Name: קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: למד את שיטת 3C ללכידת קונפורמציית כרומוזומים ב-C. elegans לחקר ארגון כרומטין וויסות ביטוי גנים. פרוטוקול זה מותאם לסטודנטים לתואר ראשון ומספק ניסיון מעשי במחקר מולקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרס הפיתוח המוסדי של רוד איילנד (IDeA) רשת מצוינות במחקר ביו-רפואי מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מענק מספר P20GM103430 ומרכז בריאנט לבריאות ומדעי ההתנהגות.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) למחקר והוראה לתואר ראשון

<ol><li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92(2014).</li>
<li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li>
<li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li>
<li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li>
<li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).</li>
<li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li>
<li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li>
<li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromatin+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li>
<li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li>
<li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li>
<li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li>
<li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning%3A+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li>
<li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li>
<li>Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley</a>. , PhD thesis (2012).</li>
<li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li>
<li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li>
<li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li>
<li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343(2011).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture%2C+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%26%2334%3BC%26%2334%3B+s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The three &#34;C&#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My5C%3A+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

3C היא טכניקה רבת עוצמה המושרשת בטכניקות מולקולריות בסיסיות. זהו הבסיס הזה של כלים בסיסיים שהופך את 3C לטכניקה מסקרנת כל כך לשימוש עם סטודנטים לתואר ראשון. עם כל כך הרבה מחקרים עדכניים המתבוננים בדינמיקה של כרומטין בקנה מידה רחב כל כך, שימוש בתוצאות אלה כדי לתכנן ניסוי ממוקד צר על גן יחיד או אזור גנומי יש פוטנציאל ליצור ניסוי ייחודי ומשפיע במחקר לתואר ראשון. לעתים קרובות, ניסויים כאלה נחשבים מתקדמים מדי עבור סטודנטים לתואר ראשון, אבל עם תכנון זהיר, הם ניתנים להשגה בקלות. חשוב לציין כי הבדיקות שנועדו לחקור את קשרי הכרומטין שנלכדו על ידי ספריית 3C יכולות להשתנות מ- PCR כמותי למחצה לריצוף גנום שלם. למעשה, נתונים מנייר 3C הראשון16 נוצרו מ- qPCR. ניתן להשתמש במגוון רחב זה של בדיקות מכיוון שכל טכנולוגיות ה-3C מייצרות את אותו מוצר – ספרייה של מקטעי דנ"א המייצגים קשרים תלת-ממדיים בגרעין.
מוצג כאן התאמה של פרוטוקול גמיש יותר ומתאים יותר שמתאים יותר לחוקרים לתואר ראשון. תקופות ההשהיה המפורטות לעיל מרמזות על עיכובים של לילה; עם זאת, הפסקות אלה יכולות להימשך על פני סופי שבוע, ובמקרה של התאים והגרעינים, במשך שבועות. השיקול החשוב ביותר הוא מתי העבודה תתבצע. לעתים קרובות בפרוטוקולים, ישנם שלבים תלויי זמן כאשר השהיה אינה אופציה. מלבד כמה נקודות (יום 1 ויום 2), ישנם מקומות רבים לעצור ולהקפיא את הדגימה. אלה קריטיים כאשר עובדים עם סטודנטים לתואר ראשון, שבו לוחות הזמנים והתזמונים של עבודת המעבדה צריכים להיות גמישים. בנוסף להנדסת תחנות אלה לתוך הפרוטוקול, סטודנטים לתואר ראשון מעודדים לעבוד בזוגות או אפילו בקבוצות קטנות של שלושה או ארבעה. קבוצות עובדות היטב עבור פרוטוקול זה, מכיוון שהתלמידים יכולים לתמוך זה בזה וליצור מערכת חברים כך שכולם עובדים בבטחה. עבודת מעבדה היא גם מהנה יותר עם אחרים המעורבים. עם קבוצות, התלמידים יכולים גם לעבוד על מגוון רחב של שאלות המתמקדות בארגון הכרומטין תוך ביצוע אותו פרוטוקול. לכן, גם בזמן שהתלמידים עובדים על פרויקטים נפרדים, הפרוטוקול מקשר בין מאמציהם, ובגלל זה, הם יכולים לתמוך זה בזה.
התאמות אחרות נועדו לעקוף את העובדה שכלים וציוד מיוחדים מסוימים אינם נמצאים בהכרח בכל המוסדות לתואר ראשון. פריטי ציוד אלה כוללים אך אינם מוגבלים לתרמוסייקלרים qPCR, מערכות תיעוד ג'ל וספקטרומטרים של ננו נפח. ואכן, חלקים אלה של ציוד הם נוחים אבל הם לא דרישה. כאן, השיטה הקלאסית של 3C מתוארת גם בחלק עיצוב פריימר; זה כרוך בזיהוי מוקד עניין גנומי, ומתוך כך, הערכת מוקדים גנומיים אחרים עבור נקודות מגע כרומטין רחוקות יותר. טכניקה זו פועלת היטב גם אם נעשה שימוש במערך נתונים שפורסם, כגון מערך נתונים המשתמש ב- Hi-C, שבו מזוהים אתרים חיוביים (מתחברים) ושליליים ידועים (שאינם מתחברים). תכנון ניסויים באמצעות מערכי נתונים אלה שפורסמו הוא התאמה נהדרת נוספת עבור מעבדות הוראה, שכן הסיכוי לזיהוי מוצלח של קשרי כרומטין הוא בדרך כלל גדול יותר. בנוסף, ניתן לדון במאמר המחקר בכיתה ולשמש כאסמכתא.
פרוטוקול זה משתמש בגישת qPCR שונה כדי להמחיש את היווצרות המוצר 3C. בקרות חיוניות להצלחת טכניקת 3C. כל ניסוי משתמש הן בפקדי דגימה והן בבקרות פריימר כדי לקבוע את השלמת הליך 3C. בקרות הדגימה כוללות בקרה לא מעוכלת (DNA גנומי) ובקרה מעוכלת. הבקרה הלא מעוכלת קובעת את האות הבסיסי עבור ערכות הפריימר ומשמשת עם בקרת העיכול הצולבת כדי לקבוע את יעילות העיכול צפוי שתהיה ירידה במוצר עבור כל פריימר המופנה דרך אתר הגבלה. השוואת ערך זה לבקרה הלא מעוכלת מספקת אינדיקציה לכמה טוב הדגימה עוכלה.
הפריימרים ל-PCR כוללים פריימר בקרה ופריימרים לבדיקה. פריימר הבקרה הוא ערכת פריימר הקרובה לאזור הגנומי הנבדק ואינה מכילה אתר הגבלה. זה מספק את הבסיס לקביעת השפע של מוצרי PCR פריימר בדיקה. פריימרים לבדיקה הם פריימרים קדימה ואחורה שמאגפים אתר הגבלה עבור מוקד עניין גנומי מסוים (איור 3). תגובות באמצעות ערכות פריימר אלה מושוות כדי לקבוע את יעילות העיכול, כמו שפע המוצר צריך לרדת אם אתר ההגבלה נחתך. בקביעת ארגון הכרומטין, פריימר בדיקה אחד מלוקוס אחד מזווג עם פריימר בדיקה אחר ממוקד גנומי אחר כדי לקבוע אם שני מוקדים אלה קרובים זה לזה במרחב תלת-ממדי. במקרה כזה, הציפייה היא שמוצר PCR יימצא רק באמצעות דגימת 3C כתבנית.
חשוב לציין שגם לפריימרים מתוקפים יש נטייה להיכשל (איור 4: סט פריימר r14). בנוסף, תוצרי PCR מזוהים לעיתים קרובות בתגובות בקרה ובתגובות בהן לא צפוי קשר כרומטין (כגון הבקרה המעוכלת, שכן היא אינה קשורה). מופעים אלה רצפים ונכשלים ב-Sanger QC או חוזרים ללא רצף מוגדר (איור 5). בנוסף, ניסויי 3C מסורתיים יוצרים "תבנית בקרה", דגימת דנ"א לא מוצלבת, מעוכלת וקשורה, המייצגת את כל המקטעים הקשורים האפשריים שניתן לייצר עם כמות נתונה של דנ"א. "תבנית הבקרה" ממלאת תפקיד חשוב בהשוואת העוצמות של אותות qPCR בין שני אתרים גנומיים כדי לקבוע אם האות מייצג אינטראקציה אמיתית או רק אסוציאציה אקראית. יצירת "תבנית בקרה" יכולה להיות בעייתית, מכיוון שחלק גדול מהכרומטין הנבדק חייב להילכד בצורה של כרומוזום מלאכותי ולעבד יחד עם דגימות 3C. אבטחת מבנה כזה עשויה להיות בלתי ישימה, ויצירתו יכולה להיות מחוץ לתחום של פרויקט סמסטריאלי. בשל קשיים אלה, אנו ממליצים להשתמש בפריימר בקרה. פריימר הבקרה אינו מחליף את כל הפונקציונליות של "תבנית הבקרה", אך עדיין מספק את ההזדמנות לנתח את הנתונים כדי לקבל החלטות "נוכחות" או "היעדרות".
בעת ביצוע qPCR, שימוש בכמויות שוות של המדגם חשוב. יש לקבוע זאת, גם אם משתמשים בננו-ספקטרופוטומטר כגון ננו-טיפה, על ידי יצירת עקומה סטנדרטית מדנ"א גנומי בריכוז ידוע והתאמת דגימות 3C לקו זה. יש לרשום כמויות אלה ולהשתמש בהן בבדיקות PCR עוקבות. איכות תגובת ה-PCR חשובה גם היא. כאשר ה-PCR פועל ב-qPCR, שפע המוצר נמדד באמצעות פלואורסצנטיות ונרשם. הקלטה זו נגישה בחלקת ההגברה. לאחר סיום התוכנית, חשוב לבדוק את תרשים ההגברה ולוודא שלתגובות (למעט פקדי ה- No Template) יש שלושה שלבים: קו בסיס, שלב מעריכי ושלב מישור/רוויה. חשוב לבדוק שלתגובות יש פאזה אקספוננציאלית, בפרט לקביעת הסף (ראו בהמשך). בנוסף, עבור דגימות בדילול סדרתי, צריך להיות שינוי בערכי Ct בהתאם לדילול המדגם (הריכוז הגבוה ביותר יהיה בעל ערכי ה- Ct הנמוכים ביותר, ואילו הריכוז הנמוך ביותר יהיה בעל ערכי ה- Ct הגבוהים ביותר). דגימות שאינן משקפות שינוי זה בתרשים ההגברה דורשות דילול חדש או מצביעות על בעיה גדולה יותר בהיווצרות דגימת 3C. לבסוף, תוך יצירת העקומה הסטנדרטית, תוכנת ה- PCR תחשב את יעילות ה- PCR ואת ערך R2 . יעילות ה- PCR צריכה להיות גדולה מ- 90%, וערך R2 צריך להיות גדול מ- 0.99. אם אחד מהתנאים הללו אינו מתקיים, סביר להניח שמשהו לא בסדר במדגם או בפריימרים של PCR.
לאחר qPCR, אחוז העיכול ואת הנוכחות של אינטראקציות 3C ניתן לחשב באמצעות qPCR Ct עבור כל תגובה. כדי לקבוע זאת, ראשית, יש לקבוע את הסף לתגובת PCR. זה נעשה בדרך כלל באמצעות התוכנה שמגיעה עם מכונת qPCR. קביעת הסף תגדיר את ריכוז מוצר ה-PCR שישמש להשוואת ערכי ה-Ct המדגם. הסף צריך לחצות את עקומות ההגברה של תגובות ה-PCR בשלב המעריכי של ההגברה. ניתן להשוות רק תגובות PCR עם הגברה מעריכית (במקרה זה, פריימר הבקרה ותגובות פריימר הבדיקה), מכיוון שזו הדרך היחידה להבטיח שהתגובות מגבירות DNA באותו קצב וניתן להשוות אותן נאמנה. כאשר מנתחים את הגרפים של 3C, תגובות חיוביות מותנות מזוהות כתגובות עם יותר תוצר על פני דגימות הביקורת, הבקרה הגנומית ובקרת העיכול (איור 4B). עם זאת, דגימות אלה חייבות להיות מאומתות עוד יותר באמצעות ריצוף Sanger לאחר טיהור הג'ל של מוצר ה- PCR.
לאחר ריצוף Sanger, ניתן לנתח דגימות שעוברות את ה- QC באמצעות Blat. מטרת ניתוח זה היא לקבוע אם לדגימה יש את הרצף של שני המוקדים הגנומיים של המטרה הצמודים לאתר ההגבלה (DpnII במקרה של פרוטוקול זה). אם שני הרצפים מזוהים, אז קטע 3C יכול להיחשב מאומת. אם התוצאות של Blat אינן מחזירות את הרצף הצפוי, הדבר עשוי להצביע על כך שפריימר אחד או שניהם אינם אופטימליים, וכתוצאה מכך תוצאת qPCR חיובית שגויה. קבצי המעקב עבור הדגימות החיוביות הכוזבות יהיו בעלי שיאי בסיס לא מוגדרים, ודוחות Seq יכילו בעיקר קריאות בסיס "n".
אימות Sanger הוא חיוני, מכיוון שתוצאות חיוביות שגויות מהיווצרות מוצר PCR מלאכותי אפשריות. ניתן לזהות את התוצאות החיוביות הכוזבות האלה כאשר לתוצרי הריצוף אין את רצף המטרה הצפוי או אתר DpnII האופייני למקטע 3C תקין (איור 5). ריצוף מקטעי ה-PCR מספק גם נקודת נתונים נוספת לניסוי ומסביר לתלמידים כי טכניקת ה-3C מזהה מוקדים גנומיים מרוחקים המתאחדים במרחב תלת-ממדי בתוך הגרעינים.
טכניקת 3C מספקת שפע של טכניקות מולקולריות בסיסיות לסטודנטים לתואר ראשון בהליך גמיש ופשוט. טכניקת 3C זו היא גם נקודת השקה לטכניקות 3C אחרות המשלבות ריצוף מהדור הבא (NGS). ניסויים מסוג זה יכולים לחשוף סטודנטים לתואר ראשון להיבטים חשובים של ביואינפורמטיקה והם מושרשים בעקרונות הבסיסיים המתוארים כאן. ניסיון ומעורבות לתואר ראשון הם המפתח להצלחתם ולהתפתחותם כמדענים צעירים. על ידי מתן הזדמנויות אלה, סטודנטים לתואר ראשון יכולים לחזק את הבנתם של עקרונות בסיסיים תוך בניית הביטחון שלהם להתמודד עם טכניקות חדשניות ושאלות.

הגנום של אורגניזם מכיל לא רק את כל הגנים הדרושים לתפקוד, אלא גם את כל ההוראות כיצד ומתי להשתמש בהם. זה הופך את ויסות הגישה לגנום לאחד התפקידים החשובים ביותר של התא. ישנם מנגנונים רבים לשליטה בתפקוד הגנים; עם זאת, ברמת הבסיס שלו, בקרת גנים מסתכמת ביכולתם של גורמי שעתוק רגולטוריים (טרנס-פקטורים) להיקשר לרצפי הדנ"א הספציפיים שלהם (רצפי CIS-Regulatory ). זו אינה יכולת מולדת; במקום זאת, הוא נשלט על ידי הארגון/המבנה של הגנום בגרעין, אשר שולט על זמינות/חשיפה של רצפי CIS-regulatory לגורמים טרנס-פקטוריים 1,2,3. אם הגורמים הטרנס-פקטוריים אינם יכולים למצוא את הרצפים הרגולטוריים שלהם, אז הטרנס-פקטורים אינם יכולים לבצע את משימות הרגולציה שלהם. עובדה זו הפכה את הבנת האופן שבו גנומים מאורגנים בגרעין למקור חשוב לחקירה.
מקובל שבמהלך שלב הביניים, כרומוזומים אאוקריוטים בגרעין תופסים תחום משלהם המעוגן ללמינה הגרעינית ולמטריצה הגרעינית (איור 1), מה שהופך את הכרומוזום לדומה יותר לפרוסת פיצה, ולא לאטריות על צלחת ספגטי. הכרומוזומים מעובים חלקית על ידי אינטראקציות חלבון-דנ"א (כרומטין) המסובבות ולולאות חלקים של הכרומוזום. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, פלואורסצנטיות DNA תלת-ממדית בהכלאה באתרו (FISH), וטכניקות תיוג DNA (כלומר, מתילציה פלואורסצנטית ומלאכותית של DNA), נמצאו תחומים לא פעילים של כרומטין דחוסים בצפיפות לאורך הפריפריה הגרעינית 4,5,6, בעוד חלקים של כרומטין פעיל ופחות מעובה נמצאים בחלק הפנימי של הגרעין 7,8,9, 10. ניסויים אלה מספקים זווית ראייה רחבה של דינמיקת הכרומוזומים, אך עושים מעט כדי ללכוד את השינויים המתרחשים באופן מקומי סביב מנועי הגן שנצפו במחקרי DNase11,12 ונוקלאוזומים13,14,15.
המפתח לשחרור דינמיקת כרומטין ברזולוציה גבוהה יותר היה ניסוח טכניקת מיפוי הכרומוזומים התלת-ממדית, 3C. טכניקת 3C עצמה כוללת ארבעה שלבים עיקריים: קישור צולב של כרומטין, עיכול כרומטין על-ידי אנזימי הגבלה, קשירת כרומטין וטיהור דנ"א (איור 2). לאחר מכן ניתן לאפיין את מקטעי הדנ"א המלאכותיים החדשים שנוצרו בתהליך זה כדי לחשוף את הקשר הפיזיקלי ההדוק בין פיסות דנ"א מרוחקות ליניארית16. טכניקת 3C הפכה לבסיס ליצירת טכניקות ספין-אוף מרובות המשתמשות בשלבים הראשונים של 3C כדי לשאול שאלות רחבות יותר ברחבי הגנום (למשל, Hi-C, 4C, ChIP-C). משפחה זו של טכניקות 3C זיהתה כי כרומוזומים מאורגנים במספר יחידות בדידות הנקראות תחומים הקשורים טופולוגית (TADs). TADs מקודדים בגנום ומוגדרים על ידי לולאות כרומטין שמשני צדיהן גבולות לא לולאתיים 16,17,18,19. גבולות TAD נשמרים על ידי שני גורמים שמורים אבולוציונית הנמצאים בכל מקום, כולל גורם קשירת CCCT (CTCF) ולכידות, המונעים מלולאות בתוך TADs נפרדים מאינטראקציה16,20. הלולאות מתווכות על ידי אינטראקציה של טרנס-פקטורים עם הרצפים הרגולטוריים שלהם, כמו גם CTCF ולכידות21.
למרות שמחקרים רבים המשתמשים בטכנולוגיות 3C שואלים שאלות רחבות היקף בגנום ומשתמשים בטכניקות איסוף דגימות מסובכות, ניסוח טכניקת 3C מבוסס על טכניקות בסיסיות של ביולוגיה מולקולרית. זה הופך את 3C למסקרן לפריסה הן במעבדות מחקר לתואר ראשון והן במעבדות הוראה. ניתן להשתמש בטכניקת 3C עבור שאלות ממוקדות קטנות יותר והיא גמישה מטבעה להרחבה או למטה (גנים בודדים22, כרומוזומים16 ו / או גנומים18) בהתאם למיקוד ולכיוון של השאלות שנשאלו. טכניקה זו יושמה גם על מגוון רחב של מערכות מודל 7,16,19,23 והוכחה להיות תכליתי בשימוש בו. זה עושה 3C טכניקה מצוינת עבור סטודנטים לתואר ראשון כי התלמידים יכולים לצבור ניסיון בטכניקות ביולוגיה מולקולרית משותפת תוך גם צובר ניסיון רב ערך לענות על שאלות מכוונות.
מוצג כאן פרוטוקול מותאם להכנת ספריית 3C המבוסס על פרוטוקולים 24,25,26,27 שפורסמו בעבר. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לכ- 1 × 107 תאים, אם כי הוא יצר ספריות 3C עם מעט כמו 1 × 105 תאים. פרוטוקול זה הוכח כרב-תכליתי ושימש ליצירת ספריות 3C מעוברים של דגי זברה, קווי תאים של דגי זברה ותולעת עגולה (Caenorhabditis elegans) של מבוגרים צעירים (YA). הפרוטוקול צריך להתאים גם לשורות תאים של יונקים, ועם הסתגלות נוספת, שמרים.
מטרת התאמות אלה היא להפוך את 3C לנגיש יותר עבור סטודנטים לתואר ראשון. הקפיד להשתמש בטכניקות דומות לאלה שניתן להשיג במעבדת הוראה לתואר ראשון. טכניקת 3C מספקת הזדמנויות למידה רבות לסטודנטים לתואר ראשון ללמוד טכניקות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות שיועילו להתפתחותם על הספסל, בכיתה ובמאמציהם לאחר סיום הלימודים.

<table><tbody><tr><td>37% פורמלדהיד&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td>Millapore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td>MP <td>215350280</td><td></td> <td>ביו-רפואי</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Millapore-Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA</td><td>Millapore-Sigma</td><td>COEDTAF-RO</td><td>מעורבב עד 50x במים. מדולל ל-1x במאגר סוכרוז ובמאגר GB</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול טרי (DTT)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>D0632</td><td>מלאי 1M מדולל ל-500 ומיקרו; M במאגר סוכרוז ובופר GB טרי</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>NEB</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>Millapore-Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millapore-Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>מתיל ירוק פירונין&nbsp; &nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>HT70116</td><td></td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>Thermoscientific</td><td>1222530</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>פנול-כלורופורם&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millapore-Sigma</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05406</td><td></td></tr><tr><td>qPCR תערובת מוכנה (Phire Taq וכו')</td> <td>Millapore-Sigma</td><td>KCQS07</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>108319</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>מילפור-סיגמא</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA&nbsp;</td><td>מילפור-סיגמא</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

קבלת a עם 3cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) היא כלי רב עוצמה שהוליד משפחה של טכניקות דומות (למשל, Hi-C, 4C ו-5C, המכונות כאן טכניקות 3C) המספקות מידע מפורט על הארגון התלת-ממדי של כרומטין. טכניקות 3C שימשו במגוון רחב של מחקרים, החל מניטור השינויים בארגון הכרומטין בתאים סרטניים ועד לזיהוי מגעים משפרים שנעשו עם מקדמי גנים. בעוד שרבים מהמחקרים המשתמשים בטכניקות אלה שואלים שאלות גדולות ברחבי הגנום עם סוגי דגימות מורכבים (כלומר, אנליזה של תא יחיד), מה שהולך לאיבוד לעתים קרובות הוא שטכניקות 3C מבוססות על שיטות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות הישימות למגוון רחב של מחקרים. על ידי התייחסות לשאלות ממוקדות היטב של ארגון הכרומטין, ניתן להשתמש בטכניקה חדשנית זו כדי לשפר את חוויית המחקר וההוראה לתואר ראשון. מאמר זה מציג פרוטוקול 3C ומספק התאמות ונקודות דגש ליישום במוסדות לתואר ראשון בעיקר בהתנסויות מחקר והוראה לתואר ראשון.

הליך זה יפיק דגימת 3C ניסיונית אחת ושתי דגימות ביקורת (לא מעוכלות ומעוכלות). באמצעות שלוש דגימות אלה, qPCR בוצע. מתוצאות אלה חושבה יעילות העיכול (משוואה 1) ונרשמה (טבלה 1). מחישובים אלה נקבע כי לדגימת 3C הייתה יעילות עיכול של כ-88% (ממוצע של טבלה 1) בשבעת האתרים הגנומיים שנבדקו.
לאחר מכן, הדגימות נבדקו לנוכחות של מגעי כרומטין ארוכי טווח בין האתרים הגנומיים השונים באמצעות שילובים של פריימרים ספציפיים ללוקי (טבלה 2) ו-qPCR. באמצעות תוצאות אלה חושבו כמויות המכפלה ביחס לערכת פריימר בקרה (משוואה 2) וגרפים להשוואה (איור 4). נתונים אלה הצביעו על כך ש-8 מתוך 10 התגובות היו חיוביות מותנות לאינטראקציות ארוכות טווח.
תגובות ה-PCR הופעלו אז על ג'ל אגרוז. מוצר ה-PCR הצפוי עבור שמונת החיוביים המותנים ותגובה שלילית אחת טוהר בג'ל ונשלח לריצוף סנגר. התוצאות עבור תגובות חיוביות מייצגות (חץ כחול, תיבה כחולה) ושליליות (חץ אדום, תיבה אדומה) מוצגות (איור 5).
<img alt="תרשים קיפול חלבון; ממחיש שינויים במבנה ממצבים פרושים למצבים מקופלים עם הערות." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: מבנה הכרומוזומים בגרעין. ארגון כרומוזומים היפותטי בתוך הגרעין. (א) מעטפת גרעינית, קווים שחורים; (ב) למינה גרעינית, כתומה; (C) הטרוכרומטין, קווים דחוסים; (D) אוכרומטין, לולאות רופפות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תרשים הצלבה כרומוזומלי; ממחיש רקומבינציה גנטית, תהליך חילופי כרומטידים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: סכמה של פרוטוקול 3C. חלקים מרוחקים של כרומוזומים ליניאריים (כחול, צהוב וורוד) מתקרבים זה לזה בתוך הגרעין באמצעות לולאות רגולטוריות. (A) מבני הלולאה מתווכים על ידי גורמי שעתוק (עיגול אפור וכוכב שחור); אינטראקציות אלה נשמרות באמצעות הצלבה כימית. (B) הלולאות נשברות באמצעות עיכול אנזימטי (קווים שחורים). (C) חתיכות כרומטין מרוחקות קשורות זו לזו דרך הקצוות הדביקים שנוצרו על-ידי העיכול. (D) דנ"א מטוהר מחלבון. (E) הרצף בתוך המקטעים מזוהה וממופה חזרה לגנום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="דיאגרמת כרומוזומים, אתרי DpnII, נתוני RepeatMasker, מיפוי גנים, ניתוח רצף גנומי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: סכימת פריימר 3C. פריימרים 3C מתוכננים סביב אתרי הגבלה במרחקים משתנים מהמיקום הגנומי המעניין. החצים הוורודים מייצגים את ערכות הפריימר הניסיוניות המקיפות אתר DpnII. ניתן לערבב ולהתאים את הפריימרים הניסיוניים כדי להעריך את לולאת הכרומטין באזור. הפריימרים הכתומים מייצגים בקרה שלילית ללא אתר DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תרשימי עמודות המשווים את רמות פריימר הבדיקה בדגימות gDNA לא מעוכלות ומעוכלות, תוצאות 3C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: נתוני qPCR מייצגים עבור ניסוי 3C. שפע יחסי של ערכות פריימר מבחן 3C. (A) גרף בקרה המציג את השפע היחסי של המוצר בדגימת הבקרה הלא מעוכלת (כחול), בקרה מעוכלת (אפור) ודגימת 3C (כתום). (ב) ניסוי 3ג; השפע היחסי של המוצר משילובים של פריימרים לבדיקה בקבוצת הבקרה הלא מעוכלת (כחול), בקרה מעוכלת (אפור) ודגימת 3C (כתום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תוצאת אלקטרופורזה ורצף; ניתוח מקטעי DNA; עיכול אנזימטי; מחקר גנטי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> איור 5: הדמיה של מוצרי 3C qPCR. למעלה, ג'ל עם מוצרי נקודת הקצה qPCR עם הדגימות שצוינו. למטה, מייצג קבצי מעקב רצף Sanger עבור התגובות שצוינו. הדגימה הכתומה היא דוגמה לתוצאה חיובית כוזבת (ראו איור 4, r38/34), והמדגם הכחול הוא דוגמה לתוצאה חיובית אמיתית עם אתר DpnII המצוין מעל העקבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>אתר</td>
			<td>% עיכול</td>
		</tr><tr><td>₪100</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>₪3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>₪100</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>₪83</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>₪83</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>₪33</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>₪103</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: יעילות עיכול מחושבת.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם</td>
			<td colspan="3">רצף</td>
			<td>אתרים גנומיים</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>R38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>R38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>R34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>R34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>R33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>R33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>R14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCTCTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>R47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>R47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTGTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTTTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>פריימר בקרה FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>בקרת פריימר RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: פריימרים לניסוי 3C מייצג.

כאן אנו מציגים בפירוט התאמה של טכניקת לכידת קונפורמציית הכרומוזומים (3C) עם דגש על מעורבות ולמידה לתואר ראשון.

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

מטרת המחקר שלנו היא לחשוף כיצד ארגון הכרומטין שולט בביטוי גנים. ההתמקדות היא בקביעת הגורמים המווסתים את הכרומטין ברמת הגן כדי לשלוט בפעילות הגנים. כיום, טכנולוגיות דומות ללכידת אישור כרומוזומים, או 3C, משמשות כדי להתקדם בתחום זה.השקעות בטכנולוגיות איסוף וריצוף דגימות דחפו אותנו למה שטכניקות 3C יכולות להראות לנו. האתגר הניסיוני הגדול ביותר כיום הוא איסוף דגימות בעלות ארכיטקטורת כרומטין אחידה. הטרוגניות בדגימות מובילה לתוצאות מבלבלות.בעתיד, נתמקד באופן שבו שינויים בארגון הכרומטין משחקים תפקיד בסרטן.

getting-an-with-3cs-chromosome-conformation-capture-for

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

שיטת Hi-C מאפשר זיהוי משוחדת, גנום רחב של אינטראקציות הכרומטין (1). Hi-C זוגות קשירת סמיכות וסדר מקבילי מאסיבי. הנתונים וכתוצאה מכך ניתן ללמוד אדריכלות גנומית בקני מידה מרובות: התוצאות הראשוניות זיהו תכונות כגון בשטחים כרומוזום, הפרדה של הכרומטין פתוח, סגור, מבנה הכרומטין בקנה מידה megabase.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

כרומטין לולאה משחק תפקיד משמעותי הכונה; עם זאת, היו לא הפיתוחים הטכנולוגיים המאפשרים שינוי סלקטיבית ולא הפיכים של לולאות כרומטין. כאן נתאר מערכת חזקה לארגון מחדש של לולאה כרומטין באמצעות CRISPR-dCas9 (CLOuD9), הדגימו באופן סלקטיבי ובלתי הפיכה לווסת ביטוי גנים-ממוקד לוקוסים.

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

אנו מדווחים על היישום של לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותי ואחריו רצף תפוקה גבוהה בגופים embryoid שנוצרו בתאי גזע עובריים. טכניקה זו מאפשרת לזהות ולכמת את אנשי הקשר בין משפרי ואזורים היזם של גן נתון במהלך הבידול תא גזע עובריים.

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

Hi-C 3.0 הוא פרוטוקול Hi-C משופר המשלב פורמלדהיד ודיסוקינימידיל גלוטראט קרוסלינקרים עם קוקטייל של אנזימי הגבלה DpnII ו- DdeI כדי להגדיל את יחס האות לרעש ואת הרזולוציה של זיהוי אינטראקציית כרומטין.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

למד את שיטת 3C ללכידת קונפורמציית כרומוזומים ב-C. elegans לחקר ארגון כרומטין וויסות ביטוי גנים. פרוטוקול זה מותאם לסטודנטים לתואר ראשון ומספק ניסיון מעשי במחקר מולקולרי.

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

גלה סרטונים נוספים