Name: אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: למד אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG באמצעות זיהוי כימילומינסצנטי לא רדיואקטיבי. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לכימות אורך טלומרים במחקר תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לגב' פראצ'י שאה על שעזרה לנו בתחילה באופטימיזציה של הפרוטוקול. ברצוננו להודות לד"ר מנוג' גארג על אספקת קו תאי סרטן השחלות A2780. EK נתמך על ידי מענק מחקר מהמחלקה לביוטכנולוגיה (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), המחלקה למדע וטכנולוגיה (ECR/2018/002117), ומענק זרעים NMIMS (IO 401405).

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול להלן. טבלה 1 מגייסת ריאגנטים מתוצרת מעבדה יחד עם נפחים ממוטבים, וטבלה 2 מציגה ריכוזי עבודה של ריאגנטים זמינים מסחרית.
1. תרבית תאים
<ol><li>לשמור על תאים שאורך הטלומרים שלהם יימדד (שימשו כאן תאי A2780, שהוא קו תאי אדנוקרצינומה שחלתי) בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) שלם בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), סטרפטומיצין, פניצילין ואמפוטריצין B בצלחת פטרי של 6 ס"מ. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה ומבוקרת המכילה 5% פחמן דו חמצני עד שהתאים יהיו 80%-100% ביחד.</li>
	<li>הסר את המדיה ושטוף עם 5 מ"ל של 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS).</li>
	<li>טפל בתאים עם 1 מ"ל של חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) לניתוק התאים על ידי דגירה ב 37 ° C למשך 3-5 דקות.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של מדיה מלאה DMEM כדי להשבית את הטריפסין ולאסוף את התאים בצינור צנטריפוגה.</li>
	<li>מטילים את התאים על 2,348 × גרם במשך 5 דקות.</li>
	<li>שטפו את הגלולה עם 1x PBS וצנטריפוגה ב 2,348 × גרם במשך 5 דקות.</li>
	<li>יש לאחסן את הגלולה בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף. הערה: ספירת התאים עשויה להשתנות בהתאם לקו התא. השגנו כ 2.5 × 106 תאים במקרה של קו התאים A2780, אשר משמש בשלבים נוספים.</li>
</ol>2. בידוד DNA גנומי
<ol><li>הוסף 500 μL של חיץ ליזיס (10 mM tris-Cl, pH 8.0; 25 mM EDTA, pH 8.0; 100 mM NaCl; 0.5% w/v נתרן דודציל סולפט) לכדורית התא וערבב בעדינות באמצעות קצה חתוך (עם קוטר פתיחה של מינימום 2 מ"מ). מוסיפים 20 מיקרוגרם/מ"ל RNase A טרי מוכן ומערבבים בעדינות על ידי היפוך.</li>
	<li>יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ומדי פעם להפוך את הצינור במהלך הדגירה.</li>
	<li>מוסיפים פרוטאינאז K לריכוז סופי של 100 מק"ג/מ"ל ומערבבים בעדינות בהיפוך 10 פעמים. לדגור ב 55 ° C במשך 2 שעות. הפוך את הצינור במרווחי זמן קבועים (כל 10 דקות) במהלך הדגירה.</li>
	<li>הוסף 500 μL של פנול:כלורופורם:מגיב אלכוהול איזואמיל (25:24:1) וערבב בעדינות על ידי היפוך 20 פעמים. צנטריפוגה ב 9,391 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (סביב 25 ° C). הערה: איור 1A מראה את שלוש השכבות המתקבלות לאחר צנטריפוגה.</li>
	<li>מוציאים את השכבה המימית העליונה הצמיגה משלוש השכבות הגלויות, מניחים בצינור טרי בעזרת קצה חתוך, ומוסיפים כמות שווה של כלורופורם. מערבבים בהיפוך עדין 20 פעמים.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 9,391 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>אספו את השכבה המימית והוסיפו כמות מתאימה של 5 M NaCl כך שהריכוז הסופי של NaCl יהיה 0.2 M.</li>
	<li>הוסף שני כרכים של 100% אתנול. מערבבים בהיפוך עדין 20-25 פעמים. צנטריפוגה ב 15,871 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את supernatant ולהוסיף 500 μL של 70% אתנול לשטוף את הכדור. צנטריפוגה ב 15,871 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מוציאים את הסופרנטנט, מייבשים את הגלולה באוויר למשך מספר דקות, ומוסיפים 50 מיקרוליטר מים סטריליים ללא נוקלאז. תנו לדנ"א להתייבש למשך 1-2 ימים בטמפרטורת החדר. מערבבים על ידי pipetting, באמצעות קצה החתוך.</li>
	<li>למדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטריה אולטרה סגולה (UV). דללו מחדש את הדגימות, במידת הצורך, באמצעות מים סטריליים נטולי נוקלאז כדי לקבל ריכוז מינימלי של 300-500 ננוגרם/μL.</li>
	<li>בדקו את שלמות הדנ"א על-ידי הרצתו על ג'ל אגרוז 1% (איור 1B).</li>
	<li>אחסנו את הדנ"א המדולל בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש נוסף.</li>
</ol>3. עיכול של DNA גנומי
<ol><li>הכינו תערובת אנזימים של Rsa1 (20 U) ו-Hinf1 (20 U) והוסיפו 2 מיקרוליטר של חיץ הגבלת עיכול לכל תגובה.</li>
	<li>קח נפח מתאים של DNA גנומי כך שהכמות הכוללת של DNA היא 1.5 מיקרוגרם. לפצות את הנפח עם מים סטריליים ללא נוקלאז, כך שהנפח הכולל לאחר הוספת האנזים הוא 20 μL.</li>
	<li>מערבבים היטב על ידי הקשה, ואחריה סיבוב דופק.</li>
	<li>לדגור על התערובת ב 37 ° C במשך 2 שעות.</li>
</ol>4. אלקטרופורזה ג'ל אגרוז
<ol><li>הכינו ג'ל אגרוז בגודל 10 ס"מ × 15% 0.8% בחיץ 1x tris אצטט EDTA (TAE) באמצעות אגרוז באיכות גבוהה.</li>
	<li>הוסף 5 μL של צבע העמסה לכל דגימת DNA גנומי מעוכל, ובכך להפוך את נפח הסופי 25 μL, ולטעון את הדגימות על הג'ל.</li>
	<li>הכינו תערובת סמנים מולקולריים באמצעות 1 μL של סמן מולקולרי (סולם), 3 μL של מים סטריליים ללא נוקלאז, ו 1 μL של צבע העמסה פי 5.</li>
	<li>עומס 5 μL של תערובת סמן מולקולרי משני צידי הדגימות הגנומיות של הדנ"א הגנומי אם יש מספר גבוה יותר של דגימות (~10), או רק בצד אחד אם יש פחות או שווה לחמש דגימות.</li>
	<li>הפעל את הג'ל ב 5 V / cm במשך 6 שעות. לאחר סיום הריצה, עשו חריץ בפינה אחת של הג'ל כדי לסמן את סדר הטעינה.</li>
	<li>יש לטבול את הג'ל ב-0.25M HCl למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>יש לשטוף את הג'ל פעמיים במים מזוקקים.</li>
	<li>נטרל את הדנ"א על ידי טבילת הג'ל בתמיסה של 0.5 M NaOH ו- 1.5 M NaCl פעמיים למשך 15 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>יש לשטוף את הג'ל פעמיים במים מזוקקים.</li>
	<li>נטרלו את הדנ"א על ידי טבילת הג'ל בתמיסה של 0.5 M tris-HCl ו-3M NaCl (pH 7.5) פעמיים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.</li>
</ol>5. כתם דרומי
<ol><li>חותכים קרום ניילון בגודל 10 ס"מ × 12 ס"מ ויוצרים חריץ באותו מיקום כמו הג'ל.</li>
	<li>הפעל את הממברנה על-ידי טבילה במים מזוקקים ולאחר מכן חיץ 20x נתרן ציטראט (SSC) (ראה טבלה 1).</li>
	<li>הגדר את ההעברה.<ol><li>קחו מגש זכוכית נקי והניחו בו מגש נוסף במצב הפוך. צור פתיל באמצעות נייר סינון רגיל כך שהקצוות ייגעו בבסיס המגש החיצוני.</li>
		<li>מניחים את הג'ל על גבי נייר הפילטר. מניחים בעדינות את קרום הניילון הפעיל מעל הג'ל, כשהחריצים חופפים, ומסירים בועות אוויר על ידי גלגול מוט זכוכית.</li>
		<li>הניחו ערימה של 2 ס"מ של נייר סינון תאית בקוטר 9.5 ס"מ × בקוטר 11.5 ס"מ, ולאחר מכן ערימה של נייר סינון רגיל בקוטר 6 ס"מ באותם ממדים. מקם משקל על גבי מערך זה כך שתהיה חלוקת משקל שווה מתחת. מלא את המגש החיצוני במאגר SSC של 20x (ראה איור 2).</li>
		<li>השאר את ההתקנה להעברה למשך הלילה.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר ההעברה הדרומית, קבע את ה- DNA המועבר על הממברנה על ידי קישור UV על טרנסילמייטור UV או קרוסלינקר UV. השתמש במנורת 302 ננומטר 8 ואט למשך 5 דקות, או במנורת 254 ננומטר 8 ואט למשך 2 דקות, המתאימה לכ- 120 mJ. ודא שצד הממברנה שעליו מועבר הדנ"א פונה אל המנורה.</li>
	<li>שטפו את הממברנה פעמיים עם 25 מ"ל של 2x SSC buffer.</li>
	<li>השהה את הפרוטוקול, במידת הצורך, על ידי ייבוש מלא של הכתם ואחסונו, בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס לאחר עטיפה רופפת בנייר כסף, עד לעיבוד נוסף.</li>
</ol>6. הכלאה וזיהוי כימילומינסנציה
<ol><li>מחממים מראש את מאגר טרום הכלאה ל 42 מעלות צלזיוס. הערה: השלבים הבאים כוללים נפחים של תמיסות/מאגרים לשימוש לכל 100 ס"מ2 של כתם.</li>
	<li>לדגור את הממברנה ב 10 מ"ל של חיץ prehybridization במשך 1 שעה ב 42 ° C עם תסיסה עדינה עבור prehybridization.</li>
	<li>הוסף 0.5 μL של בדיקת טלומרים לכל 5 מ"ל של חיץ טרום הכלאה שחומם מראש כדי ליצור את פתרון ההכלאה.</li>
	<li>לדגור את הכתם ב 10 מ"ל של פתרון הכלאה ב 42 ° C במשך 3 שעות עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>שטפו את הכתם עם חיץ 1 מחמיר (טבלה 1) פעמיים במשך 10 דקות (25 מ"ל כל אחת) בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>חממו מראש חיץ מחמיר 2 (טבלה 1) למשך 30 דקות ב-50°C.</li>
	<li>יש לשטוף את הכתם עם חיץ מחמיר 2 פעמיים למשך 15 דקות (25 מ"ל כל אחת) ב-50°C עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>יש לשטוף עם 15 מ"ל של חיץ כביסה במשך 5 דקות עם תסיסה עדינה ב-RT.</li>
	<li>דגרו על הממברנה ב-10 מ"ל של תמיסת חסימה 1x טרייה שהוכנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>לדגור על הממברנה ב 10 מ"ל של אנטי digioxigenin מצומד עם תמיסת עבודה phosphatase אלקליין (ראה טבלה 2) במשך 30 דקות ב RT עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>יש לשטוף את הכתם פעמיים עם חיץ כביסה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בתסיסה עדינה.</li>
	<li>יש לדגור ב-10 מ"ל של חיץ זיהוי למשך 5 דקות ב-RT עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>הסר את מאגר הגילוי העודף ושמור את הממברנה כשהדנ"א פונה כלפי מעלה על שקית הכלאה או יריעת אצטט. הוסף ~ 1-1.5 מ"ל של תמיסת מצע טיפה על הממברנה, מיד להניח יריעה נוספת על זה, לדגור במשך 5 דקות ב RT.</li>
	<li>סחטו את תמיסת המצע העודפת להדמיה.</li>
	<li>צלם את הכתם במשך כ -20 דקות במערכת הדמיה תיעוד ג'ל, איסוף תמונות מרובות בנקודות זמן שונות. בחרו תמונות בלתי רוויות לניתוח נוסף. הערה: במקרה שהאות חלש, ניתן לבצע הדמיה לפרק זמן ארוך יותר.</li>
</ol>7. ניתוח
<ol><li>לאחר קבלת קבצי התמונה, ייצא אותם לפרסום בפורמט .tif ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית (600 dpi במקרה זה).</li>
	<li>התקן את תוכנת Telotool . לשם כך נדרשת גרסה ספציפית (R2012a) של MATLAB (זמינה באופן חופשי) כדי לפעול.</li>
	<li>פתח את התוכנה ולחץ על טען קובץ תמונה כפתור בפינה השמאלית העליונה.</li>
	<li>לאחר טעינת התמונה, לחץ על הפוך תמונה, כך שרקע התמונה יהיה שחור והמריחות/הפסים יהיו לבנים.</li>
	<li>חתוך את התמונה עם הפינות העליונות החל מהבארות. לאחר ביצוע בחירת החיתוך, לחץ לחיצה ימנית בתוכה ובחר חתוך תמונה.</li>
	<li>לאחר חיתוך התמונה, לחץ על חשב נתיבים ואפשר לזיהוי נתיב להתרחש באופן אוטומטי.</li>
	<li>אם הנתיבים לא זוהו כראוי, לדוגמה, אם נתיבים מסוימים לא זוהו כלל, או אם זוהו נתיבים נוספים או חלקיים, בצע התאמת נתיב כמתואר להלן.<ol><li>לחץ על התאמת נתיבים ובחלון הקופץ שנפתח, הוסף ו/או כוונן נתיבים לפי הצורך, ולחץ על החל וסגור.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר התאמת הנתיבים, יש לוודא כי בכל אחד מהנתיבים נראית נקודה אדומה ולהתאים את הסולמות באמצעות כפתור התאמת סולם , תוך הקפדה על כך שמספר הפסגות בשני נתיבי הסולם נמצא באותו מיקום. הסר פסגות חיצוניות באמצעות הלחצן Delete Extremum .</li>
	<li>לאחר התאמת הסולות, בחר פרופילי נתיב, לחץ על התאמת סולם ובחר התאמה פולינומית.</li>
	<li>לחץ על קו מגמה, בהתאם להמלצת התוכנה ולאחר מכן בחר תוקן באפשרות הבאה.</li>
	<li>לחץ על קבל תוצאות כדי להציג את התוצאות כטבלה, שבה שורת TRF ממוצעת היא מדידת אורך הטלומרים של דגימות הנתיבים בהתאמה.</li>
	<li>לחץ על שמור הכל כדי לאחסן את התוצאות בצורה של גיליון אלקטרוני.</li>
</ol>

כימות אורך הטלומרים באמצעות זיהוי כימילומינסנציה לא רדיואקטיבית

<ol><li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Telomere length regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).</li>
<li>Valdes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+cigarette+smoking%2C+and+telomere+length+in+women%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women.</a> Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).</li>
<li>Allsopp, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+predicts+replicative+capacity+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).</li>
<li>Epel, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+telomere+shortening+in+response+to+life+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Accelerated telomere shortening in response to life stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).</li>
<li>Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+telomere+length+quantification+by+FISH+and+its+application+to+human+population+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).</li>
<li>Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+as+a+marker+of+cellular+aging+is+associated+with+prevalence+and+progression+of+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).</li>
<li>Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+variations+in+aging+and+age-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Aging+Science%22%5BJournal%5D)">Telomere length variations in aging and age-related diseases.</a> Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).</li>
<li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+restriction+fragment+%28TRF%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Telomere restriction fragment (TRF) analysis.</a> Bio-Protocol. 5 (22), e1658(2015).</li>
<li>Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+and+its+role+in+the+aging+pathways%3A+telomere+shortening%2C+cell+senescence+and+mitochondria+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction.</a> Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).</li>
<li>Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TeloTool%3A+a+new+tool+for+telomere+length+measurement+from+terminal+restriction+fragment+analysis+with+improved+probe+intensity+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 21(2014).</li>
<li>Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+terminal+restriction+fragment+analysis+for+quantifying+telomere+length+using+in-gel+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e56001(2017).</li>
<li>Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+restriction+fragments+%28TRF%29+method+to+analyze+telomere+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths.</a> Bio-protocol. 5 (23), e1671(2015).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Trigodet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+molecular+weight+DNA+extraction+strategies+for+long-read+sequencing+of+complex+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes.</a> Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).</li>
<li>Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+telomere+length+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of telomere length measurement methods.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451(2018).</li>
<li>Mochida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+size+and+telomerase+activity+in+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+and+EBV-negative+Burkitt%27s+lymphoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines.</a> Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).</li>
<li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+senescence%2C+telomere+shortening+and+cell+proliferation+rate+in+Gaddi+goat%27s+skin+fibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line.</a> Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).</li>
<li>Michaeli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+telomere+length+correlates+with+extended+female+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility.</a> Cells. 11 (3), 513(2022).</li>
<li>Lesmana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+reference+intervals+for+leukocyte+telomere+length+in+children%3A+the+method+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

אנו מתארים הליך מפורט לשיטה לא רדיואקטיבית, מבוססת כימילומינסנציה למדידת אורך הטלומרים באמצעות כתם דרומי. הפרוטוקול נבדק כדי לאפשר שימוש מושכל במספר ריאגנטים ללא פשרות על איכות התוצאות. ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר הפרה-הכלאה וההכלאה עד חמש פעמים. ריכוז האנזימים יכול לנוע בין 10-20 U לכל 1.5-2 מיקרוגרם של DNA גנומי מבלי להשפיע על התוצאות. מספר רכיבי ערכה אחרים, כגון סמן משקל מולקולרי המסומן DIG ובדיקת הכלאה, ניתנים לשימוש בריכוזים נמוכים מהמומלץ. אמצעי האחסון הממוטבים מצוינים בטבלה 2. בדקנו אותם במחצית מה...

טלומרים הם רצפי דנ"א חוזרים הנמצאים בקצה הכרומוזומים. יש להם חזרות דו-צדדיות של TTAGGG והם שומרים על שלמות הגנום על ידי הגנה על הכרומוזום הן מפני שחיקה והן מפני בעיית השכפול הסופית, מה שאומר שחלק מ-3' overhang אינו ניתן לשכפול על ידי DNA פולימראז 1,2. טלומרים קצרים מובילים להפרעות כרומוזומליות בתאים, שבגללן תאים נעצרים לצמיתות בשלב שנקרא הזדקנות משוכפלת3. טלומרים קצרים גורמים גם לשורה של בעיות אחרות, כגון תפקוד לקוי של המיטוכונדריה 4,5 ותפקוד לקוי של התאים.
חזרות טלומריות של דנ"א אובדות כאשר התא מתחלק, עם אובדן ממוצע של 25 עד 200 bp בשנה 6, וכתוצאה מכך הזדקנות התא לאחר מספר מסוים של חלוקות6. הזדקנות קשורה לתדירות גבוהה יותר של תחלואה נלווית, אשר מסומנת על ידי קיצור אורך הטלומרים7. ניתוח מקטע הגבלת טלומר (TRF), כפי שתואר על ידי מנדר, הוא שיטה יקרה מאוד8. בגלל זה, זה לא מיושם בעת כימות אורך הטלומרים ברוב המחקרים.
כיום, רוב המחקרים האפידמיולוגיים משתמשים במדידות כמותיות מבוססות תגובת שרשרת פולימראז (qPCR) של אורך הטלומרים. עם זאת, השיטה מבוססת qPCR היא שיטת מדידה יחסית, שכן היא מודדת את היחס בין טלומרים לבין תוצרי הגברה של גנים בעותק יחיד, ולא אורך טלומרים מוחלט. מדידת אורך הטלומרים באמצעות פרוטוקול TRF היא שיטת תקן הזהב, מכיוון שהיא יכולה למדוד את התפלגות אורך הטלומרים במדגם וניתן לבטא את המדידות בערכים מוחלטים בקילו-בסיסים (kb). עם זאת, השימוש בו מוגבל מכיוון שהוא מסורבל, עתיר עבודה ויקר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי למדידת אורך הטלומרים באמצעות TRF מבוסס כימילומינסנציה.
ניתוח TRF כולל שבעה שלבים עיקריים: 1) תרבית תאים למיצוי DNA גנומי, 2) מיצוי DNA גנומי באמצעות שיטת פנול:כלורופורם:איזואמילאלכוהול (P:C:I), 3) הגבלת עיכול של DNA גנומי, 4) אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, 5) כתם דרומי של מקטע DNA עיכול הגבלה, 6) הכלאה וגילוי באמצעות כימילומינסנציה - בדיקת הטלומרים המשותקת מומחשת על ידי מצע כימילומינסנטי רגיש ביותר עבור פוספטאז אלקליין, דיסודיום 2-כלורו-5-(4-מתוקסיספירו[1,2-דיוקסטאן-3,2′-(5-כלורוטריציקלו[3.3.1.13.7]דקאן])-4-yl]-1-פניל פוספט (CDP-Star)-ו-7) ניתוח לקבלת אורך וטווח טלומרים ממוצע ומידע טווח ממריחות טלומריות אלה.

<table><tbody><tr><td><חזק>קו תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A2780 (קו תאי אדנוקרצינומה בשחלות)</td><td>התקבל במתנה</td><td></td><td></td></tr> <tr><td><חזק>ציוד</חזק ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ (להדמיה וקישור צולב UV)</td><td>מכסה</td><td>מנוע אוניברסלי Biorad II (721BR14277)</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (תקופה 2)</td><td>Biotek</td><td>EPOCH2</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תוכנה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TeloTool</td><td>גרסה 1.3</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Molychem</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>MP</td><td>180720</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, ארה"ב</td><td></td><td></td>15240062</tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>HyClone, Cytiva, ארה"ב</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמין טטראצטית&nbsp;</td><td>Molychem</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, ארה"ב</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Molychem</td><td>76-47-01-0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Molychem</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Molychem</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת ניילון</td><td>Sigma</td><td>11209299001</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, ארה"ב</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Affymetrix</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, ארה"ב</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BIORAD</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>נייר Whatman GE</td><td>healthcare lifesciences</td><td>1001-917</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 סולם</td><td>kb NEB</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG AP</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>פתרון חסימה 10x</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B6004</td><td></td></tr><tr><td>מאגר זיהוי 10x</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקה באורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>לחפור קל hyb</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>מאגר עיכול</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Hinf 1</td><td>ערכת בדיקת אורך טלומר Telo TAGGG 12209136001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hinf 1 (אלטרנטיבה לערכה)</td> <td>NEB</td><td>R0155T</td><td></td></tr><tr><td>טוען צבע</td><td>BIOLABS</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>מאגר חומצה מאלית 10x</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>סמן מולקולרי</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Rsa 1</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>Rsa 1 (חלופה לערכה)</td> <td>NEB</td><td>R0167L</td><td></td></tr><tr><td>מצע</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td>מאגר כביסה</td><td>Telo TAGGG ערכת בדיקת אורך טלומר</td><td>12209136001</td><td></td></tr></tbody></table>

אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים taggg

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

טלומרים הם רצפים חוזרים הנמצאים בקצוות הכרומוזומליים; הקיצור שלהם הוא מאפיין אופייני של תאים סומטיים אנושיים. הקיצור מתרחש עקב בעיה בשכפול הסופי והיעדר אנזים הטלומראז, האחראי על שמירת אורך הטלומרים. באופן מעניין, הטלומרים גם מתקצרים בתגובה לתהליכים פיזיולוגיים פנימיים שונים, כמו עקה חמצונית ודלקת, שעלולים להיות מושפעים מגורמים חוץ-תאיים כמו מזהמים, חומרים זיהומיים, חומרי מזון או קרינה. לפיכך, אורך הטלומרים משמש סמן ביולוגי מצוין להזדקנות ולפרמטרים בריאותיים פיזיולוגיים שונים. ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG משמשת לכימות אורכי הטלומרים הממוצעים באמצעות בדיקת מקטע הגבלת הטלומרים (TRF) והיא ניתנת לשחזור ברמה גבוהה. עם זאת, זוהי שיטה יקרה, ובגלל זה, זה לא משמש באופן שגרתי עבור מספרים מדגם גדול. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט למדידה אופטימלית וחסכונית של אורך הטלומרים באמצעות כתמים דרומיים או ניתוח TRF וזיהוי מבוסס כימילומינסנציה לא רדיואקטיבית.

הדנ"א הגנומי שחולץ (gDNA), שהופעל על ג'ל אגרוז 1%, הראה שלמות טובה, כפי שמוצג באיור 1B, מה שמצביע על כך שהדגימה יכולה לשמש לעיבוד נוסף במורד הזרם של TRFs. לאחר מכן בוצעה בדיקת TRF על ידי שינוי נפחי הפתרונות הנדרשים בכל שלב (ראה טבלה 1 וטבלה 2). אות TRF נראה בבירור (איור 3). לכן, על ידי שינוי נפחי התמיסה וריכוזיה, ניתן היה לעבד יותר דגימות ללא כל השפעה שלילית על התוצאות, וניתן היה לקבוע את אורך הטלומרים בהצלחה באמצעות תוכנה זמינה...

כאן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול לכימות אורך הטלומרים באמצעות זיהוי כימילומינסנטי לא רדיואקטיבי, תוך התמקדות באופטימיזציה של פרמטרי ביצועים שונים של ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG, כגון כמויות חיץ וריכוזי בדיקה.

אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

היקף המחקר שלנו כולל מדידת הבדלי אורך הטלומרים בין קבוצות מחקר שונות. השאלות שאנו מנסים לענות עליהן סובבות סביב מחלות של מצבים פיזיולוגיים וכיצד הם עשויים להשפיע על אורך הטלומרים ולהיפך. הטכנולוגיה משמשת כיום לקידום המחקר בתחום הביולוגיה של אורך הטלומרים הם ריצוף ננו-נקבוביות ולאחרונה מדידה מבוססת CRISPR Cas.אתגרי הניסוי הנוכחיים מודדים במדויק את אורך הטלומרים האבסולוטי ואת השינויים בו. אותה דגימה יכולה לתת תוצאות שונות כאשר משתמשים בשיטות שונות למדידת אורך הטלומרים. הפער המחקרי שאנו מתייחסים אליו הוא היעדר שיטה סטנדרטית למדידת אורך הטלומרים.ניתוח שברי הגבלת טלומרים או TRF, הוא עדיין הסטנדרט שמולו מוערכות כל הטכניקות החדשות. כמו כן, הפרוטוקולים הממוטבים שלנו מסייעים בעיבוד מספר גדול יותר של דגימות עם משאבים מוגבלים. הממצאים שלנו יסייעו לקדם את המחקר בתחום הביולוגי של אורך הטלומרים על ידי מתן דרך אמינה וחסכונית יחסית להשוות שיטות חדשות לתקן הזהב, שהוא TRF.המעבדה שלנו תתמקד בהשפעות של מעכבי מולקולות קטנות על אורך הטלומרים. כמו כן, נלמד את ההשפעה שיש למחלות אורח חיים ואורך הטלומרים זה על זה.

optimization-performance-parameters-taggg-telomere-length

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

שיטה מדויקת, קצרה, מתוחכמת וזולה מתוארת מעריך כי אורך הטלומרים ברקמות ומינים באמצעות qRT-PCR מרובים. בנוסף, נתאר assay פשוט כדי להעריך את פעילות טלומראז כמבחן עמוד השדרה משלים לאורך הטלומרים.

אורך הטלומרים ופעילות Telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא

במאמר זה, פרוטוקול מפורט לכימות אורך הטלומרים באמצעות ניתוח מסוף שונה מגבלה ניתוח נדון המספק מדידה ישירה ויעילה ישירה של אורך הטלומרים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מקורות התא של DNA עבור כימות אורך הטלומרים.

שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג&#39;ל

ATAC-seq היא שיטת ריצוף DNA המשתמשת בטרנספוזאז מוטנטי היפראקטיבי, Tn5, כדי למפות שינויים בנגישות הכרומטין המתווכים על ידי גורמי שעתוק. ATAC-seq מאפשר לגלות את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס שינויים פנוטיפיים בתאים סרטניים. פרוטוקול זה מתווה הליכי אופטימיזציה עבור ATAC-seq בסוגי תאי אפיתל, כולל תאים סרטניים.

אופטימיזציה של ATAC-Seq לחקר אפיגנטיקה של סרטן

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מתרביות תאים ex vivo או in vitro לעיבוד מקדים של נתוני תמלול לסינון תרופות מבוסס תמלול חסכוני.

בדיקת תרופות מבוססת תמלול חסכונית

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת אורך הטלומרים היחסי (TL) באמצעות בדיקת תגובת שרשרת פולימראז כמותית מונוכרום (MMqPCR). בדיקת MMqPCR היא שיטה חוזרת, יעילה וחסכונית למדידת TL מדנ"א אנושי במחקרים מבוססי אוכלוסייה.

מונוכרום מולטיפלקס כמותי PCR מדידת אורך טלומרים 

ההבנה הלקויה של הביצועים in vivo של ננו-תרופות מעכבת את התרגום הקליני שלהן. נהלים להערכת ההתנהגות in vivo של ננו-תרופות לסרטן ברמה מערכתית, רקמתית, חד-תאית ותת-תאית בעכברים בעלי יכולת חיסונית נושאי גידול מתוארים כאן. גישה זו עשויה לסייע לחוקרים לזהות ננו-תרופות מבטיחות לסרטן לתרגום קליני.

נוהל מקיף כדי להעריך את<em&gt; In vivo</em&gt; ביצועים של סרטן ננו-רפואה

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

נדידת תאים הוא חיוני עבור פיתוח, רקמות תחזוקה ותיקון, ו tumorigenesis, מוסדר על ידי גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים. פרוטוקול זה מתאר נקודה וזמינותו, העברה דו מימדי, ולמשחקי הנועד להעריך את פנוטיפ הנדידה של גיליונות המצורפת, מלוכדת תא בתגובה רמזים microenvironmental.

באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

במודל חיה יש צורך לפענח את התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום קולוניזציה ריאות במהלך גרורות סרטן. . הנה, הקמנו, לבצע בהצלחה של ויוו assay לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבה fibronectin פולימריים (polyFN) על CTCs ריאות קולוניזציה.

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

מאמר זה מציג נוהל מקיף כדי להעריך במבחנה אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- hemangioblastomas (HBs) ותפקידו HBs. התוצאות להאיר את המורכבות של HB-כורוידאלית, מציע כי זו הצורה השכיחה של אנגיוגנזה הוא רק מנגנון משלים ב- HB-כורוידאלית.

נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay

למד אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG באמצעות זיהוי כימילומינסצנטי לא רדיואקטיבי. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לכימות אורך טלומרים במחקר תאי.

אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG

גלה סרטונים נוספים