ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)
5 במאי 2023
פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.
המחקר במעבדה שלנו בוחן כיצד חלבונים הקשורים לכרומטין, שינויים בהיסטון וגורמי מסלול RNA קטנים פועלים יחד בהקשר של התפתחות ותורשה אפיגנטית בין-דורית. בדיקת ירושת RNA, באמצעות כתב GFP, הפכה לכלי רב עוצמה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לתקנן את ההכנה, הניקוד והמסירה של תולעים, ואת הכנת דגימות ChIP, שיכולות לסייע ביצירת תוצאות הניתנות לשחזור.
אחד האתגרים הניסיוניים בחקר טרנסגנים המבוטאים בנבט הוא בידוד ההשפעות בקו הנבט של החיה. כיום אנו משתמשים בבעלי חיים שלמים עבור ChIP, אך בעתיד נרצה לפתח בדיקות לבדיקת כרומטין, במיוחד בקו הנבט. המעבדה שלנו מתעניינת במתילציה של היסטון ובחלבונים שמזהים את הסימנים האלה.
בהמשך, ברצוננו לחקור את יחסי הגומלין בין קוראי הכרומטין הללו לבין מסלולי רנ"א קטנים בהקשר של תורשה של RNAi בטרנסגנים והרגולציה של רצפים אנדוגניים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר ניסוי של הפרעת RNA (RNA interference) ובדיקת ChIP כדי לחקור את ההורשה האפיגנטית של השתקה המושרית על ידי RNAi ושינויים בכרומטין ב-C. elegans.
מרכיבים מרכזיים של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אפיגנטיקה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- המחקר מתמקד בחלבונים הקשורים לכרומטין ובמודיפיקציות של היסטונים.
- מסלולי RNA קטן ממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות ובירושה.
- בדיקת ירושת ה-RNA משתמשת ברפורטר GFP לצורך ניתוח יעיל.
- האתגרים כוללים בידוד של השפעות קו הנבט בטרנסגנים.
מטרת המחקר
- לסטנדרטיזציה של ההכנה והדירוג של C. elegans עבור בדיקות ירושה של RNAi.
- לחקירת הגומלין בין קוראי כרומטין למסלולים של RNA קטן.
- להבנת מנגנונים של ירושה אפיגנטית בין-דורית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת עוברי C. elegans באמצעות תמיסת הלבנה.
- טיפול ב-RNAi עם וקטורי GFP או וקטורי בקרה על פלטות אגר.
- דירוג של ביטוי GFP בדורות שונים.
- קישור צולב (cross-linking) באמצעות פורמלהדהיד עבור בדיקות ChIP.
תוצאות עיקריות
- השתקת הגן המעובּר (transgene) הייתה חודרת באופן מלא בדורות P0 ו-F1.
- נצפתה העברה של השתקת GFP בכ-50% מהמקרים בדור F2.
- בדור F5, רוב התולעים לא הראו העברה של ההשתקה.
- כל התולעים ביטאו GFP עד דור F10, מה שמעיד על אובדן ההעברה.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי הורשה של RNAi ושינויים בכרומטין.
- שיטות סטנדרטיות משפרות את השחזוריות במחקר אפיגנטי.
- עבודות עתידיות יתמקדו בניתוח כרומטין ספציפי לתאי הנבט.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הורשה אפיגנטית בין-דורית (TEI) ב-C. elegans מספקת מודל חסון לבחינת מנגנוני בקרה גנטית תורשתיים ללא שינויים ברצף ה-DNA. שילוב של בדיקות דוחות פלואורסצנטיות ו-ChIP-qPCR מאפשר ניתוח כמותי, ברזולוציה של דורות, של מודיפיקציות כרומטין והשתקה המושראת על ידי RNAi. סבב עבודה זה תומך בביטחון חזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מנגנוניים בנקודות השבחה מוקדמות בשלב הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של מנגנוני השתקה של גנים העוברים בתורשה, הרלוונטיים לתיקוף המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור שינויים בכרומטין לתוצאות תפקודיות של ביטוי גנים.
- מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת מדדים כמותיים המפוקחים לפי דורות של ויסות אפיגנטי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקיים מערכות ביולוגיות מתוּקפות וניתנות לשחזור לצורך סריקה המשכית של מודולטורים של הכרומטין ונתיבי RNAi.
- מסנכרן את הדירוג הכמותי של השתקת גנים בדיווח (reporter silencing) והעשרה של מודיפיקציות היסטון.
- מאפשר פורמטים של בדיקות רב-דוריות וניתנות להרחבה לצורך הערכת תרכובות ובדיקת נתיבים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מנגנונים אפיגנטיים הרלוונטיים למחלה באמצעות מידול של שינויים תורשתיים בכרומטין.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני של מטרות ומסלולים אפיגנטיים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי כימות העמידות וההפיכות של השתקת גנים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לבדיקת היפותזות הנוגעות לירושה אפיגנטית ודינמיקת כרומטין לאורך דורות.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את ההשפעה של RNAi ושינויים בכרומטין על בקרה גנטית תורשתית.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור השתקת רפורטר והעשרה של סימני היסטון.
- אנליטיקה: מספקת השוואה סטטיסטית של התמדת ההשתקה ומצב הכרומטין לאורך דורות.
- מחקר תרגומי: ממדלת מנגנונים אפיגנטיים הרלוונטיים למחלות ולהתערבות טיפולית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה למטרות גנטיות שונות ומסלולי כרומטין מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה ומפחית עמימות מכניסטית בבקרה אפיגנטית.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות רב-דוריות.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go ולהקצאת הון על ידי כימות דינמיקה של השתקה תורשתית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומסלולים אפיגנטיים לצורך קידום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-C. elegans, ב-RNAi ובטכניקות של שיקוע חיסוני של כרומטין (ChIP).
- מחייב גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ולמכשור qPCR עבור קריאות כמותיות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדירוג וההכנה של הדגימות.
- ניתן להתאמה למבני רפורטר וסימני כרומטין שונים באמצעות שינויים בפרוטוקול.
- ביצוע ChIP לבעל החיים השלם עלול להגביל את הספציפיות לרקמת הנבט; התאמות עתידיות עשויות לטפל במגבלה זו.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:17
Bleaching and Plating Caenorhabditis elegans P0 Generation Embryos onto RNAi-NGM plates
3:47
Passaging and Scoring the Caenorhabditis elegans P0 Generation for Germline GFP Expression
5:42
Collection of F1 Generation Caenorhabditis elegans for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
6:38
Formaldehyde Crosslinking of the F1 Generation of Caenorhabditis elegans for ChIP
7:50
Sonication of Formaldehyde-Crosslinked Caenorhabditis elegans and Chromatin Immunoprecipitation
