלחת אגר לוריא ברטאני (LB) ללא כל אנטיביוטיקה לדגור לילה ב 37 ° C. הערה: יש להשתמש תמיד בחיידקים טריים. צלחות פסים יש לאחסן ב 4 ° C במשך לא יותר מ 1 שבוע.</li>
	<li>לחסן מושבה אחת לתוך 3 מ"ל של מרק המלך ולגדל לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>למחרת, זרעו 7 מיקרוליטר של תרבית הלילה על צלחות NGM עתירות פפטון ודגרו בטמפרטורה של 37°C במשך 24 שעות.</li>
	<li>העבירו את צלחות הזרעים ל-RT ודגרו עוד 24 שעות לפני השימוש. ברגע שאתה מוכן, השתמש בצלחת תוך 24 שעות.</li>
</ol>6. הכנה להקלטה
הערה: בצע פעולה זו ממש לפני הבדיקה.
<ol><li>חבר את הטלפון החכם למפצל החשמל המחובר לשקע חשמל. הקפד להשבית את הגדרת הנעילה האוטומטית כדי למנוע מהטלפון לחזור למסך הנעילה בזמן ההקלטה.</li>
	<li>פתח את אפליקציית המצלמה עם קיטועי הזמן והגדר את מרווח הזמן של קיטועי הזמן ל- 2 שניות. הגדר את איכות הווידאו ל- 1080p ב- 30 fps.</li>
	<li>מקם את הטלפון החכם כשהמסך פונה כלפי מעלה כדי להקליט באמצעות המצלמה הפונה לאחור. בדוק את המסך כדי לוודא שתעלות קופסת הנייר מתאימות לשדה הראייה.</li>
</ol>7. בדיקת הימנעות מדשאה
<ol><li>באמצעות פיק חוטי פלטינה, מעבירים 30 תולעי שלב L4 מסונכרנות (53-54 שעות מ-L1) לצלחת PA14. הניחו את התולעים במרכז מדשאת החיידקים. עבור כל מצב במחקר זה, נבדקו שתי לוחיות (כלומר, 60 תולעים לכל מצב).</li>
	<li>הניחו את שתי הצלחות על השלב המוגבה של מכשיר ההקלטה כשהמכסה פונה כלפי מטה. הצד עם האגר יפנה כלפי מעלה לכיוון המצלמה.</li>
	<li>במסך הטלפון החכם, הקש במקום שבו נמצאת הצלחת, כך שהמצלמה תוכל להתמקד בלוחות הבדיקה. זה עוזר שיש תווית או כיתוב על הצלחת כמו המצלמה יכולה להשתמש בזה כדי להתמקד כראוי. הערה: כתיבה בתחתית הלוחות אינה מפריעה להדמיה של תולעים כל עוד היא בכיוון הקצה. למרבה המזל, תולעים נשארות ליד המדשאה גם לאחר שהן עוזבות, כך שיש צורך בתצפית ללא הפרעה רק על האזור המיידי המקיף את המדשאה.</li>
	<li>התחל את ההקלטה.</li>
	<li>לאחר תחילת ההקלטה, הוסף צלחות נוספות לבמה. ייתכן שיש זמן פיגור משמעותי בין הצלחות בגלל הזמן שלוקח להעביר תולעים על ידי קטיף. שים לב לזמן ההשהיה לאחר מכן, כך שניתן יהיה לספור כל תנאי בזמן שהוא התחיל.</li>
	<li>הקלט במשך 20 שעות מהסט האחרון של צלחות שהונחו על הבמה. בסרטון האחרון בהילוך מהיר, 20 שעות של הקלטה יובילו לסרטון באורך 20 דקות. הערה: ייתכן שכדאי לספור את התולעים ישירות מהלוחות לאחר הבדיקה, לפחות בהתחלה בהזדמנויות הראשונות. ניתן להשוות זאת לערכים המתקבלים באמצעות הדמיית וידאו כדי להבטיח שהם מניבים מספרים דומים.</li>
</ol>8. עיבוד וידאו באמצעות סקריפט Python
<ol><li>העבר את קובץ הסרט למחשב לצורך עיבוד. התוסף יהיה קובץ MOV (iPhone) או MP4 (Android).</li>
	<li>השתמש בקוד Python כדי לעבד את הסרטונים. ניתן למצוא את הקוד בכתובת github.com/khyoon201/wormavoid.</li>
	<li>כדי להפעיל את הסקריפטים של Python, ודא שהפריטים הבאים מותקנים מראש במחשב: ffmpeg, כלי להמרת קבצי וידאו (הוראות להתקנה ניתן למצוא באתר האינטרנט שלו, ffmpeg.org/download), ואת חבילות Python os, pandas, tkinter ו- ffmpeg-python.</li>
	<li>מצא את המידות והקואורדינטות של כל לוח באמצעות סקריפט extract_frame.py .<ol><li>הפעל את קובץ ה- Script של extract_frame.py . יופיע חלון לבחירת קובץ הווידאו המאוחסן במחשב. לאחר השלמת ההפעלה, קובץ jpeg עם אותו שם יופיע באותה ספרייה.</li>
		<li>פתח את קובץ ה- jpeg ב- ImageJ (imagej.org).</li>
		<li>מהתפריט, בחרו ' נתח' >'קבע מדידות'. ודא שהתיבה תווית תצוגה מסומנת (איור 2A). סגור את החלון.</li>
		<li>בעזרת הכלי קו ישר , מדדו את קוטר הלוח באמצעות ציור קו לרוחבו, ולאחר מכן בחרו באפשרות 'נתח > מדידה' מהתפריט. אם הסרטון הוא ברזולוציה של 1080p, רוחבו של כל לוח יהיה כ-480 פיקסלים. רשום מידע זה וסגור את החלון תוצאות .</li>
		<li>בעזרת הכלי ריבוי נקודות, סמנו נקודות בצד שמאל העליון של כל לוח. הנקודות האלה יהפכו לפינה השמאלית העליונה של הסרטונים החתוכים (איור 2B). הסדר חשוב; סמן לפי סדר התחלת הצלחות. לאחר יצירת נקודה לכל הלוחות, בחרו ' נתח > מדידה' מהתפריט. מדידות, כולל קואורדינטות X ו- Y של הנקודות, יופיעו בחלון תוצאות.</li>
		<li>כדי לעבד סרטונים מרובים, חזור על התהליך ב- ImageJ עם קובצי jpeg אחרים. כל הקואורדינטות X ו- Y יופיעו באותו חלון תוצאות .</li>
		<li>שמור את החלון תוצאות בקובץ csv. יש לשמור את הקובץ באותה ספרייה כמו קובצי הסרט.</li>
	</ol></li>
	<li>מצא את זמן ההתחלה עבור כל צלחת.<ol><li>הפעל את הסרט, במחשב או בטלפון, ושים לב לזמני ההתחלה של כל סט צלחות המונחות מתחת למצלמה.</li>
		<li>פתח את הקובץ תוצאות.csv עם הקואורדינטות והוסף עמודת "התחל". עבור כל שורה המתאימה ללוחות בודדים, הזן את שעת ההתחלה המתאימה, תוך שניות, תחת העמודה "התחל" (לדוגמה, אם שעת ההתחלה היא 0:00:08, הזן 8). שמר. הערה: שם העמודה חייב להיות "התחל" (באותיות קטנות, ללא מרכאות) כדי להיות מזוהה על-ידי הסקריפט הבא עבור חיתוך וחיתוך.</li>
	</ol></li>
	<li>חתוך וחתוך את הסרטונים.<ol><li>הפעל את קובץ ה- Script של crop_n_trim.py .</li>
		<li>כשתתבקש, בחר את הקובץ תוצאות.csv . הערה: ודא שהקובץ תוצאות.csv וכל קבצי הסרט נמצאים באותה ספרייה.</li>
		<li>הזן את מידות הצלחת. הזן את ערך הפיקסל שצוין קודם לכן. הערה: הסקריפט יקרא כעת כל שורה בקובץ Results.csv כדי למצוא את קובץ הסרט הנכון על-ידי קריאת שם הקובץ בעמודה "label", ויחתוך בהתאם לקואורדינטות המצוינות בעמודות "X" ו- "Y". זמן ההתחלה של כל צלחת ייקבע לפי הזמן המצוין בעמודה "התחלה". לאחר שהתסריט יסיים לפעול, תופיע תיקייה עם אותו שם כמו הסרט, ואחריה שעת ההתחלה (למשל, "Movie1_8"), שבה יישמרו סרטונים של 10 שניות המתאימים לכל נקודת זמן של שעה בבדיקה.</li>
	</ol></li>
</ol>9. ספירה ידנית באמצעות ImageJ
<ol><li>פתח כל קובץ AVI ב- ImageJ.</li>
	<li>ספרו את התולעים שנראות מחוץ לדשא. תולעים החופפות במסגרת אחת בדרך כלל מתרחקות זו מזו במסגרת אחרת כדי שניתן יהיה לספור אותן כראוי.</li>
	<li>חישוב שיעור התפוסה עבור כל נקודת זמן: שיעור תפוסה = (סה"כ תולעים - מספר התולעים מחוץ לדשא)/סה"כ תולעים הערה: התולעים ינועו פנימה והחוצה מהדשא במהלך הסרטון, אך הדבר לא ישנה באופן משמעותי את התוצאות. נסו ללכת עם המספר שנראה כמו הממוצע, או מספר התולעים בנקודת הזמן השעתית המדויקת (5 שניות לתוך הסרטון).</li>
</ol>

הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

<ol><li>Pradel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+avoidance+of+a+natural+product+from+the+pathogenic+bacterium+Serratia+marcescens+by+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).</li>
<li>Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+NPR-1-mediated+behaviors+are+suppressed+in+the+presence+of+mucoid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+shapes+the+C.+elegans+sensory+response+to+Pseudomonas+produced+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide.</a> eLife. 7, 36833(2018).</li>
<li>Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+pathways+that+surveil+and+defend+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria.</a> Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).</li>
<li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149 (2), 452-466 (2012).</li>
<li>Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensation+of+bacterial+secondary+metabolites+modulates+neuroendocrine+signaling+and+behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans.</a> Cell. 159 (2), 267-280 (2014).</li>
<li>Singh, J., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+infection+regulates+behavior+and+learning+via+neuroendocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling.</a> eLife. 8, 50033(2019).</li>
<li>Lee, K., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestine-derived+neuropeptide+controls+avoidance+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).</li>
<li>Singh, J., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lawn+avoidance+and+bacterial+two+choice+preference+assays+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 10 (10), 3623(2020).</li>
<li>Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+npr-1+is+a+behavioral+determinant+of+pathogen+susceptibility+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans.</a> Science. 323 (5912), 382-384 (2009).</li>
<li>de Bono, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+a+neuropeptide+Y+receptor+homolog+modifies+social+behavior+and+food+response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans.</a> Cell. 94 (5), 679-689 (1998).</li>
<li>Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormScan%3A+a+technique+for+high-throughput+phenotypic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33483(2012).</li>
<li>Stroustrup, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+lifespan+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans lifespan machine.</a> Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Marquina-Solis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+signaling+controls+the+dynamics+of+sickness+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Churgin, M. A., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imaging+system+for+monitoring+C.+elegans+behavior+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).</li>
<li>Barlow, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megapixel+camera+arrays+enable+high-resolution+animal+tracking+in+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates.</a> Communications Biology. 5 (1), 253(2022).</li>
<li>Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+optogenetic+system+for+behavioral+analysis+of+freely+moving+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals.</a> Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

הדמיה של התנהגות בעלי חיים, במקום להסתמך על תצפית ישירה, היא לא רק נוחה אלא גם בעלת יתרון של השארת תיעוד חזותי. זה מאפשר ניתוח עיוור על ידי אדם שלישי אובייקטיבי, או אפילו יכול לשמש לניתוח אוטומטי באמצעות טכניקות זיהוי תמונה. למרות היתרונות, הציוד הסטנדרטי המוצע בדרך כלל הוא בעלות גבוהה, ולכן אדם מחויב להתקנה לאחר הרכישה.
שימוש בסמארטפונים לאיסוף הקלטות וידאו של התנהגות פשוטה של C. elegans מציע מספר יתרונות. הוא דורש היכרות מינימלית עם ידע טכנולוגי וקל מאוד להתקנה, תוך שימוש בפריטים שנ...

בין היתרונות הרבים של חקר C. elegans, מערכת העצבים הפשוטה שלה מציעה הזדמנות לחקור כיצד שינויים ברמה הגנטית והתאית משפיעים על תפקוד הרשת ועל התפוקה ההתנהגותית. למרות שיש להם מספר מוגבל של נוירונים, C. elegans מציגים מגוון רחב של התנהגויות מורכבות. אחד מהם הוא הימנעות מדשאה, שבה הנמטודה החיידקית מגיבה למקור מזון מזיק על ידי עזיבת הדשא החיידקי. C. elegans נמנעים ממדשאות של חיידקים פתוגניים 1,2,3, מדשאות של חיידקים המייצרים רעלים או מתובלים ברעלים1,4, ואפילו חיידקים מבטאי RNAi שהשמדת גן המטרה שלהם מזיקה לבריאות התולעים 4,5. מחקרים הראו כי תולעים מגיבות לרמזים חיצוניים כגון מטבוליטים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים 1,6, או רמזים פנימיים המצביעים על כך שהמזון גורם להם לחלות 4,7. רמזים אלה מעובדים באמצעות מסלולי איתות שמורים, כגון מסלול חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) ומסלול בטא גורם גדילה משתנה (TGFβ), ודורשים תקשורת בין המעי למערכת העצבים 4,6,7,8.
למרות שהבדיקה פשוטה, ההתנהגות הנלמדת מתפתחת במשך שעות רבות, לעתים קרובות בן לילה. בעוד שישנם מוטנטים שאינם מסוגלים לעזוב, ובמקרה זה די בניקוד הימנעות בנקודת זמן אחת בלבד כדי להדגים את הפגם, מוטנטים רבים אכן עוזבים בסופו של דבר אך הם איטיים יותר לצאת. עבור אלה, התנועה של התולעים צריך להיות מעקב כל כמה שעות, אשר יכול להיות קשה לעשות בן לילה. גם הספירה עצמה לוקחת זמן, מה שיוצר זמן השהיה בין הלוחות, ובכך מגביל את מספר הצלחות שניתן לבדוק בו זמנית. שימוש במערך הדמיה כדי להקליט לוחות רבים בו זמנית למשך כל תקופת הבדיקה יהיה שימושי מאוד, אך עלות ההתקנה יכולה להיות אסורה, בהתאם למצב המימון של מעבדת המחקר.
כדי להתמודד עם זה, פיתחנו שיטה פשוטה מאוד המשתמשת בסמארטפונים כדי להקליט מבחני הימנעות. כל טלפון יכול להקליט סרטוני קיטועי זמן של עד שש לוחיות בדיקה. כדי לספק אור משודר, אנו משתמשים בקופסת אור של דיודה פולטת אור (LED) שניתן לרכוש בקלות באינטרנט. לוחות Assay ממוקמים על פלטפורמה מוגבהת, הנתמכת על ידי מנהרות מלבניות חלולות, הממקדות את האור הנכנס ויוצרות ניגודיות. אנו מספקים גם סקריפט Python הממיר את הסרטונים לקבצי Audio Video interleave (AVI) המציגים קליפים של 10 שניות של כל נקודת זמן לשעה. לאחר מכן הסרטונים נחתכים ללוחות נפרדים ונשמרים בקבצים נפרדים לשימוש לספירה ידנית.
השיטה מספקת הליך בעלות נמוכה כי הוא גם קל מאוד לשימוש, באמצעות פריטים זמינים עבור רוב האנשים. כאן, אנו מתארים את השיטה באמצעות בדיקת הימנעות דשא מבוססת היטב נגד הפתוגן האנושי Pseudomonas aeruginosa (PA14), שהפרוטוקול שלו תואר בעבר 2,9. לבסוף, אנו סוקרים גם את השיקולים והמגבלות של שיטת ההדמיה עבור אלה שרוצים ליישם אותה בניסויי התנהגות אחרים של C. elegans.

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי 35 מ"מ</td><td>SPL</td><td>#10035</td><td></td></tr><tr><td>בקטו אגר</td><td>BD</td><td>#214010</td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון</td><td>BD</td><td>#211677</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>DAEJUNG</td><td>2507-1400</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>BioBasic</td><td>CD0122</td><td></td></tr><tr><td>דיפוטסיום מימן פוספט (K2HPO4)</td><td>JUNSEI</td><td>84120-0350</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>BioBasic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>King B מרק</td><td>תא MB</td><td>MB-K0827</td><td></td></tr><tr><td>תיבת אור LED מרובת כריות</td><td>Artmate</td><td>N/A</td><td>זוהי כרית אור LED המופעלת באמצעות USB למטרות מעקב וציור. Artmate הוא מותג קוריאני, אך חיפוש אחר "תיבת אור LED למעקב" בכל מנוע חיפוש אמור להניב אפשרויות רבות של מותגים אחרים. הממד הכולל הוא בסביבות 9 אינץ' x 12 אינץ' (גודל A4). לדוגמה, מאמזון ארה"ב: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox& qid=1674183224& sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270& sr=8-5& th=1</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>DAEJUNG</td><td>5514-4400</td><td></td></tr><tr><td>שרוול נייר פלסטיק (שקוף)</td><td>Smead</td><td>#85753</td><td>כל יריעת פלסטיק שקופה עם מעט קשיחות יכולה לשמש כבמה. לדוגמה, מאמזון ארה"ב: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8</td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4)</td><td>JUNSEI</td><td>84185-0350</td><td></td></tr><tr><td>רצועת חשמל&nbsp;</td><td></td><td></td><td>כדי להכיל 3 טלפונים ותיבת LED אחת, אתה צריך לפחות 4 שקעים.</td></tr><tr><td>סמארטפון</td><td>N/</td><td>A N/</td><td>A דרישת מינימום: מצלמה רחבה של 12MP, הקלטת וידאו HD 1080p ב-30fps</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>DAEJUNG</td><td>#7548-4100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים (Na2HPO4)</td><td>YAKURI#</td><td>31727</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור c. elegans lawn avoidance assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

כאשר היא נחשפת לחיידקים רעילים או פתוגניים, הנמטודה Caenorhabditis elegans מפגינה התנהגות נלמדת של הימנעות מדשאה, שבה התולעים עוזבות בהדרגה את מקור המזון שלהן ומעדיפות להישאר מחוץ למדשאת החיידקים. הבדיקה היא דרך קלה לבחון את יכולתן של התולעים לחוש רמזים חיצוניים או פנימיים כדי להגיב כראוי לתנאים מזיקים. למרות שמדובר בבדיקה פשוטה, הספירה גוזלת זמן, במיוחד עם דגימות מרובות, ומשכי הבדיקה הנמשכים לילה אינם נוחים לחוקרים. מערכת הדמיה שיכולה לצלם לוחות רבים לאורך תקופה ארוכה היא שימושית אך יקרה. כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון לתיעוד הימנעות מדשאה ב- C. elegans. השיטה דורשת רק טלפון חכם וקופסת אור של דיודה פולטת אור (LED), שישמשו כמקור אור משודר. באמצעות יישומי מצלמה ללא קיטועי זמן, כל טלפון יכול לצלם עד שש לוחות, עם חדות וניגודיות מספיקות כדי לספור תולעים באופן ידני מחוץ לדשא. הסרטים המתקבלים מעובדים לקבצי 10 s audio video interleave (AVI) עבור כל נקודת זמן של שעה, ולאחר מכן נחתכים כדי להציג כל צלחת בודדת כדי להפוך אותם לנוחים יותר לספירה. שיטה זו היא דרך חסכונית עבור אלה המעוניינים לבחון פגמים הימנעות וניתן להרחיב אותה לבדיקות C. elegans אחרות.

הסרטון הראשון שהופק על ידי התסריט הוא 1 שעה מתחילת הבדיקה. הווידאו במשך 0 שעות אינו נשמר, כמו תולעים להתחיל את הבדיקה בתוך הדשא, ולכן שיעור התפוסה הוא תמיד 100%.
תולעי N2 מסוג פרא מושוות למוטנטים מסוג npr-1, שפגם בהימנעות מדשאה שלהם מבוסס היטב בספרות 6,10 (איור 3A-E). כפי שניתן לראות בסוג הבר, תולעים עוזבות בהדרגה את מדשאות החיידקים ונשארות בחוץ (<strong class="xf...

מאמר זה מתאר שיטה פשוטה וזולה לתיעוד התנהגות הימנעות מדשאה של Caenorhabditis elegans, באמצעות פריטים זמינים כגון טלפון חכם וקופסת אור פולטת אור (LED). אנו מספקים גם סקריפט Python לעיבוד קובץ הווידאו לפורמט נוח יותר לספירה.

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...

בין ההתנהגויות הרבות המוצגות על ידי C-elegans, הימנעות מדשאות פתוגניות היא אסטרטגיית ההגנה של התולעת כדי למזער את חשיפתה לפתוגנים מזיקים. במעבדה שלנו אנו משתמשים בהתנהגות זו ככלי לזיהוי גנים המעורבים בתפקוד תקין של תאי העצב המתווכים התנהגות זו. התנהגות הימנעות מדשאה היא בדיקה פשוטה, אולם היא מתפתחת במשך שעות רבות.לפיכך, נוח אם ניתן להקליט את הבדיקה כדי לצפות בהתנהגות לאורך תקופות זמן ארוכות. כמו כן, אם ניתן להקליט מספר בדיקות בו זמנית, זה אפילו טוב יותר. למרות שישנם פתרונות הדמיה רבים המתוארים בספרות, אפילו כמה מצלמות במחיר צנוע עשויות להיות מחוץ להישג ידן של מעבדות עם משאבים מוגבלים.כמו כן, חלקם עשויים לרצות לנסות את הבדיקה, אבל לא מתכננים לעשות את זה לטווח ארוך. במקרים כאלה, פתרונות לטווח קצר כגון פרוטוקול זה עשויים לעזור. הפרוטוקול המדהים שלנו מציע דרך קלה וזולה לתעד התנהגות תולעים.אנו משתמשים בסמארטפונים כדי להקליט את הבדיקה, ואז מעבדים את הווידאו באמצעות סקריפט Python שהופך אותו מתאים לספירה.

a-smartphone-based-imaging-method-for-c-elegans-lawn-avoidance-assay

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

פתחנו מערכת מיקרוסקופ מעקב וידאו שיעור שיכול להקליט...

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

חוקרים יכולים להפעיל תנועה לפי דרישה ב-C. elegans על ידי הפעלת שדה חשמלי שתולעים חשות בו ומגיבות אליו. סרטון זה מציג התנהגות אלקטרוטקטית ומציג פרוטוקול דגימה שנעשה במכשיר מיקרופלואידי.

בדיקת Electrotaxis: שיטה לצפייה בתנועה ב- C. elegans

הסרטון מתאר את ההימנעות ובדיקת thigmotaxis של זחלי דגי זברה. הסרטון בוחן את התנהגותם של זחלי דגי זברה בתגובה לגירוי חזותי מרתיע.

הימנעות מדגי זברה ובדיקת תיגמוטקסיס: שיטה בעלת תפוקה גבוהה לבחינת התנהגות הזחלים בתגובה לגירוי חזותי מרתיע

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic...

Assay Chemotaxis סי אלגנס

אנו מציגים התנהגות הקלטה הקלטה ופרוטוקול המאפשר ניתוח אוטומטי של נמטודות, Caenorhabditis elegans 'העדפת תרכובות מסיסות באסאי מבוסס האוכלוסייה. מאמר זה מתאר את הבנייה של תא התנהגות, פרוטוקול assay התנהגותי, וניתוח וידאו השימוש בתוכנה.

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

השימוש מותאם "צ'יפ חוש הריח" עבור ההדמיה סידן יעיל של C. elegans זכרים מתואר כאן. מחקרים של חשיפה זכר גליצרול פרומון מוצגים גם.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להפלות בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב, עם תועלת כללית לזני C. elegans , עם תנועתיות שונה.

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

פרוטוקול זה מתאר הדמיית דולג זמן מבוססת מיקרופלואידית על פני כל ההתפתחות הפוסט-עוברית.

הדמיה ברזולוציה גבוהה של C. elegans בכל שלבי הזחל

למדו שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון לניתוח התנהגות הימנעות מדשא ב-C. elegans באמצעות תיבת LED וסקריפט Python. שיטה זו מאפשרת תצפית ארוכת טווח בחקר תפקודי נוירונים.

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

גלה סרטונים נוספים