Name: מסגרת קוד פתוח לחישוב מסה של מולקולות טיפוליות מבוססות נוגדנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: למדו לחשב מסות מדויקות של נוגדנים מונוקלונליים ותרופות ביולוגיות באמצעות mAbScale. הכלי מספק פתרון קוד פתוח לחישובי מסה ללא צורך בשרתים חיצוניים, ומבטיח דיוק בתהליך פיתוח התרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים לרוברט שוסטר על הסיוע באימות הנתונים.

זרימת העבודה ברמה גבוהה עבור mAbScale מוצגת באיור 2. לכל שלב יש ענפי החלטה פנימיים מתוחכמים יותר, לולאות וקומבינטוריקה. זרימת עבודה אלגוריתמית מפורטת המתארת את תהליך החישוב מוצגת באיור משלים 1. פלט היישום נשמר בתבנית גיליון אלקטרוני בתיקייה שנבחרה על-ידי המשתמש. קובץ הפלט מורכב ממספר גליונות עבודה נפרדים, שניתן לסווג כקלט המשתמש, חישובי משקל מולקולרי והפניות לנגזרות המסה האיזוטופית הממוצעת (פלט לדוגמה מסופק בטבלאות משלימות). דפי העבודה של קלט המשתמש כוללים את רצפי חומצות האמינו החלבוניות ומידע אחר שהוזן על ידי המשתמש, מסות יסוד ממוצעות ומסות גליקן, המשמשות לחישוב הרכב היסוד ומשקלים מולקולריים שונים. גיליונות חישוב המשקל המולקולרי כוללים את ההרכב הכימי של צורות שונות, המסה המופחתת עם ובלי גליקוזילציה ושינוי כימי, והמסה השלמה עם ובלי גליקוזילציה ושינוי כימי. יריעות המכילות מסות נוגדנים למחצה ייווצרו באופן אוטומטי אם המשתמש מזין שני HCs שונים ו / או שני LCs שונים בדף הקלט של המשתמש, שכן חצאי נוגדנים הם זיהומים ראשוניים שיש לזהות ולכמת ביחס להטרודימר הרצוי. ניתן לגשת לקוד המקור של mAbScale דרך המאגר הבא: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig02.jpg"> איור 2: סקירה כללית של השלבים הכרוכים בחישוב הרכבי יסודות ומסות באמצעות היישום. ניתן להשתמש בקידוד צבע כדי לקשר לזרימת התהליך המתוארת באיור משלים 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
1. פתיחת יישום mAbscale
<ol><li>פתח את יישום התוכנה על ידי לחיצה כפולה על הסמל של קובץ ההפעלה.</li>
</ol>2. הזנת רצף
<ol><li>הזן את רצפי השרשרת הכבדה והשרשרת הקלה בתיבות הטקסט המתאימות המסומנות ב- 1 ללא רווחים.<ol><li>עבור bsAbs, הוסף שרשראות כבדות או קלות נוספות בקבוצה השניה של תיבות הטקסט המסומנות 2. השאירו 2 ריקים עבור mAbs עם שרשראות כבדות זהות ושרשראות קלות.</li>
		<li>סמן את תיבות הסימון N-Terminal Cyclization ו/או C-Terminal Clipping , אם גרסאות אלה של מסוף שרשרת כבדה ישימות.</li>
		<li>הוסף שינויים כימיים, כולל מקשר ומטען עבור מולקולות ADC, לתיבות הטקסט Heavy Chain Chem Mod ו/או Light Chain Chem Mod.<ol><li>ציין שינויים כקומפוזיציות יסוד, כגון CaCl2. השינוי יתווסף לתת-היחידה או לשרשרת החלבונים המתאימים. הערה: ניתן גם להחסיר הרכב כימי מתת-יחידה או שרשרת על-ידי קידומת הרכב היסוד בסימן - . לדוגמה, -H2O יפחית מולקולת מים מהרכב תת-היחידה ומהמסה.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. ציון מספר האג"ח דיסולפידים
<ol><li>ציין את מספר הקשרים הדיסולפידים במולקולות החלבון בתיבת הטקסט המסומנת Total Number of Disulfides.</li>
	<li>הזן את מספר דיסולפידים HC לא מופחתים בתיבת הטקסט Unreduced HC Disulfides ואת מספר דיסולפידים LC לא מופחתים בתיבת הטקסט Unreduced LC Disulfides, בהתאם למידת ההפחתה (מלאה לעומת חלקית). הערה: ניתוח המסה המופחת של תת-יחידות mAb כרוך בהפחתה/הפרדה של השרשראות הכבדות והקלות הקשורות לדיסולפיד.</li>
	<li>אם גליקוזילציה קיימת בשרשרת האור mAb, סמן את תיבת הסימון שרשרת האור היא גליקוזילציה .</li>
</ol>4. הגדרת תיקיית הפלט והפעלת היישום
<ol><li>לחץ על לדפדף כפתור לבחירת תיקיית פלט עבור תיבת הטקסט תיקיית פלט .</li>
	<li>הזן את שם קובץ הפלט ללא סיומת קובץ (נשמר אוטומטית כ- .xlsx) בתיבת הטקסט קובץ Excel (ללא ext). </li>
	<li>לחץ על שלח כפתור להפעלת היישום. ניתן למצוא את קובץ הפלט בתיקייה המיועדת. הערה: ניתן להתאים אישית את המסות היסודיות ואת רשימת הגליקנים על-ידי עריכת קבצי הטקסט המופרדים Element_Mass.csv (קובץ קידוד משלים 1) וגליקן.csv (קובץ קידוד משלים 2), בהתאמה. קבצים אלה חייבים להיות ממוקמים באותה תיקייה שבה נמצא קובץ ההפעלה mAbScale.exe (קובץ קידוד משלים 3) כדי להפעיל את היישום. הבקשה תיסגר אוטומטית לאחר ביצוע אחד. המשתמש יצטרך להפעיל את האפליקציה שוב אם יש צורך בחישוב שני.</li>
</ol>

כלי מבוסס Python לחישוב מסה מדויק של ישויות ביותרפיות

<ol><li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li>
<li>Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+developing+next-generation+protein+therapeutics+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).</li>
<li>Wang, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+biology%2C+and+structure-based+therapeutics+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline">https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline</a> (2018).</li>
<li>Donnelly, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+and+benchmarks+for+intact+protein+analysis+for+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry.</a> Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).</li>
<li>Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+mass+accuracy+of+high+performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+intact+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).</li>
<li>Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosimilar%2C+biobetter%2C+and+next+generation+antibody+characterization+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).</li>
<li>Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-dimensional+LC-MS%3A+the+next+generation+characterization+of+antibody-based+therapeutics+by+unified+online+bottom-up%2C+middle-up+and+intact+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches.</a> Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).</li>
<li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+structures+of+IgG+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond structures of IgG molecules.</a> mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li>
<li>Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+biotherapeutics+using+protein+a+chromatography+coupled+to+orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).</li>
<li>Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobotham%2C+AC+%22Approaches+to+the+Purification%2C+Analysis+and+Characterization+of+Antibody-Based+Therapeutics%22">Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics</a>. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).</li>
<li>Valeja, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+mass+baseline+resolution+for+an+intact+148+kDa+therapeutic+monoclonal+antibody+by+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).</li>
<li>Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+analysis+of+monoclonal+antibodies+with+electron+transfer+dissociation+orbitrap+fourier+transform+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).</li>
<li>Berglund, M., Wieser, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+compositions+of+the+elements+2009+%28IUPAC+Technical+Report%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report).</a> Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ame2012+atomic+mass+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Physics+C%22%5BJournal%5D)">The Ame2012 atomic mass evaluation.</a> Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).</li>
<li>Peri, S., Steen, H., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPMAW--A+software+tool+for+analyzing+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).</li>
<li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).</li>
<li>De Leoz, M. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interlaboratory+study+on+glycosylation+analysis+of+monoclonal+antibodies%3A+Comparison+of+results+from+diverse+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).</li>
<li>Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+monoclonal+antibody+N-glycosylation+-+Structure%2C+function+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential.</a> Biologicals. 52, 1-11 (2018).</li>
<li>Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring+integrated+into+a+search+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring integrated into a search engine.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).</li>
<li>Chalkley, R. J., Clauser, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+site+localization+scoring%3A+Strategies+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification site localization scoring: Strategies and performance.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).</li>
</ol>

תוכנה זו משוחררת תחת רישיון Apache 2.0. זכויות יוצרים (2022) של GlaxoSmithKline Research &; Development Limited. כל הזכויות שמורות. רישיון תחת רישיון אפאצ'י, גרסה 2.0 ("הרישיון"); אינך רשאי להשתמש בקובץ זה אלא בהתאם לרישיון. תוכל לקבל עותק של הרישיון בכתובת http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. אלא אם כן נדרש על פי החוק החל או הוסכם בכתב, תוכנה המופצת במסגרת הרישיון מופצת על בסיס "כמות שהיא", ללא אחריות או תנאים מכל סוג שהוא, מפורשים או משתמעים. עיין ברישיון לקבלת השפה הספציפית המסדירה הרשאות והגבלות במסגרת הרישיון. L.C. הוא עובד GlaxoSmithKline (GSK). T.H. ו-K.K פיתחו תוכנה זו כעובדים של GSK וכיום הם שותפים של Merck ו-Moderna, בהתאמה.

mAbScale מספק ממשק משתמש אינטואיטיבי עם הגמישות לשנות את אבני הבניין עבור חישובי מסה ואלמנטים. המשתמשים צפויים להיות בעלי הבנה בסיסית של מולקולת המטרה כדי להשתמש ביישום, לגזור מסות נכונות ולפרש את התוצאות. לדוגמה, גיליון פלט המסה השלם או המופחת יכול להיות מכריע בשל שורות רבות של מסות שלמות או מופחתות, שכן מסד הנתונים גליקן ברירת המחדל מכיל 88 גליקנים מקושרים N הנמצאים בדרך כלל בחלק Fc של נוגדנים טיפוליים, והיישום מחשב את כל המסות הגליקוליפורמיות האפשריות הכלולות במסד הנתונים18, <sup cla...

במהלך שני העשורים האחרונים, ביותרפיות התפתחו והפכו לעמוד התווך של תעשיית התרופות המודרנית. מגיפת SARS-CoV2 ומצבים מסכני חיים אחרים הגבירו עוד יותר את הצורך בפיתוח מהיר ורחב יותר של מולקולות ביו-פרמצבטיות 1,2,3.
המשקל המולקולרי הביותרפי הוא קריטי לזיהוי המולקולה, בשילוב עם בדיקות אנליטיות אחרות. מסות תת-היחידות השלמות והמופחתות משמשות לאורך מחזורי חיי הגילוי והפיתוח כחלק מאסטרטגיות בקרה שמטרתן לשמור על האיכות, כמתואר ב-QTPP (Quality Target Product Profile)4.
הפיתוח האנליטי בתעשיית הביו-פרמצבטיקה מסתמך במידה רבה על מדידות מסה לניתוח מסה שלם ואפיון עמוק באמצעות מיפוי פפטידים או ניטור בשיטה מרובת תכונות (MAM). במרכז טכניקות אלה המשתמשות בפלטפורמות ספקטרומטריית מסות מודרניות (MS) נמצאת היכולת לספק מדידות מסה מדויקות ברזולוציה גבוהה (HR/AM). רוב מכשירי HR/AM מניבים דיוקי מסה בטווח של 0.5-5 ppm, אשר מתרחבים עם טווח המסה. היכולת למדוד מסות במדויק עבור מולקולות גדולות שלמות מאפשרת זיהוי מהיר ובטוח של טיפולים במולקולות גדולות. מכיוון שלא ניתן להגיע לרזולוציה איזוטופית בתנאי ניסוי אופייניים למולקולות גדולות (&gt;10 kDa), יש לחשב מסות ממוצעות לצורך השוואה וזיהוי 5,6.
ספקטרום מסה טיפוסי של חלבונים שלמים או תת-יחידות מייצג את הפרופיל הפרוטיאופורמי הכולל, המכיל מידע מרוכב על הצורות המולקולריות השונות הנובעות משינויים שלאחר התרגום (PTM) וכל הבדלי מבנה ראשוניים, כגון קליפים או גרסאות רצף. האופי הקל יחסית ובתפוקה הגבוהה של מדידות אלה הופך אותן לאטרקטיביות לאפיון וכבקרות ניטור בתהליך 7,8. ניתוח נתונים עבור ניסויים אלה דורש בדרך כלל מהמשתמש להגדיר את מרחב החיפוש עבור צורות מולקולריות (טווח של PTM או צורות מולקולריות אחרות). עבור חלבונים מסוכררים, מרחב חיפוש זה מונע במידה רבה על ידי הטרוגניות גליקוזילית. שילובים של PTM מרובים, תצורות קשר דיסולפידיות ווריאציות אחרות לאורך המבנה הראשוני הופכים את חישוב כל הצורות המולקולריות האפשריות למשימה מייגעת. לכן, החישוב הידני של הצורות המולקולריות האפשריות הוא תהליך גוזל זמן ומשאבים עם פוטנציאל גבוה לטעויות אנוש.
כאן, אנו מציגים כלי חישוב מסה שפותח בהתחשב בתכונות החשובות ביותר של מולקולות ביותרפיות, כגון mAbs, bsAbs, ADCs וכו '. הכלי מאפשר שילוב קל של משתני מרחב חיפוש לחישוב עקבי של מסות והרכבי יסודות. אופיו המודולרי של כלי זה יאפשר להמשיך לפתח אותו וליישם אותו לחישוב מסה והתאמת מסה לשיטות אחרות.
מודול ממשק המשתמש הגרפי מאפשר למשתמש לציין את הקלט לחישוב המסה, כפי שמוצג באיור 1; באופן ספציפי, המשתמש מזין רצפי חומצות אמינו של אות אחת עבור שרשראות נוגדנים קלות וכבדות. שינויים נפוצים עבור מחזוריות N-terminal בשרשרת כבדה וגזיר ליזין C-terminal כלולים כתיבות סימון. יתר על כן, ניתן להוסיף / להחסיר את הנוסחה הכימית / הרכב היסוד משרשראות חלבונים אלה באמצעות תיבת הטקסט המתאימה Chem Mod . זה מאפשר למשתמש את הגמישות להוסיף הרכב יסודי הכולל שינויים מרובים לאחר התרגום או מטען מולקולה קטנה במקרה של ADC. מכיוון שרוב ה- mAbs הטיפוליים מתוכננים להסיר את אתרי הגליקוזילציה בשרשרת האור, גליקוזילציה בשרשרת האור נותרת אופציונלית וניתן להגדיר אותה באמצעות תיבת סימון בממשק המשתמש הגרפי.
וריאציה טיפוסית על ניתוח מסה שלמה עבור נוגדנים היא ניתוח מסה תת-יחידה מופחתת, שבו השרשרת הקלה מנותקת מהשרשרת הכבדה על ידי הפחתת הקשרים הדיסולפידים הבין-שרשרתיים. בהתאם לחוזק של סוכן מחזרים בשימוש, קשרים דיסולפיד intrachain עשוי או לא יכול להיות בקע. למשתמשים יש את הגמישות להזין את המספר הכולל של אג"ח דיסולפיד בהתאם לתת-סוג IgG או במקרה של ADC מצומד ציסטאין9.
היישום מחשב מסות באופן מלמטה למעלה, שבו ההרכבים היסודיים מחושבים תחילה עבור שרשראות כבדות בודדות ושרשראות קלות. לאחר מכן, שרשרת כבדה (HC) N-terminal cyclization Lys-clipping מטופל על ידי התאמת הרכבי היסוד מחושבים. כל שינוי כימי שצוין מוחל לאחר מכן על השרשראות הכבדות ו / או הקלות. בהתאם לסוג הניתוח ולדפוסי הקשר הדיסולפידים שצוינו על ידי המשתמש, מספר המימנים מותאם לשתי שרשראות הפוליפפטידים. המסות HC גליקוזילציה ושרשרת אור (LC) (אופציונליות) מחושבות בהתבסס על הקלט של המשתמש. לבסוף, מסות HC ו- LC מרובות משולבות, ומספרי הקשר הדיסולפידים מתעדכנים אוטומטית לחישוב המסה השלם.
עם מולקולות גדולות יותר כגון חלבונים שלמים, לא ניתן למדוד מסות מונואיזוטופיות בגלל פגם המסה התוסף בעת שימוש בספקטרומטרים של מסות עם כוח פתרון אופייני. במקום זאת, מסות נומינליות או ממוצעות נמדדות או מדווחות 5,10,11,12,13. מסות היסוד הממוצעות יכולות להשתנות בהתאם למקור המשמש למסות14,15. בעוד שההבדלים במסות היסוד עשויים להיות קטנים, הם יכולים להצטבר לערכים משמעותיים עבור חישובי משקל מולקולרי של מולקולות גדולות. המסות היסודיות הממוצעות המשמשות כברירת מחדל ביישום התוכנה מוצגות בטבלה משלימה 1. עבור סביבות מוסדרות כמו מחקר ופיתוח ביו-פרמצבטי (R&amp;), חשוב לשמור על מסות מולקולריות עקביות מכיוון ששינויים במסות עשויים לרמוז על שינויים בישות המולקולרית במהלך הגשות רגולטוריות. כדי לאפשר עקביות בשימוש במסות יסוד, מילון של מסות יסוד נכלל בכלי התוכנה כקובץ טקסט של ערכים מופרדים באמצעות פסיקים (csv): Element_Mass.csv (קובץ קידוד משלים 1). באופן דומה, רשימה של הרכבי גליקן הנראים בדרך כלל ב- mAbs כלולה: גליקן.csv (קובץ קידוד משלים 2). שני הקבצים נשמרים באותו מיקום תיקיה כמו יישום הפעלה, והמשתמש יכול לשנות אותם כדי להשתמש ברשימת מסת רכיבים ספציפית או בספריית גליקן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg"> איור 1: ממשק GUI עבור יישום mAbScale. מודול GUI מאפשר למשתמש לציין את הקלט לחישוב המסה. המשתמש מזין רצפי חומצות אמינו בנות אות אחת עבור שרשראות הנוגדנים הקלות והכבדות. שינויים נפוצים עבור מחזוריות N-terminal בעלת שרשרת כבדה וגזיר ליזין מסוף C כלולים כתיבות סימון. נוסחאות כימיות / הרכבי יסודות ניתן להוסיף / להחסיר באמצעות תיבת הטקסט המתאימה Chem Mod . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>מערכת UPLC Acquity&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>N/A</td><td>מערכת מודולרית</td></tr><tr><td>מצומד נוגדנים-תרופה (ADC)</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>מולקולה קניינית</td></tr><tr><td>BEH 200 SEC column&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>176003904</td><td></td></tr><tr><td>mAb דו-ספציפי</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A</td><td>מולקולה קניינית</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics, קופרטינו, קליפורניה</td><td>https://proteinmetrics.com/byos/ גרסה 4.5</td><td></td></tr><tr><td>GPMAW</td><td>GPMAW</td><td>http://www.gpmaw.com/</td><td></td></tr> <tr><td>מים בדרגת LC-MS&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>mAb סטנדרטי&nbsp;</td><td>Waters Corp., Milford, MA</td><td>186009125</td><td>Waters Humanized mAb Mass Check Standard</td></tr><tr><td>mAbScale</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Apache License, גרסה 2.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF ספקטרומטר מסה</td><td>Waters Corp., מילפורד, MA</td><td>N/A</td><td>מערכת מודולרית</td></tr></tbody></table>

מסגרת קוד פתוח לחישוב מסה של מולקולות טיפוליות מבוססות נוגדנים

An Open-Source Framework for Mass Calculation of Antibody-Based Therapeutic Molecules

מסות ביותרפיות הן אמצעי לאימות זהות ושלמות מבנית. ספקטרומטריית מסות (MS) של חלבונים שלמים או תת-יחידות חלבונים מספקת כלי אנליטי קל לשלבים שונים של פיתוח ביו-פרמצבטי. זהות החלבון מאושרת כאשר המסה הניסויית מטרשת נפוצה נמצאת בטווח טעות מסה מוגדר מראש של המסה התיאורטית. בעוד שקיימים מספר כלים חישוביים לחישוב משקלים מולקולריים של חלבונים ופפטידים, הם לא תוכננו ליישום ישיר על ישויות ביותרפיות, יש להם מגבלות גישה עקב רישיונות בתשלום, או שהם דורשים העלאת רצפי חלבונים לשרתים מארחים. 
פיתחנו שגרת חישוב מסה מודולרית המאפשרת קביעה קלה של המסות הממוצעות או המונואיזוטופיות וההרכבים היסודיים של גליקופרוטאינים טיפוליים, כולל נוגדנים חד-שבטיים (mAb), נוגדנים דו-ספציפיים (bsAb) והצמדות נוגדנים-תרופות (ADC). האופי המודולרי של מסגרת חישוב מבוססת פייתון זו יאפשר להרחיב פלטפורמה זו לשיטות אחרות כגון חיסונים, חלבוני היתוך ואוליגונוקלאוטידים בעתיד, ומסגרת זו יכולה להיות שימושית גם לחקירת נתונים ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. על ידי יצירת יישום שולחן עבודה עצמאי בקוד פתוח עם ממשק משתמש גרפי (GUI), אנו מקווים להתגבר על המגבלות סביב השימוש בסביבות שבהן לא ניתן להעלות מידע קנייני לכלים מבוססי אינטרנט. מאמר זה מתאר את האלגוריתמים והיישום של כלי זה, mAbScale, לשיטות טיפול שונות מבוססות נוגדנים.

מגוון של mAbs נבחרו כדי לייצג סוגים שונים של mAbs. תקן mAb זמין מסחרית נבחר לייצג mAb קונבנציונלי עם שרשראות כבדות זהות, שרשראות קלות זהות ואתר גליקוזילציה N-linked אחד באזור Fc. mAb עם גליקוזילציה N-linked נוספת בשרשרת קלה, mAb דו-ספציפי ו-mAb מצומד נוגדנים-תרופות (ADC) נבחרו גם הם כדי להרחיב את השימוש ביישום. ההרכב הכימי, המסה המחושבת, המסה הנמדדת ושגיאת המסה של mAbs לדוגמה אלה מסוכמים בטבלה 1. ההרכבים הכימיים של החלבונים והמסות המחושבות שדווחו על ידי mAbScale אושרו על ידי GPMAW16</su...

מאמר זה מתאר את השימוש ביישום תוכנה, mAbScale, לחישוב מסות עבור טיפולים חלבוניים מבוססי נוגדנים חד שבטיים.

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides ...

האתגר בחישוב מסה מדויק עבור מולקולות חלבון גדולות הוא פגם המסה הקשור למדידה. כתוצאה מכך, ניתן למדוד רק מסות ממוצעות. הבדלים קלים במסת היסוד עשויים להצטבר ולגרום לפערים משמעותיים במולקולות פארתרפיות גדולות כמו נוגדנים חד-שבטיים.הכלי שלנו מתייחס במפורש לאתגר בחישוב המסה העקבי עבור טיפולים מבוססי נוגדנים, כגון MAPs, bispecifics ותרופות נוגדנים מצומדות. חוקרים בתחום הפיתוח הביו-פרמצבטי המסחרי נאלצים להסתמך על חישוב ידני או כלים שאינם תלויים בתקשורת עם שרתים חיצוניים בשל מעורבותו של מידע קנייני. כלים קיימים דורשים רישיון או אינם בנויים בהתחשב בצרכים הספציפיים של פיתוח ביו-פרמצבטי.MapScale מציעה ממשק ידידותי למשתמש ומסגרת קוד פתוח ניתנת להתאמה עבור משתמשים ומפתחים. הוא תומך בשמירה על גרסאות מרובות של מסות יסוד ורשימות שינויים, ומאפשר שיתוף רשימות כדי לשמור על עקביות בחישובים. ניתן לשתף את הקוד ברמת הארגון באמצעות שרתים פנימיים או פריסה מבוססת ענן עם גישה מבוקרת להגנה על מידע קנייני.

an-open-source-framework-for-mass-calculation-antibody-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה אנו מדגימים את השימוש בפוטומטריית מסה כדי לחקור אינטראקציות אנטיגן-נוגדנים בתא זרימה. האור הממוקד מתפזר באופן שונה בהתאם למסת המולקולות. גלאי אוסף את האור המפוזר ויוצר את תבנית ההתאבכות ככתמים בעוצמות שונות, המתואמות את המסות המולקולריות.

פוטומטריה המונית לחקר אינטראקציות אנטיגן-נוגדנים ברמת מולקולה אחת

שיטה מתוארת בליווי חזותי לניהול בחירות להרחבה, תפוקה גבוהות מספריות נוגדן סינתטיות קומבינטורית-מוצג הפאג נגד מאות אנטיגנים בו-זמנית. שימוש בגישה זו במקביל, יש לנו מבודד שברי נוגדן שמפגינים זיקה גבוהה וספציפיות לאנטיגנים שונים כי הם פונקציונליים בimmunoassays הסטנדרטי.

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של נוגדן טיפולי מערכת ביטוי יונקת. השיטות שתוארו כוללות הכנת DNA וקטור, transfection היציבה והתאמת סרום ללא של קו תא 293 כליות עוברי אנושי, להקים תרבויות בקנה מידה גדולות טיהור באמצעות כרומטוגרפיה זיקה.

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

פפטידים ויראלי-derived מצמידים נוגדן-conjugates (ACs) היא גישה צובר תאוצה בשל הפוטנציאל להעברת מטענים מולקולרית עם הצטברות תאי הגידול מוגברת. ניצול שיטות נפוצות כדי להעריך את ההטיה פפטיד, AC הצטברות תאיים המטען ואת הגידול מיקוד, פרוטוקול זה מסייע החוקרים במהלך שלבי הפיתוח מפתח.

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

שילוב נגזרת cyclopropene של ליזין נוגדנים מאפשר הצמדה בייעודי לאתר, מהיר ויעיל של מולקולות tetrazine מניבי לייצר נוגדן-סמים conjugates.

קידוד גנטי חומצת אמינו קאנונית לדור של נוגדן תרופתיים Conjugates דרך תגובה מהירה Bioorthogonal

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור ניתוח ו ויזואליזציה של המבנה ואת חוקת כל נוגדן repertoires. פעולה זו כוללת הרכישה של רצפי העצום של שימוש הדור הבא רצפי RNA נוגדן.

זיהוי של נוגדנים אנושיים Repertoires על ידי הדור הבא רצפי של עכבר

אנו מתארים גישה של מולקולה אחת למדידות זיקה לאנטיגן-נוגדנים באמצעות פוטומטריה המונית (MP). הפרוטוקול מבוסס MP הוא מהיר, מדויק, משתמש בכמות קטנה מאוד של חומר, ואינו דורש שינוי חלבון.

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

במאמר זה אנו מציגים שיטה לזיהוי תרכובות המווסתות את מנגנון ADCC, מנגנון חשוב להרג תאים סרטניים של נוגדנים אנטי-סרטניים. ההשפעה ציטוטוקסית של תאי NK נמדדת בספרואידים של תאי סרטן השד בנוכחות Trastuzumab. ניתוח תמונה מזהה רוצחים חיים ומתים ותאי מטרה בספרואידים.

כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

למדו לחשב מסות מדויקות של נוגדנים מונוקלונליים ותרופות ביולוגיות באמצעות mAbScale. הכלי מספק פתרון קוד פתוח לחישובי מסה ללא צורך בשרתים חיצוניים, ומבטיח דיוק בתהליך פיתוח התרופות.

מסגרת קוד פתוח לחישוב מסה של מולקולות טיפוליות מבוססות נוגדנים

גלה סרטונים נוספים