Name: טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: חקור טכניקת הדמיה תלת-ממדית המשלבת מיקרוסקופיית אלקטרונים עם שחזור תלת-ממדי לניתוח מורפולוגיה של אברונים בתאי סרטן הלבלב. השיטה מאפשרת ניתוח איכותני וכמותי של מבנים תת-תאיים ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג (Z23H290001, LY19H280001); מענקי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82274364, 81673607 ו-81774011); וכן פרויקט מחקר רווחת הציבור של מענק המדע והטכנולוגיה של הוז'ו (2021GY49, 2018GZ24). אנו מעריכים את העזרה הרבה, התמיכה הטכנית והתמיכה הניסיונית מהפלטפורמה הציבורית של מרכז המחקר הרפואי, האקדמיה למדעי הרפואה הסינית, האוניברסיטה לרפואה סינית ג'ג'יאנג.

1. הכנת החומר
<ol><li>תרבית 2 x 106 תאי Panc02 ב 12 מ"ל של DMEM בינוני (10% סרום בקר עוברי ו 100 U / מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין), ולשמור על 37 ° C ו 95% לחות באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ו 95% אוויר במשך 48 שעות.</li>
	<li>לאסוף תאי Panc02, צנטריפוגה ב 28 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן להשליך את supernatant. ודא כי הדגימה היא בגודל מתאים (1 x 107 תאים), אחרת, שלבי הקיבוע וההתייבשות הבאים לא יפעלו היטב.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של 2.5% גלוטראלדהיד כחומר קיבוע כדי לתקן את תאי Panc02 הטריים בצינורות מיקרו-צנטריפוגות 1.5 מ"ל למשך הלילה ב -4 ° C. הערה: הדגימות צריכות להיות צנטריפוגות במהירות של 1,006 x גרם למשך 5 דקות בכל אחד מהשלבים הבאים (שלבים 1.3-1.11).</li>
	<li>יש לשאוף את חומר הקיבוע, ולשטוף את הדגימות פעמיים במי מלח חוצצים בפוספט 0.1M (PBS), ולאחר מכן לשטוף פעמיים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כל אחת.</li>
	<li>הוסף 50 μL של תמיסה המכילה 1% osmium tetroxide (OsO4) ו 1.5% אשלגן ferrocyanide ביחס של 1: 1 ב 4 ° C במשך 1 שעות. לאחר מכן, שטפו פעמיים עם PBS של 0.1 M במשך 10 דקות בכל פעם, ושטפו עם ddH2O במשך 10 דקות נוספות.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של 1% thiocarbohydrazide (TCH), לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עד 1 שעה, ולאחר מכן לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.</li>
	<li>יש להוסיף 50 μL של 1% OsO4, לתקן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.</li>
	<li>יש להוסיף 1 מ"ל של 2% אורניל אצטט ב-4°C למשך הלילה, ולאחר מכן לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של תמיסת וולטון (0.066 גרם של חנקת עופרת מומסת ב 10 מ"ל של 0.03 mol/L תמיסת מלאי חומצה אספרטית) ב 60 ° C עבור 1 שעה נוספת של דגירה.</li>
	<li>יש לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם, ולאחר מכן לייבש בסדרת אלכוהול מדורגת למשך 10 דקות בכל פעם: 50% אלכוהול, 70% אלכוהול, 80% אלכוהול, 90% אלכוהול 1x ו-100% אלכוהול 2x. לאחר מכן, יש לייבש ב-100% אצטון פעמיים למשך 10 דקות בכל פעם. השתמש 1 מ"ל של כל פתרון עבור התייבשות.</li>
	<li>ערבבו 200 מיקרוליטר אצטון עם שרף אפוקסי Pon 812 ביחס של 3:1, 1:1 ו-1:3. השרו את הדגימה בשרף בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, 4 שעות ו-4 שעות, בהתאמה, ולאחר מכן קחו את שרף האפוקסי 100% Pon 812 כדי לספוג למשך הלילה. הערה: בעת ביצוע שלבי הצביעה והשמעת השרף, חשוב לפעול במכסה אדים מכיוון שמדובר בחומרים רעילים. בנוסף, יש ללבוש מעילי מעבדה וכפפות עמידות בפני ממסים במהלך הניסוי.</li>
	<li>הכניסו את הדגימות לתבנית הטבעה, ולאחר מכן הכניסו לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפילמור. השתמשו בהטבעה שטוחה29 כדי להפחית את מראה השרף סביב הדגימה. פעולה זו מפשטת את התקנת הדגימה ומפחיתה את ההשפעה של טעינת תוצרים על פילוח התמונה הבא. הערה: כדי ליצור לאחר מכן משטח חיתוך אופקי, ניתן להוסיף כמות קטנה של שרף לחור התבנית, תוך הקפדה לא למלא אותו יתר על המידה.</li>
	<li>הכינו פרוסות סיליקון על ידי שטיפתם תחילה ולאחר מכן הידרופיליזציה עם תמיסת H 2 SO4/H 2 O2מרוכזת למשך 30 דקות. אספו רצועות פרוסות סדרתיות בעובי של 70 ננומטר על פרוסות הסיליקון שעברו הידרופיליזציה באמצעות אולטרה-מיקרוטום, וייבשו אותן בתנור של 60°C למשך 10 דקות. הערה: לכוד באיטיות את הפרוסה כשהפרוסה צפה על פני השטח של פרוסות הפרוסות כדי למנוע אובדן או עיוות של הפרוסה.</li>
</ol>2. רכישת תמונה ושחזור תלת מימדי
<ol><li>לפני הרכבת רקיק סיליקון על הבמה, לשטוף את החלקים עם מים מזוקקים שלוש פעמים, ולייבש אותם באוויר. חתכו סרט פחמן מוליך בגודל של 1 ס"מ x 0.5 ס"מ, והדביקו אותו בין פרוסת הסיליקון לשלב הדגימה של SEM כדי להשלים את הגדרת הדגימה (איור 2E).</li>
	<li>הגדר את פרמטר המתח המאיץ FE-SEM ל- 2 kV עם מרחק עבודה של 4 מ"מ (איור 3B וטבלה 1). הערה: כדי לשפר את יחס האות לרעש ולהפחית את הרעש בתמונה, צפה בהגדלות נמוכות במידת האפשר. ככל שהריבוי גדל, טווח הסריקה של ה-SEM מצטמצם, מה שמוביל לעלייה בצבירת המטען על התמונות.</li>
	<li>לחץ על סמל H/L בשורת התפריטים העליונה. תחילה, בהגדלה נמוכה, כוונו את החלק הראשון של רצועות פרוסת היעד, ולאחר מכן לחצו שוב על האפשרות H/L (איור 3A) כדי לעבור למצב הגדלה גבוהה; אסוף תמונה מתאימה למבנה העניין על-ידי התאמת הבהירות, הניגודיות וההגדלה של התמונה.</li>
	<li>בחר Project View > Open Data וייבא את קבצי התמונה לניתוח לתוך התוכנה.</li>
	<li>יישרו את התמונות בלחיצה על ' יישור פרוסות' >'עריכה ' (איור 4B), והתאימו את הערך 'טווח עוצמה ' בשורת התפריטים השמאלית התחתונה באמצעות שינוי שקיפות התמונה. כאן, השתמש באסטרטגיית יישור חצי אוטומטית; באופן ספציפי, באמצעות יישור אוטומטי, הפוך את התמונות לחפיפה עם תמונה קודמת ולאחר מכן בצע כוונון עדין ידני. הערה: בעבודה זו, במהלך תהליך היישור, התמונה הקודמת שימשה כהפניה, ופעולות ההזזה והסיבוב נוצלו כדי לחפוף באופן מרבי את מבנה היעד של שתי התמונות. לחיצה על Align Current Slice Pair יכולה לעזור ליישר את התמונות באופן אוטומטי, אך עלולה להתרחש טעות במיקום.</li>
	<li>בחרו במודול 'חלץ אמצעי אחסון משנה' וגזור את ערכות הנתונים המיושרות כך שיתאימו לגודל החלק החופף של הערימה כולה.</li>
	<li>תחת תת-המקטע סגמנטציה (איור 4C), בחר דגימה מחדש > סגמנטציה > שמור. בחרו בסף מטה הקסם ובגודל הכלי מברשת לבחירת הטווח הנכון. גם כאן, אמצו שיטת סגמנטציה חצי אוטומטית על ידי שימוש תחילה בשרביט הקסמים כדי לבחור באופן אוטומטי שטח גדול מתאים, ולאחר מכן השתמשו במברשת כדי לתאר במדויק את הפרטים. הערה: ניתן להחיל את מטה הקסם על תמונות מקטעים בהתבסס על ההבדלים הברורים בעוצמת הפיקסלים הקיימת בין מבנה העניין לבין המבנים הסובבים אותו על-ידי שינוי ערך המסיכה ושימוש בקו מגבלת הציור. הוא אינו מסוגל להבחין בין תוצרי הטעינה שנוצרו במהלך רכישת התמונה. לכן, זה עלול לגרום לפילוח שגוי עבור אזורי היעד. ניתן להשתמש בכלי מברשת כדי לפלח ידנית כדי לשחזר במדויק את המבנים הביולוגיים.</li>
	<li>תחת פילוח > בחירה, לחץ על סמל + כדי להוסיף את האזור שנבחר (איור 4C).</li>
	<li>חזור על השלב לעיל (2.8) לבחירת אותו מבנה יעד בתמונות שונות עד להשלמת הבחירה לשחזור המיקרו-מבנים המעניינים. הערה: במהלך תהליכי העיצוב מחדש של המיטוכונדריה, הבחירה של אובייקט היעד חייבת להתבצע מתוך התמונה באמצע קבוצה של תמונות רציפות. אם האזור הדרוש נבחר מהתמונה הראשונה או האחרונה, תוצאת השחזור לא תוכל להציג הדמיה תלת-ממדית מלאה.</li>
	<li>לאחר השלמת הפילוח האזורי, צור את קובץ התמונה בהתאם לתוצאות הטובות ביותר עבור גודל האובייקט ורזולוציית התמונה. לחץ על עורך החיתוך ולאחר מכן הזן את הספרה 6 בתיבה המחוון הווירטואלי (איור 4C).</li>
	<li>בתפריט הנפתח משמאל, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האזור האפור תחת סעיף המשנה Project ובחר צור משטח > צור > החל. בקובץ שנוצר, השתמש במודול Surface View כדי ליצור את מבנה פני השטח ואת הייצוג התלת-ממדי.</li>
</ol>3. כימות
<ol><li>לחצו על ' הסר כתמים קטנים' > להחיל (איור 4D). תחת תת-המקטע Project , לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האזור האפור ובחר Label Analysis > Apply (איור 4D).</li>
	<li>התאם אישית את שם העמודה ובחר קבוצת מידה. בחר Volume3d ו- Length3d בתיבה מדידות מקוריות. </li>
	<li>לחץ על הלחצן החל בפינה השמאלית התחתונה של המסך. העתק את הנתונים, וגרף בתוכנה הסטטיסטית, כגון GraphPad.</li>
</ol>

טכניקה תלת ממדית לדמיין כריסטאה מיטוכונדריאלית בתאי סרטן הלבלב

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

השיטה המוצגת כאן היא מדריך שימושי שלב אחר שלב ליישום טכניקת השחזור התלת-ממדי, הכוללת יישום מיקרוסקופ אלקטרונים וטכנולוגיית עיבוד תמונה לערימה וסגמנטציה של תמונות טומוגרפיות דו-ממדיות הנוצרות מקטעים אולטרה-דקים סדרתיים. פרוטוקול זה מדגיש מגבלה של תמונות דו-ממדיות שניתן לטפל בהן על ידי הדמיה תלת-ממדית של אולטרה-מבנה אברון, שיש לו את היתרונות של יכולת שחזור חזקה של המבנים ברמת רזולוציה גבוהה ודיוק גבוה יותר. חשוב מכך, הדמיה תלת ממדית זו יכולה להיות מיושמת על תאי הגידול כדי להפוך את המחקר של מנגנונים פתולוגיים פשוט יותר ואמי...

מיטוכונדריה הם אחד האברונים החשובים ביותר בתא. הם משמשים כמרכז המרכזי של ביו-אנרגטיקה תאית ומטבוליזם 1,2 וממלאים תפקיד קריטי בסרטן3. סרטן הלבלב (PC) הוא אחד מסוגי הסרטן הקשיםביותר לטיפול בשל התפשטותו המהירה ושיעור התמותה הגבוה. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, הנגרם בעיקר על ידי שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית 3,5,6,7, נקשר למנגנוני המחלה העומדים בבסיס PC8. מיטוכונדריה הם גם דינמיים מאוד, אשר בא לידי ביטוי על ידי שינויים תכופים ודינמיים בקישוריות הרשת שלהם ואת מבנה cristae9. העיצוב מחדש של מבנה הקריסטה יכול להשפיע ישירות על תפקוד המיטוכונדריה ועל המצב התאי10,11, אשר משתנים באופן משמעותי במהלך צמיחת תאי הגידול, גרורות ושינויים במיקרו-סביבה של הגידול12,13.
בשנים האחרונות, מדענים חקרו אברון זה באמצעות תצפית EM14,15,16,17; לדוגמה, חוקרים ניתחו את הדינמיקה המיטוכונדריאלית באמצעות טכניקות שחזור תלת-ממדיות 6,7,18,19. הרעיון הכללי והשיטה לשחזור תלת-ממדי של תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים נקבעו רשמית כבר בשנת 196820 וכללו שילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים, עקיפה אלקטרונית ועיבוד תמונה ממוחשב כדי לשחזר את זנב הפאג T4. עד כה, טכנולוגיית הדמיה תלת-ממדית של מיקרוסקופ אלקטרונים עשתה התקדמות משמעותית במונחים של רזולוציית תמונה 21, דרגת אוטומציה22 ונפח עיבוד 23 ושימשה בקנה מידה רחב יותר ויותר במחקר ביולוגי, מרמת הרקמה ועד לרמת האולטרה-מבנה של אברונים בקנה מידה ננומטרי24. בשנים האחרונות, הדמיית תלת מימד במיקרוסקופ אלקטרונים הפכה גם לטכנולוגיה מבטיחה למגוון רחב של יישומים25,26,27.
תשומת הלב הגוברת על cristae מיטוכונדריאלי ממחיש במיוחד את הדרישות החיוניות עבור הדמיית נפח ultrastructural. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) שימש להמחשת דגימות שנאספו על רשת נחושת (400 רשת)28, כאשר קרן האלקטרונים עוברת דרך הקטע. עם זאת, בשל הטווח המוגבל של רשת הנחושת, אי אפשר לצלם באופן מלא פרוסות רציפות של אותו מדגם29. זה מסבך את המחקר של מבני המטרה במהלך הדמיה TEM. בנוסף, TEM מסתמך על משימות ידניות גוזלות זמן ומועדות לשגיאות, כולל חיתוך ואיסוף פרוסות מרובות והדמיה שלהן ברצף21, כך שהוא אינו מותאם לשחזורים אולטרה-מבניים של דגימות בנפח גדול23. כיום, שחזור ברזולוציה גבוהה של דימות דגימה בנפח גדול מושג באמצעות שימוש בציוד מיוחד, כגון מערך מצלמות TEM (TEMCA)30 או שתי מערכות TEMCA מהדור השני (TEMCA2)31, המאפשרות הדמיה אוטומטית בתפוקה גבוהה תוך זמן קצר. עם זאת, סוג זה של הדמיה אין את היתרון של להיות קל להשגה אוניברסלי בשל הדרישה ציוד מותאם אישית.
בהשוואה ל-TEM, השיטה ליצירה אוטומטית של אלפי תמונות נפחיות סדרתיות עבור אזורים גדולים בהתבסס על SEM 32,33 משפרת את היעילות והאמינות של הדמיה טורית ומספקת רזולוציות z גבוהות יותר34. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוקים סדרתי (SBF-SEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) אפשרו שניהם להשיג שחזור תלת-ממדי של אולטרה-מבנה במהירות גבוהה, יעילות ורזולוציה35,36. עם זאת, אין מנוס מכך שמשטח הבלוק מגולח מכנית על ידי סכין היהלום של SBF-SEM או על ידי כרסום עם קרן היונים הממוקדת של FIB-SEM33,37. בשל ההרסניות של שתי השיטות לדגימות, לא ניתן לשחזר שוב את אותו מבנה מטרה לניתוח נוסף38,39,40. בנוסף, מחקרים מעטים ניסו לשחזר את מבנה העל של אברונים תלת-ממדיים של תאים סרטניים באמצעות EM כדי לצפות בשינויים פתולוגיים12. מסיבות אלה, על מנת להבהיר עוד יותר את המנגנונים הפתולוגיים של תאים סרטניים, כגון תאי סרטן הלבלב, אנו מציעים טכנולוגיה חדשנית לשחזור תלת-ממדי של תמונות חתך סדרתי באמצעות אולטרה-מיקרוטום ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה (FE-SEM) לניתוח מבנה העל המיטוכונדריאלי ברמת הקריסטה; באמצעות טכנולוגיה זו ניתן לרכוש נתונים ברזולוציה גבוהה בשיטה יעילה ונגישה. את החלקים האולטרה-דקים הסדרתיים המיוצרים באמצעות אולטרה-מיקרוטום ניתן לאחסן באופן קבוע למחצה במארז רשת ולצלם מחדש מספר פעמים, גם לאחר מספר שנים41. FE-SEM מוערך מאוד ככלי בתחומי מחקר שונים בשל יכולתו לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה, הגדלה גבוהה ורבגוניות42. בניסיון להציג את המבנה העדין של אברונים בתלת-ממד, הטכניקה לייצור ערימות תמונה דו-ממדיות סדרתיות ברזולוציה שימושית באמצעות אלקטרונים מפוזרים לאחור המיוצרים על ידי FE-SEM 43,44 יכולה לשמש גם להשגת הדמיה בתפוקה גבוהה ובקנה מידה רב של אזורי מטרה או מבנים הקשורים אליהם ללא ציוד מיוחד 45. יצירת תוצרי המטען משפיעה ישירות על איכות התמונות שנרכשו, ולכן חשוב במיוחד לשמור על זמן השהייה קצר.
לפיכך, המחקר הנוכחי מרחיב את ההליכים הניסיוניים המשמשים בטכניקת SEM זו כדי לשחזר את המבנה התלת-ממדי של cristaeמיטוכונדריאלי 46. באופן ספציפי, אנו מראים את התהליך שפותח להשגת סגמנטציה חצי-אוטומטית של אזורים מיטוכונדריאליים ודיגיטציה של השחזור התלת-ממדי באמצעות תוכנת Amira, הכוללת גם הכנת דגימות פרוסה באמצעות שיטת הכנת דגימות OTO קונבנציונלית44,47, השלמת איסוף החתכים באמצעות חיתוך אולטרה-מיקרוטומי, והשגת נתונים דו-ממדיים רציפים על ידי FE-SEM.

<table><tbody><tr><td>(1S,3R)-RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>SIGMA</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td>2020.2</td></tr><tr><td>חומצה אספרטית</td><td>MCE</td><td>HY-42068</td><td></td></tr><tr><td>הנשר השונה של דולבקו s בינוני</td><td>Gibco</td><td>11995115</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>MCE</td><td>HY-100579</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה</td><td>HITACHI</td><td>SU8010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>אלפא Aesar</td><td>A10500.22</td><td></td></tr><tr><td>עופרת חנקת</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC-211724</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC-206008B</td><td></td></tr><tr><td>Panc02</td><td>אוסף אירופאי של תרביות תאים מאומתות&nbsp;</td><td></td><td></td>98102213</tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Biosharp</td><td>BL505A</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Pon 812 שרף אפוקסי</td><td>SPI CHEM</td><td>GS02660</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פרוציאניד</td><td>מקלין</td><td>P816416</td><td></td></tr><tr><td>תיוקרבוהידרזיד</td><td>Merck</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>LEICA</td><td>EMUC7</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט</td><td>R032929</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

הבנת התכונות הדינמיות של מבנה העל של אברוני התא, שהוא לא רק עשיר במידע לא ידוע אלא גם מתוחכם מנקודת מבט תלת-ממדית (תלת-ממדית), היא קריטית למחקרים מכניסטיים. מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מציע עומק הדמיה טוב ומאפשר שחזור של ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה כדי לחקור את המורפולוגיה האולטרה-סטרוקטורלית של אברוני התא אפילו בקנה מידה ננומטרי; לכן, שחזור תלת מימד צובר חשיבות בשל היתרונות שאין דומה לו. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) מספק טכנולוגיית רכישת תמונה בתפוקה גבוהה המאפשרת שחזור מבנים גדולים בתלת-ממד מאותו אזור עניין בפרוסות עוקבות. לכן, היישום של SEM בשחזור תלת ממדי בקנה מידה גדול כדי לשחזר את ultrastructure 3D האמיתי של אברונים הופך נפוץ יותר ויותר. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שילוב של חתך אולטרה דק סדרתי וטכניקות שחזור תלת-ממדיות כדי לחקור קריסטות מיטוכונדריאליות בתאי סרטן הלבלב. הפרטים על האופן שבו טכניקות אלה מבוצעות מתוארים בפרוטוקול זה באופן שלב אחר שלב, כולל שיטת osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), הדמיית חתך אולטרה-דק טורי ותצוגת הדמיה.

במהלך תרבית תאים (איור 1A), חילקנו תחילה את תאי סרטן הלבלב לקבוצת ביקורת בתרבית עם מדיום תרבית שלם, קבוצה (1S,3R)-RSL348 (RSL3, מפעיל פרופטוזיס, 100 ננומטר), וקבוצת RSL3 (100 ננומטר) בתוספת פרוסטטין-149 (Fer-1, מעכב פרופטוזיס, 100 ננומטר). באמצעות שלבי הניסוי לעיל, מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק רכש 38 (איור משלים 1), 43 (איור משלים 2) ו-44 (איור משלים 3) תמונות רציפות עבור קבוצת הביקורת, קבוצת RSL3 וקבוצת המעכבים ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשחזר כריסטה מיטוכונדריאלית כדי להשיג הדמיה תלת-ממדית בדיוק גבוה, ברזולוציה גבוהה ובתפוקה גבוהה.

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

פרויקט זה נועד לבחון את ההשפעה האנטי-סרטנית של תרופות על ידי שינוי המבנה ברמה הננומטרית התת-תאית, וביסוס הקשר בין מורפולוגיית אברונים לבין המנגנון הפתולוגי הסרטני. טכנולוגיה זו משלבת טכנולוגיית מיקרוסקופ אלקטרונים מסורתית עם טכנולוגיית שחזור תלת מימדית ללא ציוד מיוחד. בהשוואה לטכניקות אחרות, זה יכול לשפר את יעילות ההדמיה ואת גמישות השחזור, ואת שחזור החיים האמיתיים של מבני המטרה בכל עת.אז זה מאוד קל ואוניברסלי. טכנולוגיה זו של שחזור תלת מימדי של שקופיות דקות במיוחד מתמשך יכול שוב ושוב לשחזר את סטריאוכימי אמיתי ללא ציוד יקר ספציפי. זה יכול לשמש לניתוח איכותי וכמותי של כל האברונים בכל עת.הוא מבין את הפעולה הקלה של התצפית.

a-three-dimensional-technique-for-visualization-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

שיטות רומן בעזרת מחשב של רכש בקנה מידה גדול וניתוח של immunohistochemically דגימות הלבלב מוכתם מתוארים: (1) ללכוד Slice וירטואלי של הסעיף כולו; (2) ניתוח המוניים בקנה מידה גדול של נתונים, (3) שחזור וירטואלי Slices 2D ; (4) מיפוי 3D איון; ו (5) ניתוח מתמטי.

בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

היתוך מיטוכונדריאלי נמדד על ידי מעקב אחר איזון של ה-GFP מטריקס במיקוד photoconverted ברשת המיטוכונדריה לאורך זמן. עד כה, רק תא אחד יכול להיות חשוף ניתוח שעה ארוכה קינטית בכל פעם. אנו מציגים שיטה מודד בו זמנית מספר תאים, ובכך להאיץ את תהליך איסוף הנתונים.

מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal

מקור: Hamid, H. S., {{}}. הדמיה תלת מימדית וניתוח של מיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים אנושיים. }J. Vis. exp. (2017)} } סרטון זה מדגים את השיטה להמחשת מיטוכונדריה ספציפית לעצב באמצעות הדמיה תלת מימדית. הוא מתאר את התהליך של רכישת סריקות עוקבות של סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים מסומנים מראש ויצירת תמונות פני שטח תלת מימדיות כדי לבודד ולהציג מיטוכונדריה ביחס למבני עצבים.

הדמיה של מיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים

פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

כאן, שיטה מתוארת עבור הכנת ספרואיד תלת-ממדי (3D) תרבות משותפת של תאי סרטן הלבלב ו fibroblasts, ואחריו מדידה של פונקציות מטבוליות באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts

ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

In vivo הדמיה ברזולוציה גבוהה של הלבלב היה קל עם חלון הדמיה תוך וינטלית הלבלב.

הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית להדמיית מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות מרובות של C. elegans במהלך ההזדקנות.

הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans במהלך ההזדקנות

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב ומדגישים את הפרטים העיקריים לקביעת מאפיינים מורפולוגיים של מיטוכונדריה בתאים חיים, כולל הכנת דגימות, רכישת תמונה וניתוח נתונים. שיטה זו משמשת בדרך כלל לבחינת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית לחקר מצבים שונים.

קביעת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

כאן אנו מתארים את לוקלייזר האירועים המיטוכונדריאלי (MEL), תוסף ImageJ שימושי בכימות השינויים התלת-ממדיים בביקוע המיטוכונדריאלי ובפעילות ההיתוך לאורך זמן. אנו מתארים גם צינור עיבוד תמונה שימושי לניקוי מיקרוגרפים לפני ניתוח ב-ImageJ.

הבנת השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוגרפים פלואורסצנטיים דינמיים ותלת מימדיים

הזרקות מקומיות של תווית צבע מיטוכונדריאלי סופית של מיטוכונדריה תא שוואן ב-vivo למיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משתמשת בהוכחת היתכנות שהודגמה ברקמת שריר שלד של עכברים עם שריר בריא או חולה, כדי לספק הדמיה מיטוכונדרית ברזולוציה גבוהה.

שיטות לכימות במקום של מורפולוגיית מיטוכונדריה בתאי שריר וסופיים של עכברים

חקור טכניקת הדמיה תלת-ממדית המשלבת מיקרוסקופיית אלקטרונים עם שחזור תלת-ממדי לניתוח מורפולוגיה של אברונים בתאי סרטן הלבלב. השיטה מאפשרת ניתוח איכותני וכמותי של מבנים תת-תאיים ברזולוציה גבוהה.

טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב

גלה סרטונים נוספים