שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA
4 באוגוסט 2023
פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.
המעבדה שלנו חוקרת את האינטראקציה בין מיקובקטריום, שחפת ומערכת החיסון של המאכסן, תוך התמקדות באינטראקציה הראשונית בין החיידק למקרופאגים. יש מגוון של טכניקות שיבוש גנים המשמשות במקרופאגים, כולל טכנולוגיות RNAi וטכנולוגיות CRISPR. אחד האתגרים הגדולים הוא היעילות הנמוכה של שיבוש גנים במקרופאגים.
פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה גנטית מהירה ויעילה של מקרופאגים ראשוניים ללא צורך בשיבוט ובניית פלסמיד. שיטות אלה צריכות להיות ישימות באופן נרחב באימונולוגיה, ולאפשר לחוקרים לשבש גנים במקרופאגים ראשוניים עבור מגוון רחב של מחקרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לעריכת גנום במקרופאגים המופקים ממח עצם של עכברים באמצעות קומפלקסים של ריבונוקלאאו-פרוטאין Cas9-sgRNA. גישה זו משפרת את היעילות של מניפולציה גנטית במקרופאגים ראשוניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- הנדסה גנטית
- ביולוגיה של מקרופאגים
רקע
- מקרופאגים ממלאים תפקיד מכריע בתגובת החיסון.
- טכניקות לשיבוש גנים חיוניות לחקר תפקודי המקרופאגים.
- שיטות מסורתיות סובלות לעיתים קרובות מיעילות נמוכה.
- פרוטוקול זה נותן מענה לאתגרים אלו על ידי הפיכת מניפולציה גנטית בעלת יעילות גבוהה לאפשרית.
מטרת המחקר
- לשיפור יעילות השבשת הגנים במקרופאגים ראשוניים.
- לאפשר מניפולציה גנטית מהירה ללא צורך בשיבוט (cloning).
- לספק שיטה הניתנת ליישום במגוון מחקרים אימונולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבת קומפלקסים של ריבנוקליאופרוטאין Cas9-sgRNA in vitro.
- החדרת קומפלקסים אלו באמצעות אלקטרופורציה.
- הגדרת פרמטרים ספציפיים לאלקטרופורציה (למשל, 1,900 volts, 20 milliseconds).
- יישום במקרופגים ראשוניים המופקים ממח העצם של עכבר.
תוצאות עיקריות
- הדגימה יעילות גבוהה של שיבוש גנים במקרופגים.
- אפשרה מניפולציה גנטית מהירה ללא צורך בפלסמידים.
- הראתה ישימות רחבה למחקרים אימונולוגיים מגוונים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה למניפולציה גנטית במקרופאגים.
- הוא נותן מענה לאתגרים קודמים ביעילות של שיבוש גנים.
- חוקרים יכולים להשתמש בשיטה זו למגוון מחקרים באימונולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיבוש גנים יעיל במקרופאגים ראשוניים המופקים ממח העצם (BMDMs) פותר צוואר בקבוק קריטי בתהליכי גילוי תרופות הממוקדים באימונולוגיה, על ידי מתן אפשרות לביצוע גנומיקה פונקציונלית מהירה ובאמינות גבוהה בתאים ראשוניים הרלוונטיים למחלה. יעילות העריכה הגבוהה וזרימת העבודה המהירה של פרוטוקול זה תומכות בתיקוף יעדים חסון ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בנקודות ציון מוקדמות של שלבי הגילוי. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי עבור מיון תיקי פיתוח ומאיצה את תרגומם של תובנות גנטיות להיפותזות טיפוליות יישומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של תפקוד גנים במקרופאגים ראשוניים, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים.
- מקל על תיקוף מהיר של מטרות טיפוליות במערכת רלוונטית פיזיולוגית.
- תומך במחקרי אובדן תפקוד (loss-of-function) בעלי רמת ודאות גבוהה לצורך הבהרת מסלולים.
- משפר את הערך הניבוי להחלטות עתידיות לגבי פורטפוליו הפיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות תאים ראשוניות שעברו ולידציה לצורך סריקת פנוטיפ בהמשך התהליך.
- מספק תוצאות כמותיות הדירות של שיבוש גנים הניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקה.
- מאפשר תהליכי עבודה ניתנים להרחבה וללא פלסמיד, המתאימים למסעות סריקה איטרטיביים.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות במקרופאגים ערוכים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את המניפולציה הגנטית לביולוגיה של מקרופאגים הרלוונטית למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- מסייעת בפיתוח מודלים פרה-קליניים באמצעות תאים ראשוניים עם עריכות גנטיות מוגדרות.
- מפחיתה סיכון ביולוגי על ידי גישור בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני במערכות ראשוניות.
- תומכת בגילוי סמנים ביולוגיים ובמחקרים מכניסטיים במסלולי עבודה של אימונולוגיה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
תהליך עבודה זה של CRISPR המבוסס על אלקטרופורציה משתלב בשלבי הגילוי המוקדמים ובשלבי תיקוף המטרה, ומאפשר התקדמות רציפה לזיהוי מובילים (lead identification) ומחקר פרה-קליני במסלולי פיתוח ממוקדי אימונולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובניתוח מסלולים במקרופאגים ראשוניים.
- סריקה: מספק שיבוש גנים כמותי וניתן לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות (assays).
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של יעילות העריכה מבוססת ריצוף סנגר להשוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: שומר על רלוונטיות למחלה על ידי שימוש בתאים ראשוניים למחקרים גנטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול סטנדרטי ורחב-יישום למניפולציה גנטית בפרויקטים של אימונולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מנגנונית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימות העבודה ביעילות גבוהה, הדירות ומבלי להזדקק לבניית פלסמידים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) והקצאת משאבים יעילה מבחינה הונית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום נכסים בתחום האימונולוגיה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בתאים ראשוניים ובהרכבת CRISPR RNP.
- נדרשת גישה למכשור אלקטרופורציה ולתשתית ריצוף Sanger.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח שחזור במחקרים רב-אתריים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור סוגי תאים ראשוניים או מינים אחרים.
- יש לתקף באופן אמפירי את יעילות העריכה ואת החיוניות עבור כל גן מטרה.
