Name: חרוזים מהונדסים בפורפירין לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: למד הכנת חרוזי פוליסטירן מהונדסים בפורפירין TCPP לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה רב-צבעית. שיטה זו מספקת יציבות פלואורסצנטית לאורך חודשים ומאפשרת ניתוח אמין של דגימות ביולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לדיוויד רודריגז על הסיוע בהכנת הדמויות ושירותי הפתולוגיה המדויקת (סן אנטוניו, טקסס) על השימוש בציטומטר הזרימה Navios EX שלה.

כל ההליכים צריכים להיעשות באמצעות ציוד מגן אישי מתאים.
1. הכנת תמיסת מלאי TCPP, 1.0 מ"ג / מ"ל
הערה: ניתן להכין זאת אחת לחודש.
<ol><li>בעזרת איזון אנליטי, מרית ונייר שקילה, שוקלים 49.0-50.9 מ"ג TCPP. עיגלו את המשקולת ל-1/10 מיליגרם. הניחו בצד את הכמות הנמדדת של TCPP המוגנת מפני אור. הערה: השתמש באקדח סטטי אם קריאת המשקל אינה יציבה.</li>
	<li>קבע את הכמויות הנדרשות של מים מטוהרים ואיזופרופנול (IPA) מטבלה 1 בהתבסס על כמות TCPP שנשקלה בשלב 1.1. הוסיפו את המים המטוהרים והאיזופרופנול לכוס זכוכית בנפח 100 מ"ל, וכסו בפרפילם כדי להגן מפני אידוי.</li>
	<li>קבע את הכמות הנדרשת של סודיום ביקרבונט מטבלה 1 בהתבסס על כמות TCPP שנשקלה בשלב 1.1.</li>
	<li>באמצעות האיזון האנליטי, המרית ונייר השקילה, לשקול את הכמות הנדרשת של סודיום ביקרבונט שנקבעה בשלב 1.3. עיגלו את המשקולת ל-1/10 מיליגרם. הערה: השתמש באקדח סטטי אם קריאת המשקל אינה יציבה.</li>
	<li>הוסף את סודיום ביקרבונט לכוס 100 מ"ל המכילה מים מטוהרים ואיזופרופנול. כסו את התמיסה בפרפילם כדי להגן מפני אידוי.</li>
	<li>מניחים את התמיסה משלב 1.5 על צלחת ערבוב, ומערבבים עד להמסה (כ-10 דקות)</li>
	<li>למדוד את ה- pH כדי להבטיח כי תמיסה המכילה סודיום ביקרבונט משלב 1.6 יש pH בין 9 ל 10.</li>
	<li>הוסיפו באיטיות את TCPP במשקל שלב 1.1 לתמיסה משלב 1.7, והמשיכו לערבב עד להמסה (~30 דקות). יש להגן מפני אור במהלך שלב זה.</li>
	<li>יש לאחסן במיכל זכוכית או פוליפרופילן בטמפרטורת החדר ומוגן מפני אור.</li>
</ol>2. הכנת 2-(N -morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) ותמיסת חיץ מלח המיסודיום, 0.1 M, pH 6.0-6.2 ("מאגר MES")
הערה: יש להכין אותו ביום השימוש ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
<ol><li>שקלו 2.50 גרם מלח המיסודיום MES, והוסיפו אותו לבקבוק פלסטיק של 150 מ"ל.</li>
	<li>מוסיפים 121 מ"ל מים מטוהרים, וממיסים על ידי ניעור ידני עד שלא נראה מוצק.</li>
	<li>מדוד את ה- pH של מאגר MES כדי לוודא שהוא בין 6 ל- 6.2.</li>
	<li>יש לשמור בטמפרטורת החדר לשימוש באותו היום.</li>
</ol>3. אבקת N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC)
<ol><li>הוציאו את אבקת ה-EDC מהמקפיא והניחו לה לשבת בטמפרטורת החדר עד לשימוש בשלב 5.</li>
</ol>4. שילוב חרוזי פוליסטירן פונקציונליים עם תמיסת TCPP
<ol><li>הוסף 4.3 מ"ל של תמיסת חיץ MES 0.1 M שהוכנה בשלב 2 לצינור פוליפרופילן 15 מ"ל.</li>
	<li>מערבול את מתלה חרוזי הפוליסטירן המתפקד על ידי אמין (10 מיקרומטר, 2.5% w/v) למשך 60 שניות במהירות מרבית.</li>
	<li>הוסף 288 μL של מתלה חרוזים טרי זה למאגר MES משלב 4.1.</li>
	<li>מערבול את פתרון MES/חרוז למשך 15 שניות במהירות מרבית.</li>
	<li>מערבול את פתרון TCPP 1 מ"ג/מ"ל שהוכן בשלב 1 עבור 60 שניות במהירות מרבית.</li>
	<li>הוסף 1.20 מ"ל של פתרון מניות TCPP טרי זה להשעיית MES/חרוזים משלב 4.4.</li>
	<li>סובב את מתלי MES/חרוז/TCPP למשך 15 שניות במהירות מרבית.</li>
	<li>מכסים את הצינור בנייר כסף בזמן שתמיסת EDC מוכנה.</li>
</ol>5. הכנת תמיסת מלאי N-(3-dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) hydrocholoride (HCl)
הערה: תמיסת EDC מתכלה ויש להשתמש בה מיד לאחר ההכנה.
<ol><li>הוסף 20.0 מ"ל מים מטוהרים לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.</li>
	<li>שקלו 200 מ"ג של EDC HCl משלב 3, והוסיפו אותו למים (שלב 5.1).</li>
	<li>מערבול את EDC HCL במשך 15 שניות במהירות מקסימלית כדי ליצור פתרון ברור.</li>
</ol>6. הכנת פתרון העבודה EDC HCl/MES
הערה: תמיסת EDC HCl/MES מתכלה ויש להשתמש בה מיד לאחר ההכנה.
<ol><li>הוסף 54.0 מ"ל של תמיסת חיץ MES (שהוכנה בשלב 2) לבקבוק פלסטיק של 150 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 6.0 מ"ל של תמיסת מלאי EDC HCl (שהוכנה בשלב 5) לתמיסת מאגר MES, וערבב על-ידי ניעור במשך 10 שניות.</li>
</ol>7. תיוג החרוזים עם TCPP
<ol><li>הוסף 4.5 מ"ל של פתרון עבודה EDC (משלב 6) לצינור פוליפרופילן 15 מ"ל המכיל את החרוזים ו- TCPP במאגר MES (שלב 4.7).</li>
	<li>הניחו את הצינור במסובב הפוך במהירות 35 סל"ד למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר ומוגנים מפני אור.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב-1,000 × גרם.</li>
	<li>שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את החרוזים ב-0.8 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS).</li>
	<li>מעבירים את תמיסת החרוזים לבקבוקון פוליפרופילן ענברי עם פיפטה של 1 מ"ל, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף. הערה: החרוזים יציבים לפחות 3 חודשים בשלב זה.</li>
</ol>8. בדיקת איכות (QC) של חרוזי TCPP לפי ציטומטריית זרימה
הערה: ה- QC צריך להיות מרוכז בשאלה אם עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) של חרוזי TCPP בהירה מספיק לשימוש המיועד שלהם וכמות החלקיקים הנוצרים על ידי ההליך. עיין בסעיף התוצאות המייצגות לקבלת פרטים נוספים.
<ol><li>תייגו צינור פוליסטירן אחד בנפח 5 מ"ל כ"חרוזים שליליים TCPP". הערה: החרוזים השליליים שונים מהחרוזים הפונקציונליים המשמשים לתיוג. ראה טבלת חומרים.</li>
	<li>תייגו צינור אחר כ"חרוזים חיוביים TCPP".</li>
	<li>תייגו צינור אחר כ"חרוזי קשת".</li>
	<li>Aliquot 300 μL של HBSS קר כקרח לתוך צינורות המסומנים עם "חרוזים שליליים TCPP" ו "חרוזים חיוביים TCPP".</li>
	<li>הוסיפו 500 μL של HBSS קר כקרח לצינור המסומן כ"חרוזי קשת".</li>
	<li>מערבלים את מתלה החרוזים הלא פונקציונלי מפוליסטירן (ללא תווית) לזמן קצר במהירות מרבית (2-3 שניות), ומוסיפים 10 מיקרוליטר ממנו לצינור המסומן "חרוזים שליליים TCPP".</li>
	<li>מערבלים את מתלה החרוזים המסומן ב-TCPP (מסתיים בשלב 7.5) לזמן קצר במהירות מרבית, ומוסיפים 3 μL ממנו לצינור "TCPP positive beads".</li>
	<li>מערבבים את מתלה חרוזי הקשת לזמן קצר במהירות מרבית, ומוסיפים שתי טיפות ממנו לצינור "חרוזי הקשת".</li>
	<li>יש לשמור את כל הצינורות על קרח, מכוסים ומוגנים מפני אור.</li>
	<li>התחל את הליכי ההפעלה היומיים המתאימים של ציטומטר הזרימה, ובצע QC כדי לוודא את יישור הנוזלים והלייזר האופטימליים. הערה: עבור חלק זה של הפרוטוקול, ההנחה היא כי המפעיל מאומן בשימוש בציטומטר הזרימה הזמין, כולל הליכי סטנדרטיזציה של פיזור האור ועוצמת הפלואורסצנטיות, כמו גם את העקרונות הבסיסיים של חישוב מטריצת הפיצוי הנכונה.</li>
	<li>הפעל את חרוזי הקשת ואת חרוזי TCPP מבלי לשנות את הגדרות המתח בין הריצות השונות.<ol><li>הפעל ואסוף 10,000 אירועים של חרוזי הקשת.</li>
		<li>בצע שטיפה במים, ואסוף 10,000 אירועים של חרוזים שליליים TCPP.</li>
		<li>בצעו שטיפה במים, ואספו 10,000 אירועים של חרוזים חיוביים ל-TCPP.</li>
		<li>יש לבצע שטיפה במים במשך דקה. הערה: חשוב לבצע שטיפה במים לאחר הפעלת חרוזי TCPP. אם TCPP אינו נשטף מהקווים בציטומטר, קיימת אפשרות ש- TCPP שיורי יכול לסמן תאים בצינור הבא שיירכש.</li>
		<li>בצע את פרוטוקולי הניקוי והכיבוי המתאימים הספציפיים להוראות היצרן עבור הציטומטר. הערה: לקבלת תוצאות מייצגות, ראה איור 1.</li>
	</ol></li>
</ol>9. סינון חרוזים
הערה: אם ה-QC של החרוזים לפי ציטומטריית זרימה (שלב 8) מראה שיעור גבוה של חלקיקים (70% ומעלה), שקול לסנן את תרחיף החרוזים באמצעות הפרוטוקול שלהלן (איור 2).
<ol><li>הוסף 3.20 מ"ל של HBSS קר כקרח ל- 0.8 מ"ל של מתלה חרוזי TCPP שהושלם בשלב 7.5 (יצירת דילול פי חמישה).</li>
	<li>מערבלים את מתלה החרוזים המדולל במהירות מרבית למשך 15 שניות.</li>
	<li>מוציאים את הבוכנה ממזרק חד פעמי של 5 מ"ל.</li>
	<li>התאימו את המזרק לפילטר קצה סיבי זכוכית (5 מיקרומטר, קוטר 13 מ"מ).</li>
	<li>הוסף 4 מ"ל של HBSS למזרק.</li>
	<li>הוסף 0.5 מ"ל של תרחיף חרוזים מדולל מערבול (שלב 9.2).</li>
	<li>השתמש בבוכנה כדי לסנן את המתלה דרך מערך המזרק/מסנן במהירות של כ-2 טיפות לשנייה.</li>
	<li>שטפו את החרוזים על ידי שאיבת 5 מ"ל HBSS טרי לתוך המזרק דרך הפילטר בערך 2 טיפות לשנייה.</li>
	<li>דחפו שוב את ה-HBSS החוצה לתוך מיכל האשפה במהירות של כ-2 טיפות לשנייה.</li>
	<li>כדי להסיר את החרוזים מהמסנן, ציירו עוד 5 מ"ל של HBSS טרי לתוך המזרק דרך המסנן.</li>
	<li>הסר בזהירות את המסנן מהמזרק.</li>
	<li>מוציאים את מתלה החרוזים מהמזרק לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.</li>
	<li>החזירו את הפילטר למזרק וחזרו על שלבים 9.10-9.12 ארבע פעמים נוספות. לאחר מכן השליכו את המסנן והמזרק.</li>
	<li>חזור על שלבים 9.2-9.13 עד שכל החרוזים משלב 9.1 יסוננו. השתמשו במזרק טרי וסננו בכל פעם.</li>
	<li>צנטריפוגו את מתלי החרוזים המסוננים למשך 10 דקות ב-1,000 × גרם בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט של כל צינור 50 מ"ל, והשעו מחדש בעדינות את החרוזים, ומשלבים אותם ב 0.5 מ"ל של HBSS טרי.</li>
	<li>מעבירים את החרוזים עם מיקרופיפטה p1,000 לבקבוקון ענבר, זכוכית או פוליפרופילן חדש, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>חזור על שלב 8 כדי לקבוע אם שיעור החלקיקים הקשורים ל- TCPP במתלה החרוזים המסונן פחת. לקבלת תוצאות מייצגות, ראה איור 3.</li>
</ol>

חרוזים מהונדסים בפורפירין בציטומטריית זרימה

<ol><li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+diagnostic+and+therapeutic+roles+of+porphyrins+and+phthalocyanines+in+photodynamic+therapy%2C+imaging+and+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics.</a> Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).</li>
<li>Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+as+diagnostic+and+therapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent.</a> Molecules. 24 (14), 2669(2019).</li>
<li>Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+the+treatment+and+diagnosis+of+cancer-A+review+of+the+current+clinical+status%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status.</a> Frontiers in Chemistry. 9, 686303(2021).</li>
<li>Berg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin-related+photosensitizers+for+cancer+imaging+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications.</a> Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).</li>
<li>Kessel, D., Reiners, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+pharmaceuticals%3A+Mechanisms+and+detection%29%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection).</a> Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).</li>
<li>Didamson, O. C., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+photodynamic+diagnosis+and+therapy+for+esophageal+cancer%3A+Potential+role+of+functionalized+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine.</a> Pharmaceutics. 13 (11), 1943(2021).</li>
<li>Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Aminolevulinic+acid-induced+protoporphyrin+IX+fluorescence+imaging+for+tumor+detection%3A+Recent+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478(2022).</li>
<li>Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+bladder+cancer+diagnosis+-+The+role+of+autofluorescence+and+photodynamic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).</li>
<li>Iwaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+photodynamic+diagnosis+with+5-aminolevulinic+acid+for+the+detection+of+minimal+residual+disease+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma.</a> The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).</li>
<li>Patriquin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+of+lung+cancer+with+meso+tetra+%284-carboxyphenyl%29+porphyrin-labeled+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum.</a> Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).</li>
<li>Pan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+introduction+to+porphyrin+compounds+used+in+tumor+imaging+and+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).</li>
<li>Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+correlation+between+porphyrin+accumulation+in+cancer+cells+and+functional+positions+for+application+as+a+drug+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier.</a> Scientific Reports. 11 (1), 2046(2021).</li>
<li>Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+approaches+for+the+enhancement+of+porphyrin+skeleton-based+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).</li>
<li>Kou, J., Dou, D., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+photosensitizers+in+photodynamic+therapy+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications.</a> Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).</li>
<li>Wezgowiec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-assisted+delivery+of+photofrin+to+human+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).</li>
<li>Palasuberniam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+kinase+inhibitors+enhance+aminolevulinic+acid-mediated+protoporphyrin+IX+fluorescence+and+PDT+response+in+triple+negative+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines.</a> Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002(2021).</li>
<li>Kim, B., Bohandy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopy+of+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Johns+Hopkins+APL+Technical+Digest%22%5BJournal%5D)">Spectroscopy of porphyrins.</a> Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).</li>
<li>Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+excitation+wavelength+dependent+fluorescence+of+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins.</a> Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry+compensation+standards%3A+internally+stained+fluorescent+microspheres+with+matched+emission+spectra+and+long-term+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability.</a> Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).</li>
<li>Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+spectral+cytometry+toolbox%3A+Coupling+fluorescent+proteins+and+antibodies+to+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres.</a> Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).</li>
<li>Byrd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polystyrene+microspheres+enable+10-color+compensation+for+immunophenotyping+of+primary+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes.</a> Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Compensation in flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).</li>
<li>Kabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+accumulation+in+mitochondria+is+mediated+by+2-oxoglutarate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).</li>
<li>Bederka, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+analysis+by+flow+cytometry%3B+An+effective+platform+to+analyze+the+lung+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment.</a> PLoS One. 17 (8), e0272069(2022).</li>
<li>Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2">https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2</a> (2005).</li>
<li>Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152">https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152</a> (1992).</li>
<li>Grayson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-controlled+sputum+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62785(2021).</li>
<li>Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruthenium-based+macromolecules+as+potential+catalysts+in+homogeneous+and+heterogeneous+phases+for+the+utilization+of+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide.</a> ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).</li>
<li>Yadav, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+preparation+and+applications+of+organo-functionalized+porous+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials.</a> Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).</li>
<li>Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en">https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en</a> (2023).</li>
<li>Shimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+affinity+beads+for+identifying+drug+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-performance affinity beads for identifying drug receptors.</a> Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).</li>
<li>Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+esters+of+N-hydroxysuccinimide+in+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).</li>
<li>El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+coupling+reagents%2C+more+than+a+letter+soup%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptide coupling reagents, more than a letter soup.</a> Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).</li>
<li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%22%5BJournal%5D)">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).</li>
<li>Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization%2C+calibration%2C+and+control+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Standardization, calibration, and control in flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).</li>
<li>Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+porphyrin+chemistry+in+tumor+imaging+and+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy.</a> Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).</li>
<li>Beharry, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+photodynamic+therapy%3A+New+probes+for+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment.</a> Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).</li>
<li>El-Far, M., Pimstone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+28+porphyrins+and+their+abilities+to+localize+in+mammary+mouse+carcinoma%3A+Uroporphyrin+I+superior+to+hematoporphyrin+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Clinical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).</li>
</ol>

כל הכותבים הם עובדים של bioAffinity Technologies.

למרות היישומים הרבים של פורפירינים באבחון סרטן וטיפולים2, קיימת ספרות מוגבלת על השימוש הפוטנציאלי שלהם כמגיב ציטומטרי זרימה לזיהוי אוכלוסיות תאים סרטניים לעומת לא סרטניים ברקמות אנושיות ראשוניות24,25,26. המחקר שלנו על ניתוח ציטומטרי זרימה של כיח אנושי24,27 דורש צביעה של תאי כיח מנותקים עם TCPP וכמה פלואורופורים אחרים. עם זאת, זליגה פלואורסצנטית של...

פורפירינים היו בעלי עניין במשך שנים רבות בתחום הביו-רפואי בשל תכונותיהם הפלואורסצנטיות וממוקדות הגידול 1,2,3. יישומים טיפוליים כגון טיפול פוטודינמי (PDT) וטיפול סונודינמי (SDT) כרוכים במתן סיסטמי של פורפירין לחולה סרטן, הצטברות התרופה בגידול וחשיפה מקומית של הגידול לאור לייזר באורך גל מסוים או אולטרסאונד. החשיפה לאור לייזר או אולטרסאונד מובילה ליצירת מיני חמצן תגובתי על ידי הפורפירין ולאחר מכן למוות תאי 4,5. באבחון פוטודינמי (PDD), פורפירין פלואורסצנטי משמש להבדיל בין תאים סרטניים לתאים נורמליים6. בהקשר זה, פרוטופורפירין IX, פורפירין פלואורסצנטי טבעי המצטבר בגידולים עם הזרקה מערכתית או מקומית של קודמו, חומצה 5-אמינולבולינית (5-ALA), משמש לזיהוי גידולי סטרומה במערכת העיכול, סרטן שלפוחית השתן וסרטן המוח 7,8. לאחרונה, טיפול 5-ALA נחקר כגישה לאיתור מחלה שיורית מינימלית במיאלומה נפוצה9. המעבדה שלנו השתמשה בטטראריל פורפירין TCPP (5,10,15,20-טטרקיס-(4-קרבוקסיפניל)-21,23 H-פורפין) בשל יכולתו להכתים באופן סלקטיבי תאי סרטן ריאה ותאים הקשורים לסרטן בדגימות כיח אנושיות, תכונה שנוצלה בבדיקות אבחון ציטומטריות מבוססות שקופיות וזרימה10.
חלק מהפורפירינים הם דו-תפקודיים בכך שהם יכולים לשמש כסוכנים טיפוליים ואבחוניים 2,11. במחקר ביו-רפואי, פורפירינים דו-תפקודיים כאלה משמשים כדי להעריך כיצד יכולתם להתמקד באופן סלקטיבי ולהרוג תאים סרטניים היא פונקציה של המבנה שלהם, כמו גם כיצד הוא מושפע מנוכחותן של תרכובות אחרות 12,13,14,15,16. ניתן למדוד הן את ספיגת התאים של פורפירינים והן את ציטוטוקסיות שלהם על פלטפורמה ציטומטרית של זרימה באופן בתפוקה גבוהה. ספקטרום הספיגה והפליטה של פורפירינים פלואורסצנטיים הוא מורכב, אך רוב הפלטפורמות הציטומטריות של הזרימה מצוידות כדי לזהות אותן נכון. ספקטרום הספיגה של פורפירינים פלואורסצנטיים מאופיין ברצועת ספיגה חזקה בתחום 380-500 ננומטר, המכונה רצועת סורט. שתיים עד ארבע רצועות ספיגה חלשות יותר נצפות בדרך כלל בתחום התדרים 500-750 ננומטר (Q)17. לייזר כחול של 488 ננומטר, שנמצא ברוב הציטומטרים של זרימה, או לייזר סגול (405 ננומטר) יכולים להפיק אור באורך הגל המתאים כדי לעורר פורפירינים. ספקטרום הפליטה של פורפירינים מציג בדרך כלל שיאים בטווח של 600-800 ננומטר18, מה שמביא לחפיפה ספקטרלית מועטה מאוד עם פלואורוסצאין איזותיוציאנט או פיקואריתרין (PE) פלואורופורים, אך חפיפה ניכרת עם פלואורופורים אחרים הנמצאים בשימוש לעתים קרובות, כגון אלופיקוציאנין (APC), כמו גם פלואורופורים טנדם, כגון PE-Cy5 ואחרים. לכן, בעת שימוש בפורפירינים במבחני ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים, בקרות פלואורופור יחיד חיוניות כדי לתקן כראוי את זליגת הפלואורסצנטיות בתעלות אחרות מזו המיועדת למדוד את הפלואורסצנטיות של הפורפירין.
באופן אידיאלי, פקדי הפלואורופורים היחידים המשמשים לחישוב מטריצת הזליגה עבור פאנל של פלואורופורים (הנקראים גם "בקרות פיצוי") צריכים להיות מורכבים מאותם סוגי תאים כמו הדגימה. עם זאת, שימוש במדגם למטרה זו אינו אופטימלי אם יש מדגם קטן מאוד מלכתחילה או אם אוכלוסיית היעד בתוך המדגם קטנה מאוד (למשל, אם רוצים להסתכל על מחלה שיורית מינימלית או תאים סרטניים בשלבים המוקדמים של המחלה). חלופה שימושית לתאים היא חרוזים יחד עם אותו פלואורופור המשמש לניתוח הדגימה. חרוזים רבים כאלה זמינים מסחרית; חרוזים אלה מסומנים מראש עם הפלואורופור הרצוי (חרוזים ספציפיים לפלואורופור מסומנים מראש)19,20, או שניתן להצמיד להם נוגדן מסומן פלואורסצנטית (חרוזי לכידת נוגדנים)20,21. בעוד חרוזי פיצוי מסחריים זמינים עבור פלואורופורים רבים, חרוזים כאלה אינם זמינים עבור פורפירינים, למרות השימוש הגובר בהם במחקר בסיסי וקליני.
בנוסף לשימור הדגימות ולגודל מתאים של אוכלוסיות חיוביות לעומת שליליות, היתרונות האחרים של שימוש בחרוזים כבקרות פיצוי הם קלות ההכנה, פלואורסצנטיות רקע נמוכה ויציבות מעולה לאורך זמן22. החיסרון הפוטנציאלי של שימוש בחרוזים כבקרת פיצוי הוא שספקטרום הפליטה של הנוגדן הפלואורסצנטי שנלכד על חרוזים עשוי להיות שונה מזה של אותו נוגדן המשמש לסימון התאים. זה עשוי להיות בעל חשיבות ספציפית בעת שימוש בציטומטר זרימה ספקטרלית20. לכן, פיתוח חרוזים כבקרת פיצוי צריך להתבצע על ציטומטר הזרימה שישמש לבדיקה שעבורה מפותחים החרוזים. יתר על כן, התפתחות החרוזים צריכה לכלול השוואה עם תאים המסומנים באותו מגיב צביעה פלואורסצנטי.
כאן, אנו מתארים את ההכנה של חרוזי פיצוי פוליסטירן פונקציונליים TCPP, שעוצמת הפלואורסצנטיות החציונית שלהם בתעלת הגילוי הייתה דומה לזו של תאים המסומנים ב- TCPP בכיח, והשימוש בהם כבקרות פיצוי עבור ציטומטריית זרימה. האוטופלואורסצנטיות של חרוזים שווי ערך, לא פונקציונליים, הייתה נמוכה מספיק לשימוש בהם כבקרות פיצוי פלואורסצנטיות שליליות. בנוסף, חרוזים אלה הפגינו יציבות באחסון במשך כמעט שנה.

<table><tbody><tr><td>בקבוקוני פלסטיק ענבר, 2 מ"ל, תחתית U, מוצרי מחקר מפוליפרופילן</td><td>בינלאומיים&nbsp; &nbsp;</td><td>ZC1028-500</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פוליסטירן אלווינילבנזן (PS/DVB) מצולבים (PS/DVB), 10.6 &mu; קוטר m, 2.5% w/v מתלה מימי, 3.82 x 107 חרוזים/מ"ל, 7.11 x 1011 קבוצות amine / חרוז</td><td>Spherotech</td><td>APX-100-10</td><td>קוטר מפרט 8.0-12.9 אום, מתלה 2.5% w/v 3.82 x 107 חרוזים/מ"ל, 7.11 x 1011 קבוצות אמין /</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים חרוזים, 50 מ"ל, Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>עם רוטור מתאים</td></tr><tr><td>בקבוק פוליסטירן חד פעמי עם מכסה, 150 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-140</td><td></td></tr><tr><td>EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), &ge; 98%</td> <td>סיגמא</td><td>03450-1G</td><td>CAS מס':&nbsp; 25952-53-8</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תאים בודדים FlowJo (v10.6.1)</td><td></td> כיסויי זכוכית BD<td></td><td></td></tr><tr><td>, 22 x 22 מ"מ</td> מסנני מזרק סיבי זכוכית <td>Fisher Scientific</td><td>12-540-BP</td><td></td></tr><tr><td>(Finneran, 5 ומיקרו; מ', קוטר 13 מ"מ)</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1190M60</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, 275 x 75 x 1 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול, פיפטה מכנית בדרגת ACS</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AC423830010</td><td></td></tr>, <tr><td>ערוץ אחד, 100-1000 uL עם טיפים</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td>3123000918</tr><tr><td>MES (22- (N- mopholino)- N'- חומצה אתנסולפונית, מלח המיסודיום</td><td>סיגמא</td><td>M0164</td><td>CAS מס':&nbsp; 117961-21-4</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה Navios EX</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס BX-40 מיקרוסקופ עם מצלמת DP73 ואובייקט 40X עם תוכנת cellSens</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>או</td></tr><tr><td>פיפטות פסטר דומות, זכוכית, 5.75 אינץ'</td> <td>פישר מד</td> pH <td>מדעי 13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>(UB 10 Ultra Basic)</td>בקר פיפטה <td>של Denver Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Drummond)</td><td>Pipete.com</td><td>מזרק פלסטיק DP101</td><td></td></tr><tr><td>, חלקיקי פוליסטירן 5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> 14955452 <td></td></tr><tr><td>(לא פונקציונליים), SPHERO, &nbsp; 2.5% w/v, 8.0-12.9 &micro; מ</td><td>ספרוטק</td><td>PP-100-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליפרופילן, 15 מ"ל,</td> צינורות פוליסטירן חרוטיים <td>של פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>, תחתית עגולה&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי קשת (Spherotech URCP-50-2K)</td>פיפטות סרולוגיות של <td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9207381</td><td></td></tr><tr><td>, חד פעמיות - 10 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות, חד פעמיות - 25 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>CAS מס':&nbsp; 144-55-8</td></tr><tr><td>TCPP (מזו-טטרה (4-קרבוקסיפניל)פורפין)&nbsp; פרונטיר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-393-68</td><td>CAS מס':&nbsp; 14609-54-2</td></tr><tr><td>קורא צלחות ניצוץ Tecan (או דומה)</td> אקדח/מסובב צינור <td>Tecan Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>פישר 2215365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חרוזים מהונדסים בפורפירין לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

ציטומטריית זרימה יכולה לאפיין ולכמת במהירות אוכלוסיות תאים מגוונות בהתבסס על מדידות פלואורסצנטיות. התאים מוכתמים תחילה בריאגנטים פלואורסצנטיים אחד או יותר, כאשר כל אחד מהם מתפקד עם מולקולה פלואורסצנטית אחרת (פלואורופור) הנקשרת לתאים באופן סלקטיבי בהתבסס על המאפיינים הפנוטיפיים שלהם, כגון ביטוי אנטיגן בפני השטח של התא. את עוצמת הפלואורסצנטיות מכל מגיב הקשור לתאים ניתן למדוד על ציטומטר הזרימה באמצעות ערוצים המזהים טווח מוגדר של אורכי גל. כאשר משתמשים בפלואורופורים מרובים, האור מפלואורופורים בודדים גולש לעתים קרובות לתעלות גילוי לא רצויות, מה שדורש תיקון לנתוני עוצמת הפלואורסצנטיות בתהליך שנקרא פיצוי. 
חלקיקי בקרת פיצוי, בדרך כלל חרוזי פולימר הקשורים לפלואורופור יחיד, נדרשים עבור כל פלואורופור המשמש בניסוי תיוג תאים. נתונים מחלקיקי פיצוי מציטומטר הזרימה משמשים ליישום תיקון למדידות עוצמת הפלואורסצנטיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה וטיהור של חרוזי פיצוי פוליסטירן המתפקדים באופן קוולנטי עם מגיב פלואורסצנטי מזו-טטרה (4-קרבוקסיפניל) פורפין (TCPP) ויישומם בפיצוי ציטומטריית זרימה. בעבודה זו, חרוזי פוליסטירן פונקציונליים של אמין טופלו באמצעות TCPP ומגיב צימוד אמיד EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) ב- pH 6 ובטמפרטורת החדר במשך 16 שעות עם תסיסה. חרוזי TCPP בודדו על ידי צנטריפוגה והושעו מחדש במאגר pH 7 לאחסון. חלקיקים הקשורים ל-TCPP נצפו כתוצר לוואי. ניתן להפחית את מספר החלקיקים הללו באמצעות פרוטוקול סינון אופציונלי. חרוזי TCPP שהתקבלו שימשו בהצלחה על ציטומטר זרימה לפיצוי בניסויים עם תאי כיח אנושיים שסומנו עם פלואורופורים מרובים. חרוזי TCPP הוכחו כיציבים לאחר אחסון במקרר במשך 300 יום.

פרוטוקול זה לסימון TCPP של חרוזים הוא מהיר ויעיל יחסית. איור 1 מראה תוצאה מייצגת של תהליך תיוג חרוזי TCPP כפי שנקבע על-ידי ציטומטריית זרימה. איור 1A מראה את הפרופיל הסטנדרטי של חרוזי הקשת, כפי שהוא מזוהה בערוץ המתאים לזיהוי TCPP. חרוזים אלה משמשים כ-QC לסטנדרטיזציה של מתחי הלייזר לגילוי TCPP על ידי ציטומטר הזרימה. איור 1B מראה את פרופיל פיזור האור של פוליסטירן מתפקד אמין, חרוזים המסומנים בתווית TCPP. איור 1C</st...

הפרוטוקול מתאר כיצד חרוזי פיצוי מבוססי פורפירין עבור ציטומטריית זרימה מוכנים על ידי התגובה של חרוזי פוליסטירן פונקציונליים אמין עם TCPP פורפירין ומגיב צימוד אמיד EDC. הליך סינון משמש כדי להפחית את תוצרי הלוואי של החלקיקים.

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...

פיתחנו חרוזי פוליסטירן שהותאמו עם TCPP פורפירין כבקרות פיצוי וציטומטריית זרימה מרובת צבעים. החרוזים המשמשים בפרוטוקול זה הם בעלי עוצמת פלואורסצנטיות דומה לתאי כתמים TCPP ועדיין עברו דרך ציטומטר הזרימה. השגנו זאת וכעת אנו עובדים על שיטות טובות יותר להסרת תוצר הלוואי של החלקיקים.חרוזי פיצוי מהונדסים בפורפירין היו עדיפים על תאים מוכתמים TCPP כבקרות פיצוי. מהירויות אלה היו יציבות לאורך חודשים ללא אובדן משמעותי של פלואורסצנטיות. פורפירינים ידועים כמכתימים תאים סרטניים באופן סלקטיבי.המחקר משלב את הסלקטיביות של פורפירינים עם ציטומטריית זרימה כמותית כפלטפורמה רבת עוצמה לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות אנושיות.

porphyrin-modified-beads-for-use-as-compensation-controls-flow

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

גילוי של מחלה שיורית מינימלית או מדיד (MRD) הוא סמן prognostic חשוב זיקוק הערכת סיכונים, חיזוי relapse ב לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). אלה מקיף הנחיות והמלצות עם שיטות עבודה מומלצות עבור זיהוי עקבי ומדויק וזיהוי של MRD, עשויים לסייע בקבלת החלטות לטיפול יעיל של AML.

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

האבחנה MDS קשה בהיעדר קריטריון מורפולוגי או ציטוגנטיקה אינפורמטיבי. MFC יכול לעזור לעדן את תהליך האבחון של MDS. כדי להיות שימושי עבור הקלינית, הניתוח MFC חייבת להתבסס על פרמטרים מספיקה ירידה לפרטים ורגישות, נתונים צריכים להיות לשחזור בין המפעילים השונים.

Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם

על מנת לבודד ולטהר את קרום הלב למחקרים בסיסיים ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של הביולוגיה שלהם.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

. בעזרת מכשיר מערכת סגור שיטה חדשה זו מאפשרת בידור של אשכולות תת-מילימטר של רקמת האדיפוז המתאימים להשתלה vivo, בתרבות החוץ-גופית ובבידוד תאים נוסף ואפיון.

מיקרו-הפיצול האנושי של רקמת אדיפוז לפנוטיפים של תאים ואפיון

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לניתוק כיח למתלה תא בודד ואת האפיון הבא של תת-קבוצות סלולריות בפלטפורמות ציטומטריות סטנדרטיות של זרימה.

ניתוח כיח מבוקר איכות לפי ציטומטריית זרימה

מחקר זה משתמש cytometry זרימה ושתי אסטרטגיות gating שונות על עכברים מבודדים perfused מוח choroid plexuses; פרוטוקול זה מזהה את תתי-הערכות העיקריות של תאי החיסון המאכלסות מבנה מוח זה.

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מזכוכית זרחית עכבר מיקרוניתוח

המתוארת כאן היא שיטה שניתן להשתמש בה כדי לצלם חמישה פרמטרים פלואורסצנטיים או יותר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent. מתואר צינור ניתוח לחילוץ תאים בודדים מתמונות אלה ולביצוע אנליזה של תא בודד באמצעות אסטרטגיות gating דמויות ציטומטריה של זרימה, אשר יכולות לזהות תת-קבוצות תאים במקטעי רקמות.

הפקה וניתוח של תמונות היסטולוגיה בעלות פרמטרים גבוהים באמצעות ציטומטריה של Histoflow

ציטומטריית זרימה רב-צבעונית עבור טסיות יכולה לזהות תת-סוגים חדשים של טסיות דם בתוך תת-אוכלוסיות טסיות קלאסיות, כגון טסיות מנוחה, אגרגטוריות, פרוקו-קרישה ואפופטוטיות. זה מאפשר השוואה של דפוסי תת-אוכלוסייה שונים המושרים על ידי אגוניסטים שונים של טסיות דם. כאן מתואר בפירוט הליך להקמת פאנל ציטומטריית זרימה רב צבעוני.

ניתוח תת-אוכלוסיות טסיות על ידי ציטומטריית זרימה רב-צבעונית

פרוטוקול זה משלב זרימה ציטומטרית וריצוף RNA של תא בודד כדי לבודד ולאפיין מצבי תאי מיקרוגליה במוח הקטן של מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. הוא משתמש בדיסוציאציה אנזימטית, צנטריפוגה פרקול וצביעה חיסונית כדי לחשוף הטרוגניות של מיקרוגליה ולשפר את ההבנה של תפקידיהם בהתפתחות המוח הקטן ובמחלות.

זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה

למד הכנת חרוזי פוליסטירן מהונדסים בפורפירין TCPP לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה רב-צבעית. שיטה זו מספקת יציבות פלואורסצנטית לאורך חודשים ומאפשרת ניתוח אמין של דגימות ביולוגיות.

חרוזים מהונדסים בפורפירין לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה

גלה סרטונים נוספים