שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA
4 באוגוסט 2023
פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.
המעבדה שלנו חוקרת את האינטראקציה בין מיקובקטריום, שחפת ומערכת החיסון של המאכסן, תוך התמקדות באינטראקציה הראשונית בין החיידק למקרופאגים. יש מגוון של טכניקות שיבוש גנים המשמשות במקרופאגים, כולל טכנולוגיות RNAi וטכנולוגיות CRISPR. אחד האתגרים הגדולים הוא היעילות הנמוכה של שיבוש גנים במקרופאגים.
פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה גנטית מהירה ויעילה של מקרופאגים ראשוניים ללא צורך בשיבוט ובניית פלסמיד. שיטות אלה צריכות להיות ישימות באופן נרחב באימונולוגיה, ולאפשר לחוקרים לשבש גנים במקרופאגים ראשוניים עבור מגוון רחב של מחקרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לעריכה גנומית במקרופאגים המופקים ממח עצם של עכברים באמצעות קומפלקסים של ריבנוקלאופרוטאין Cas9-sgRNA. גישה זו משפרת את היעילות של המניפולציה הגנטית במקרופאגים ראשוניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- הנדסה גנטית
- ביולוגיה של מקרופאגים
רקע
- מקרופגים ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- טכניקות לשיבוש גנים חיוניות לחקר תפקודי המקרופגים.
- שיטות מסורתיות סובלות לעיתים קרובות מיעילות נמוכה.
- פרוטוקול זה נותן מענה לאתגרים אלו על ידי מתן אפשרות למניפולציה גנטית ביעילות גבוהה.
מטרת המחקר
- לשיפור יעילות שיבוש הגנים במקרופאגים ראשוניים.
- להקלה על מניפולציה גנטית מהירה ללא צורך בשיבוט.
- לספק שיטה שניתן להחילה על מחקרים אימונולוגיים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבה של קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין Cas9-sgRNA במקום (in vitro).
- החדרה של קומפלקסים אלה באמצעות אלקטרופורציה.
- קביעת פרמטרים ספציפיים לאלקטרופורציה (למשל, 1,900 volts, 20 milliseconds).
- יישום במקרופאגים ראשוניים המופקים ממוח העצם של עכבר.
תוצאות עיקריות
- הדגימה יעילות גבוהה של שיבוש גנים במקרופאגים.
- אפשרה מניפולציה גנטית מהירה ללא צורך בפלסמידים.
- הראתה ישימות רחבה עבור מחקרים אימונולוגיים שונים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה למניפולציה גנטית במקרופאגים.
- הוא נותן מענה לאתגרים קודמים ביעילות של שיבוש גנים.
- חוקרים יכולים להשתמש בשיטה זו למגוון מחקרים באימונולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
שיבוש גנים יעיל במקרופאגים ראשוניים המופקים ממחית עצם (BMDMs) פותר צוואר בקבוק קריטי בתהליך גילוי תרופות הממוקד באימונולוגיה, על ידי מתן אפשרות לביצוע גנומיקה פונקציונלית מהירה ובביטחון גבוה בתאים ראשוניים הרלוונטיים למחלה. יעילות העריכה הגבוהה ותהליך העבודה המיועל של פרוטוקול זה תומכים בתיקוף יעדים חסון ובצמצום סיכונים מכניסטיים בנקודות השבח המוקדמות של תהליך הגילוי. גישה זו מגבירה את הביטחון החיזוי לצורך מיון פורטפוליו ומאיצה את התרגום של תובנות גנטיות להיפותזות טיפוליות מעשיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה ישירה של תפקוד גנים במקרופאגים ראשוניים, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מנגנוניים.
- מקלה על תיקוף מהיר של מטרות טיפוליות במערכת רלוונטית פיזיולוגית.
- תומכת במחקרי אובדן תפקוד (loss-of-function) ברמת ביטחון גבוהה לצורך הבהרת מסלולים.
- משפרת את הערך החזוי עבור החלטות עתידיות לגבי תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות תאים ראשוניים שעברו תיקוף עבור סריקה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- מספק תוצאי שיבוש גנים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות.
- מאפשר תהליכי עבודה ניתנים להרחבה וללא פלסמידים, המתאימים למסעות סריקה איטרטיביים.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות במקרופאגים שעברו עריכה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים בין מניפולציה גנטית לבין ביולוגיה של מקרופאגים הרלוונטית למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- מקל על פיתוח מודלים פרה-קליניים באמצעות תאים ראשוניים עם עריכות גנטיות מוגדרות.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי גישור בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני במערכות ראשוניות.
- תומך בגילוי סמנים ביולוגיים ובמחקרים מכניסטיים במסלולי עבודה באימונולוגיה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת (Pipeline)
מסלול העבודה של CRISPR המבוסס על אלקטרופורציה זה משתלב בשלבים המוקדמים של הגילוי ותיקוף המטרה, ובכך מאפשר מעבר חלק לזיהוי מובילים ולמחקר פרה-קליני בקווי ייצור המתמקדים באימונולוגיה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובניתוח מסלולים במקרופאגים ראשוניים.
- סריקה: מספק שיבוש גנים כמותי וניתן לשחזור לצורך מוכנות הבדיקה.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של יעילות העריכה המבוססת על ריצוף סנגר להשוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי שימוש בתאים ראשוניים למחקרים גנטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול סטנדרטי ורחב יישום למניפולציה גנטית בפרויקטים בתחום האימונולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימות העבודה ביעילות גבוהה, הדירות ומבלי להזדקק לבניית פלסמידים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר של go/no-go והקצאת משאבים יעילה מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של נכסים בתחום האימונולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בתאים ראשוניים ובהרכבת CRISPR RNP.
- נדרשת גישה לציוד אלקטרופורציה ולתשתית לריצוף סנגר (Sanger sequencing).
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח הדירות במחקרים רב-אתריים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור סוגי תאים ראשוניים אחרים או עבור מינים אחרים.
- יש לתקף באופן אמפירי את יעילות העריכה ואת החיוניות עבור כל יעד גני.
