Name: שיטת חליבת המוח לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: למד שיטת חליבת מוח לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות. שיטה זו מאפשרת איסוף תאים חוזר ללא פגיעה ברווחת בעלי החיים ומסייעת בחקר מנגנוני זיכרון ולמידה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר רפואי פעולה (בריטניה) (GN2291) ל- R.J.M.F. ו- I.K. עבודת המחקר נתמכה גם באופן חלקי (עלויות בעלי חיים ותמיכה ל- D.D) על ידי הקרן ההלנית למחקר וחדשנות (H.F.R.I.) תחת "קול קורא ראשון לפרויקטי מחקר של H.F.R.I לתמיכה בחברי סגל וחוקרים ורכישת מענק ציוד מחקר בעלות גבוהה" (מספר פרויקט: 3395).

הליכי גידול, תחזוקה וניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק הבריטי לבעלי חיים (הליכים מדעיים) 1986, שאושר על ידי משרד הפנים, ועם הצו הנשיאותי 56/2013 של הרפובליקה ההלנית, שנבחן על ידי גופי רווחת בעלי החיים והביקורת האתית של אוניברסיטאות קיימברידג 'ופטרס, וכן אושר ונבדק על ידי הוועדה המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (מספר פרוטוקול: 5675/39/18-01-2021). נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley, Wistar ו-Long-Evans, שגילן נע בין חודשיים לארבעה חודשים ומשקלי הגוף שלהן בין 150 גרם ל-250 גרם. הפרוטוקול מסוכם באופן גרפי באיור 1.
1. שחרור הכנת קוקטייל
הערה: יש להכין טרי ביום ההליך ולשמור על קרח. הכמויות ניתנות לכל 2 μL שיוזרקו i.c.v בכל חדר לטרלי. יש להכין 1 מיקרוליטר נוספים לכל זריקה מיועדת.
<ol><li>הכינו 0.5 μL של 500 mU neuraminidase מ Clostridium perfringens (Clostridium welchii). הערה: אחסן אותו כמלאי U/μL 1 מדולל במים סטריליים בטמפרטורה של -20°C. סוגים אחרים של neuraminidases לא נבדקו.</li>
	<li>הכינו 1 μL המכיל 1 מיקרוגרם של נוגדן חוסם integrin-β1. הערה: אחסן אותו בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>הכינו 0.5 מיקרוליטר המכיל 0.5 מיקרוגרם של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (FGF-בסיסי אנושי רקומביננטי). הערה: יש לאחסן אותו כציר של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר מדולל במים סטריליים בטמפרטורה של -20°C.</li>
</ol>2. הזרקת קוקטייל שחרור
הערה: ניתן לבצע את התהליך כולו תוך 20 דקות. יש להקפיד לבצע את הניתוח בתנאים אספטיים. נקו את כל המשטחים עם חומר חיטוי (למשל, 3% או 6% מי חמצן). השתמשו בכלים, כפפות, חלוקים ווילונות אוטומטיים או סטריליים בקלות.
<ol><li>מרדימים את חיית הניסוי בשאיפת איזופלורן (2.5% לאינדוקציה ו-2% לתחזוקה). אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הקרנית, התגובה לגירויים (בדיקת צביטת הגפה האחורית והזנב) ואופן הנשימה. הערה: ניתן לבצע הליכים כירורגיים בהרדמה כללית המושרה על ידי הרדמה תוך צפקית (למשל, קטמין [40 מ"ג / ק"ג] וקסילזין [10 מ"ג / ק"ג]). הרדמה עמוקה אושרה על ידי בדיקת רפלקס הקרנית, התגובה לגירויים (בדיקת צביטת הגפיים האחוריות והזנב) ואופן הנשימה.</li>
	<li>מתן שיכוך כאבים תת עורי (למשל, 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine) עם השראת הרדמה.</li>
	<li>הרכיבו את החולדה על המסגרת הסטריאוטקסית.</li>
	<li>לגלח את הפרווה של הראש עם סכין גילוח ולנקות את העור עם חיטוי, כגון 10% povidone-יוד פתרון ולאחר מכן אלכוהול. החל את החיטוי שלוש פעמים באמצעות צמר גפן סטרילי. שפשפו בתנועה מעגלית במשך 3-5 שניות בכל פעם. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש.</li>
	<li>בצע חתך של 2 ס"מ בעור הראש לאורך קו האמצע באמצעות אזמל סטרילי.</li>
	<li>יש לנקות את הגולגולת בקפידה באמצעות מקלונים סטריליים ומלוחים סטריליים.</li>
	<li>זהה את הברגמה באמצעות קצה המחט של מזרק המילטון 10 μL המותקן על המכשיר הסטריאוטקסי. הגדר את הברגמה כ"נקודה 0,0". הערה: הברגמה מזוהה כנקודת ההצטלבות בין התפרים הסגיטליים והעטרה. פרטים נוספים ניתן למצוא באטלס המוח של החולדות של פקסינוס וווטסון5.</li>
	<li>העבר את ההתקן לקואורדינטות anterioposterior (AP) = 0.3 מ"מ, לרוחב (L) = +1.2 מ"מ (כדי לכוון ל-SEZ), או AP = 1.5 מ"מ, L = +2.0 מ"מ (כדי לכוון ל-CC).</li>
	<li>קדח חור בור בקוטר 1 מ"מ באמצעות מקדחה דנטלית. הערה: בעת קידוח ידני, יש להיזהר שלא לפגוע במשטח קליפת המוח. הדימום לא צפוי להיות משמעותי. נקה כל דם עם מלוחים ולהפעיל לחץ כדי לעצור דימום מתמשך יותר.</li>
	<li>לטעון 4 μL של קוקטייל שחרור מזרק 10 μL המילטון.</li>
	<li>הורידו את המחט (רצוי קצה קהה או חרוט) של מזרק המילטון על מנת ליצור קשר עם הדורה.</li>
	<li>הכנס את המחט בעומק הרצוי (D = 3.5 מ"מ). הערה: שפכו מי מלח על פני השטח של הדורה כדי לשמור על הרקמה רוויה.</li>
	<li>יש להחדיר 2 μL של קוקטייל השחרור בקצב של 1 μL/min.</li>
	<li>השאירו את המחט במקומה עוד 2 דקות לפני שליפה איטית כדי למנוע גלישה של קוקטייל השחרור.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.8-2.14 עבור חצי הכדור השני בקואורדינטות AP = 0.3 מ"מ, L = -1.2 מ"מ (כדי לכוון לאזור הכלכלי הכלכלי), או AP = 1.5 מ"מ, L = -2.0 מ"מ (כדי לכוון ל-CC).</li>
	<li>תפרו את החתך בניילון 5-0 (קוטר 0.1 מ"מ) ונקו את האזור שנתפר בחומר חיטוי.</li>
	<li>הסירו את המסכה המספקת את חומר ההרדמה והעבירו את בעל החיים לאזור הניטור שלאחר הניתוח. הערה: התאוששות מהרדמה ושמירה על שכיבה צריכה להתרחש תוך 5-10 דקות, והתאוששות מלאה (התנהגות רגילה) תוך 25 דקות.<ol><li>עקוב מקרוב אחר ההתאוששות (תנועה חיה וללא הפרעה, גישה תכופה למים) בחלל מחומם היטב (24-25 מעלות צלזיוס), שקט ללא מצעים חלקיקים קטנים, שיכולים לחסום את דרכי הנשימה. להחזיר את החיה לחברה של חבריה לכלוב (לא לבעלי חיים חדשים) רק לאחר אישור התאוששות מלאה.</li>
		<li>יש לעקוב אחר בעל החיים במתקן התחזוקה במשך 48 שעות לפחות לאחר הניתוח. לטפל בסימני כאב (הסתרת ראש, תנוחת ראש או גוף לא תקינה, רגישות יתר ורגישות יתר לטיפול) על ידי מתן שיכוך כאבים (למשל, 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine, תת עורית). יש להפנות בעלי חיים עם פרווה דהויה או זקופה לווטרינר האחראי.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ביופסיה נוזלית של נוזל מוחי שדרתי (CSF)
הערה: ניתן לבצע את התהליך כולו תוך 10 דקות. הביופסיה הנוזלית המתוארת כאן מבוצעת 3 ימים לאחר הזרקת קוקטייל השחרור אך ניתן לבצעה בדיוק באותו אופן בעת הצורך. יש להקפיד לבצע את הניתוח בתנאים אספטיים. נקו את כל המשטחים עם חומר חיטוי (למשל, 3% או 6% מי חמצן). השתמשו בכלים, כפפות, חלוקים ווילונות אוטומטיים או סטריליים בקלות.
<ol><li>מרדימים את בעל החיים בשאיפת איזופלורן (2.5% לזירוז ו-2% לתחזוקה). לאשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת הקרנית רפלקס, התגובה לגירויים (בדיקת צביטת גפה אחורית וזנב), ואופן הנשימה. הערה: ניתן לבצע את ההליכים הכירורגיים בהרדמה כללית המושרה על ידי הרדמה תוך צפקית (למשל, קטמין [40 מ"ג/ק"ג] וקסילזין [10 מ"ג/ק"ג]). עם זאת, זה לא מומלץ כמו ההליך הוא קצר, במיוחד אם ביופסיות יבוצעו מספר פעמים בימים רצופים.</li>
	<li>מתן שיכוך כאבים תת עורי (למשל, 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine) עם השראת הרדמה.</li>
	<li>הרכיבו את חיית הניסוי על המסגרת הסטריאוטקסית. השתמשו במוטות אוזניים כדי לקבע את הראש מבלי להפריע לתנועה הסיבובית לכיוון החלק הקדמי והאחורי.</li>
	<li>ייצבו את הראש בזווית של 40 מעלות כלפי מטה, כך שניתן יהיה להשיג הארכה טובה של העורף. הערה: אחת הדרכים לעשות זאת היא באמצעות סרגל הפה של המכשיר6.</li>
	<li>לגלח את הפרווה באזור הצוואר באמצעות סכין גילוח ולנקות את העור עם חיטוי, כגון 10% פובידון-יוד פתרון ולאחר מכן אלכוהול. החל את החיטוי שלוש פעמים באמצעות צמר גפן סטרילי. שפשפו בתנועה מעגלית במשך 3-5 שניות בכל פעם.</li>
	<li>בעזרת קצה האצבע, מצאו את האזור הדיכאוני בצורת מעוין הממוקם בין הבליטה העורפית לעמוד השדרה של האטלס6.</li>
	<li>ציירו סימן נקודה (למשל, באמצעות סמן).</li>
	<li>תקן מזרק 1 מ"ל או 0.5 מ"ל על המסגרת הסטריאוטקסית. הערה: מומלץ להשתמש מזרקים עם מחטים שאינן ניתנות להסרה מכיוון שהם מייצרים יניקה טובה יותר ויש להם פחות נפח מת.</li>
	<li>הביאו את המחט בנקודת המגע עם העור בנקודת הנקודה.</li>
	<li>בעזרת זוג מלקחיים, הרימו את העור תוך הורדת המזרק דרך שכבות העור.</li>
	<li>אחזר את הבוכנה מעט כדי ליצור לחץ שלילי במזרק.</li>
	<li>הפעל מחדש כדי לטבול את המחט לאט מאוד עד שנוזל (CSF) מופיע במזרק.</li>
	<li>ליישב את המחט במיקום זה ולאפשר זרימה איטית של CSF. הערה: ניתן להוריד או להגביה מעט את המחט אם זרימת CSF איטית מאוד.</li>
	<li>התחל להסיר את CSF באיטיות (בצעדים של 40 μL / min) עד 120 μL.</li>
	<li>שלפו לאט את המזרק.</li>
	<li>מתן תוך-צפקי של 1 מ"ל של סרום רגיל לתמיכה בחידוש הנוזלים של חיית הניסוי.</li>
	<li>מערבבים את הביופסיה הנוזלית (CSF) עם 400 μL של מדיום NSC ושומרים על צינור המיקרוצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף. הערה: יש לעבד ביופסיות נוזליות תוך 3 שעות אם לא להקפיא.</li>
	<li>הסירו את המסכה המספקת את חומר ההרדמה והעבירו את בעל החיים לאזור הניטור שלאחר הניתוח. הערה: התאוששות מהרדמה ושמירה על שכיבה צריכה להתרחש תוך 5-10 דקות, והתאוששות מלאה (התנהגות רגילה) תוך 25 דקות.<ol><li>עקוב מקרוב אחר ההתאוששות (תנועה חיה וללא הפרעה, גישה תכופה למים) בחלל מחומם היטב (24-25 מעלות צלזיוס), שקט ללא מצעים חלקיקים קטנים, שיכולים לחסום את דרכי הנשימה. החזירו את בעל החיים לחברתם של חבריו לכלוב (לא לבעלי חיים חדשים) רק לאחר אישור החלמה מלאה.</li>
		<li>יש לעקוב אחר בעל החיים במתקן התחזוקה במשך 48 שעות לפחות לאחר הניתוח. אם נצפים סימני כאב (הסתרת ראש, תנוחת ראש או גוף לא תקינה, רגישות יתר ורגישות יתר לטיפול), יש לבצע שיכוך כאבים (למשל, 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין תת עורית). יש להפנות בעלי חיים עם פרווה דהויה או זקופה לווטרינר האחראי.</li>
	</ol></li>
</ol>4. עיבוד רקמה עבור immunofluorescence
<ol><li>להרדים את החיה על ידי עירוי תוך לבבי של 20 מ"ל של מלוחים קרים כקרח, ואחריו 50 מ"ל של 4% paraformaldehyde קר כקרח (PFA; במי מלח חוצצים פוספט [PBS] של pH = 7.4).</li>
	<li>לנתח את רקמת המוח.<ol><li>להפריד את הראש מהגוף באמצעות מספריים כדי לבצע חתך באזור צוואר הרחם. השתמש במספריים כדי להסיר את העור ולאחר מכן לחתוך את עצם הגולגולת לאורך קו האמצע של קשת, כאשר קצות המספריים מצביעים כלפי מעלה כדי לא לפגוע ברקמת המוח. המטרה היא להמשיך לחתוך ככל האפשר, לעבור את קו האמצע העטרה.</li>
		<li>השתמש מלקחיים כדי להסיר את העצמות, החל מן העצמות supraoccipital ואת הקודקוד ולבסוף את העצמות הקדמיות.</li>
		<li>ברגע שרקמת המוח נחשפת, השתמשו במלקחיים או במרית כדי להרים אותה מהגולגולת. כדי להקל על כך, לחתוך את העצבים בבסיס המוח ואת נורות הריח, אם לא רצוי.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר לתקן את הרקמה לילה ב 2% PFA ב 4 ° C.</li>
	<li>Cryo-להגן על הרקמה ב 30% סוכרוז (ב PBS) לפחות 48 שעות ב 4 ° C עד הרקמה שוקעת לתחתית.</li>
	<li>להקפיא את הרקמה ב -80 ° C.</li>
	<li>חתכו את רקמת המוח לחלקים קורונליים בעובי 14 מיקרומטר בעזרת קריוסטט.</li>
	<li>ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 3,7<ol><li>יש לדגור על המקטעים עם חיץ חוסם (אלבומין בסרום בקר 3% [BSA], 0.1% Triton X-100, ב-PBS) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בצע שליפת אנטיגן (רותח במשך 15 דקות במאגר ציטראט 10 mM, pH = 6.0, באמצעות צנצנות זכוכית). הערה: שלב זה הוא אופציונלי, אך הכרחי עבור אנטיגנים גרעיניים.</li>
		<li>יש להגיע לטמפרטורת החדר ולדגור עם נוגדנים ראשוניים נגד חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), דו-קורטין (Dcx), S100β ו-β-catenin (ראו טבלת חומרים) בחסימת חיץ למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.</li>
		<li>דגירה במשך שעתיים עם נוגדנים משניים ב- PBS עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) עבור צביעה נגדית גרעינית בטמפרטורת החדר (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>הרכיבו את הכיסויים.</li>
	</ol></li>
</ol>5. עיבוד תאים מבודדים עבור immunofluorescence
<ol><li>לוחים את התאים ללוחות 96 בארות תואמות מיקרוסקופיה, מצופות בפולי-D-ליזין (100 מיקרוגרם/מ"ל).</li>
	<li>תקן את התאים ב-2% PFA קר כקרח למשך 10 דקות ושטוף 3x עם PBS.</li>
	<li>בצע immunofluorescence באמצעות הליכים סטנדרטיים3,7 עבור PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 ו- ID3 (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>שמור את התאים PBS + NaN3 (0.1%) ב 4 ° C בחושך.</li>
</ol>6. מיקרוסקופיה וניתוח תמונה
<ol><li>צלם תמונות באמצעות אפיפלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי ובצע ספירת תאים באמצעות כלי תוכנה סטנדרטיים לניתוח תמונה, כגון מוני תאים.</li>
</ol>

חולדה "חליבה מוחית" לבידוד תאי גזע עצבי ואוליגודנדרוציטים

<ol><li>Visvader, J. E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+designs+of+stem+cell+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific designs of stem cell hierarchies.</a> Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).</li>
<li>Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+quiescent+and+active+neural+stem+cells+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain.</a> The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).</li>
<li>Kazanis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subependymal+zone-derived+oligodendroblasts+respond+to+focal+demyelination+but+fail+to+generate+myelin+in+young+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).</li>
<li>Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+CNS+myelin-from+mechanisms+to+experimental+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6">https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6</a> (2013).</li>
<li>Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).</li>
<li>McClenahan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+and+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+brain+of+live+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats.</a> Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+germinal+layer+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+converts+transit-amplifying+neurogenic+precursors+in+the+adult+brain+into+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells.</a> Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).</li>
<li>Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+proliferation+on+the+surface+of+the+adult+rat+striatal+wall+after+focal+ependymal+loss+by+intracerebroventricular+injection+of+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).</li>
<li>Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone-mediated+ependyma+repair+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).</li>
<li>Kazanis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescence+and+activation+of+stem+and+precursor+cell+populations+in+the+subependymal+zone+of+the+mammalian+brain+are+associated+with+distinct+cellular+and+extracellular+matrix+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li>
<li>Calzolari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+clonal+expansion+and+limited+neural+stem+cell+self-renewal+in+the+adult+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone.</a> Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).</li>
<li>Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractone-heparan+sulphates+mediate+FGF-2+stimulation+of+cell+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone.</a> Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Obernier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+is+sustained+by+symmetric+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).</li>
<li>Delgado, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+stem+cells+from+quiescence+reveals+gliogenic+domains+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain.</a> Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).</li>
<li>Kalamakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescence+modulates+stem+cell+maintenance+and+regenerative+capacity+in+the+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain.</a> Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).</li>
<li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+a+population+of+dormant+neural+stem+cells+that+become+activated+upon+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li>
<li>Gajera, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP2+in+ependymal+cells+regulates+BMP+signaling+in+the+adult+neurogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche.</a> Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים להצהיר.

תאי גזע ותאי אב דלילים יחסית ברקמת המוח של יונקים. בנוסף, NSCs ממוקמים באזורים שאינם נגישים לביופסיות קלות ובטוחות (קירות חדר, היפוקמפוס). לכן, הדרך היחידה לעבוד באופן ניסיוני עם תאים כאלה, עד כה, הייתה הבידוד שלהם לאחר המוות. שיטה המאפשרת איסוף יחיד או חוזר של NSCs ו-OPC מחולדות חיות, הנקראת חליבה, מתוארת כאן צעד אחר צעד. השיטה מבוססת על שתי תכונות עיקריות: i) NSCs או OPCs מופרדים על ידי monolayer התא ependymal מן CSF, זורם בתוך מערכת החדרים של המוח; ii) תאים אפנדימליים ואבות עצביים שומרים על קשר בינם לבין סוגי תאים שכנים אחרים באמצעות אינטגרינים. לכן, קוקטייל השחרור המוזרק באזורים ספציפיים של החדרים כדי לאפשר התנתקות של NSCs, או OPCs, מפרנכימה במוח מכיל neuraminidase, רעלן המכוון באופן ספציפי והורג תאים אפנדימליים10,11, ונוגדן חוסם integrin-β1. הוא מכיל גם FGF2, שכן גורם גדילה זה חיוני להישרדות ותחזוקה של NSCs בנישה ובתרבות15,16. הוכח בעבר7 כי פרוטוקול זה נסבל היטב על ידי בעלי החיים; בדו"ח זה, אושר עוד כי הנזק לתאי אפנדימל, הנגרם על ידי קוקטייל השחרור כתנאי מוקדם לשחרור NSCs/OPCs ב- CSF, מוגבל סביב הרמה הרוסטרוקאודלית של ההזרקה. יש לכך חשיבות מרכזית, שכן הפרוטוקול אמור לשמר את התפקוד ההומיאוסטטי של המוח, כולל נישת תאי הגזע עצמה, ולא אמור לפגוע ברווחתם ארוכת הטווח של בעלי החיים. ההזרקה הסטריאוטקסית של קוקטייל השחרור היא בעלת חומרה קלה ומעולם לא הסתיימה במוות. יתר על כן, ביצוע ביופסיות נוזליות מה- cisterna magna הוא הליך מהיר וזעיר פולשני שניתן לחזור עליו מספר פעמים רצופות.
חשוב לציין כי דגימות המל"ל שבודדו באמצעות חליבה משקפות היטב את המאגר האנדוגני של NSCs. הפרופיל של אבות SEZ יכול להיות מושפע על ידי הזרקת i.c.v. של FGF2. כאשר זה קורה, הפרופיל של תאים נגזרים חליבה מושפע באותו אופן. יתר על כן, עבודות ניסוי קודמות הצביעו על כך שלתאי גזע עצביים שבודדו באמצעות חליבה של SEZ יש פוטנציאל מוגבל להתחדשות עצמית, התנהגות דומה לזו של NSCs אנדוגניים כפי שנחשף באסטרטגיות in vivo, transgenic, cell-fate14,17. תאי גזע עצביים במוח לאחר הלידה נשמרים בשקט, ורק לעתים רחוקות עוברים לכיוון הפעלה מיטוטית ליצירת צאצאים נוירוגניים וגליוגניים18,19,20. כאן, מובאות ראיות לכך שחלק התאים שמקורם בחליבה המבטאים GFAP וצפויים לכלול NSCs בתום לב מבטאים יחד ID3, סמן של NSCs שקטים21. נראה כי הנוכחות המועשרת של NSCs שקטים, אשר לאחר מכן מצופים בתווך NSC המשמש בדרך כלל לתרבית של NSCs מבודדים לאחר המוות, מגבילה את פוטנציאל ההתפשטות של NSCs שנאספו (למשל, תהליך חיוני אם תאים ישמשו להשתלות אוטולוגיות). הסיבה לכך היא שמדיה זו תוכננה במיוחד עבור הישרדות והתרחבות מיטוטית של NSCs פעילים; לפיכך, יצירת פרוטוקולים המאפשרים הפעלה מיטוטית יעילה ומהירה של NSCs שקטים תגדיל את ערך והיקף השימוש בחליבה.
בסך הכל, נתונים אלה מצביעים על כך שחליבה מאפשרת דגימה של תאי גזע עצביים במוח לאחר הלידה ושל OPC (בהתאם לרמה הרוסטרוקאודלית של הזרקת קוקטייל השחרור) מחולדות חיות. עבודה זו מצביעה על ההיתכנות של ביצוע ביופסיות נוזליות עוקבות באותה חיה, גם באורכי זמן משמעותיים לאחר הזרקת קוקטייל השחרור (ובכך לתכנן ולבצע מחקרי אורך ניסיוניים), שכן נוירובלסטים נשארים מקובצים על דפנות החדרים גם לאחר 8 חודשים לאחר ההזרקה. שיטות כאלה הן בעלות חשיבות קריטית מכיוון שהן מאפשרות לחקור אירועים בתוך בעלי חיים בודדים וכתוצאה מכך להפחית רעש ביולוגי שנוצר על ידי שונות פיזיולוגית. זה, בתורו, מוביל דיוק משופר ליישום העקרונות של "3Rs" (החלפה, הפחתה ועידון). צעדי מפתח עתידיים לשיפור השיטה יהיו קביעת המספר המרבי ומסגרת הזמן שניתן יהיה לבצע ביופסיות נוזליות לאחר הליך שחרור אחד, אם כי ביצוע הליכי שחרור נוספים צריך להיות אפשרי, במידת הצורך.

תאי גזע ספציפיים לרקמות הם תאים מחויבים חלקית שיכולים ליצור את כל אוכלוסיות התאים המרכיבות את הרקמות המתאימות. מלבד היותם מולטיפוטנטיים, הם תאים המתחדשים מעצמם וחיוניים לשמירה על ההומאוסטזיס ויכולת ההתחדשות של רקמות1. חלק מתאי הגזע הספציפיים לרקמות נשארים במצב פעיל ומתרבים מאוד, כגון תאי גזע במעי או בהמטופויטיקה. אחרים, כגון תאי גזע המוח, נשארים שקטים או רדומיםבמידה רבה 2. במוח הבוגר, תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים להימצא באזורים מיוחדים, הנקראים לעתים קרובות נישות. שני אזורים כאלה המתוארים היטב קיימים באזור התת-אפנדימלי (SEZ) של החדרים הרוחביים ובפיתול המשונן של ההיפוקמפוס. נישת SEZ מייצרת את המספר הגבוה ביותר של תאים, בעיקר נוירובלסטים הנודדים לעבר פקעות הריח ותורמים לאוכלוסיית הנוירונים המקומית; לעומת זאת, אוליגודנדרובלסטים שנוצרו נודדים לכפיס המוח הסמוך (CC)3. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) הם תאים פעילים מיטוטית, המפוזרים באופן נרחב ברחבי מערכת העצבים המרכזית, אשר: i) מחויבים לשושלת אוליגודנדרוגליאלית, ii) יכולים לנדוד לאתרים של demyelination, ו iii) יכולים להתמיין לאוליגודנדרוציטים myelinating. OPCs גם להציג פוטנציאל התחדשות עצמית שקט4.
עד כה, הבידוד והמחקר של NSCs ו- OPCs דרשו דיסוציאציה לאחר המוות של רקמת המוח וחוט השדרה המנותחת. כדי לעקוף את המגבלה הניסויית הזו, הקמנו שיטה שמאפשרת, לראשונה, בידוד של תאי גזע עצביים במוח ו-OPC מבעלי חיים חיים. אנו קוראים לשיטה זו "חליבה", מכיוון שהיא מאפשרת אוספים מרובים של תאים מכיוון שהמאגרים שלהם אינם מתרוקנים. הפרוטוקול פותח בחולדות, בשל גודל המוח הגדול שלהן, המכוון בעיקר ל-SEZ, או CC, וכולל שני שלבים עיקריים. ראשית, NSCs או OPCs "מוסרים" מהרקמה באמצעות הזרקת i.c.v של "קוקטייל שחרור" המכיל neuraminidase, רעלן המשרה denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט 2 (FGF2). הקוקטייל מוזרק באופן סטריאוטקסי דו צדדי בתוך החדרים הצדיים. אם השימוש המיועד הוא בידוד של NSCs, אזורים rostral של החדרים לרוחב ממוקדים. אם המטרה היא לבודד OPC בצורה טהורה יותר, הקוקטייל מוזרק באופן קאודלי באזור הפימבריה של ההיפוקמפוס. בשלב "איסוף" שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי (CSF) מבוצעות מן cisterna magna של חולדות מורדמות, ללא צורך בחתך. הביופסיה הנוזלית מעורבבת עם מדיום תרבית NSC וניתן לשמור אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לצפייה.

<table><tbody><tr><td><קוקטייל >שחרור חזק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&בטא; נוגדן חוסם 1-אינטגרין</td><td>BD Biosciences</td><td>#555002</td><td>אוגר מטוהר NA/LE נגד חולדות CD29 שיבוט Ha2/5, 1 מ"ג/מ"ל. כל abntibody עם פעילות חוסמת צריך להיות מתאים.</td></tr><tr><td>Neuraminidase מ-Clostridium perfringens (Clostridium welchii)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#N2876</td><td>Neuraminidases ממקורות אחרים (למשל, מ-Vibrio cholerae) לא נבדקו.</td></tr><tr><td>FGF אנושי רקומביננטי בסיסי (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>#100-18B</td><td>נשמר כ-1 &mu; g/&mu; ציר L, מדולל במים סטריליים ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td><חזק>פרוצדורות כירורגיות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L מזרק</td><td>המילטון</td><td>#80330</td><td>דגם 701 RN, מחט נשלפת קטנה, מד 26 שניות, 2 אינץ', סגנון נקודתי 2</td></tr><tr><td>BD מיקרו-עדין 1 מ"ל מזרקי אינסולין</td><td>BD biosciences</td><td>04085-00</td><td>29 גרם x 12.7 מ"מ</td></tr><tr><td>חיתוך בטדין. SOL 10% FLx30ML</td><td>LAVIPHARM-CASTALIA</td><td>מק"ט:</td><td></td></tr> 5201048131168 <tr><td>Bupaq</td><td>RICHTERPHARMA</td><td>1021854AF</td><td>10 מ"ל (בופרנופין 0.3 מ"ג/מ"ל)</td></tr> <tr><td>דיגיטלי חדש סטנדרטי סטריאוטקסי, עכברוש ועכבר</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ניטור הומותרמית</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>ISOFLURIN 1,000 מ"ג/גרם אדי אינהלציה, נוזל</td><td>Vetpharma בריאות בעלי חיים</td><td>32509/4031</td><td></td></tr><tr><td>Ketamidor</td><td>RICHTER PHARMA</td><td>מק"ט:</td> 9004114002531 <td>קטמין 100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>תפר ניילון, Ethilon</td><td>Ethicon</td><td>D9635</td><td>שקוף, גודל 5-0</td></tr><tr><td>גוזמים כירורגיים אלחוטיים נטענים</td><td>Stoelting</td><td>פריט: 51472</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל, סטרילי</td><td>Swann Morton</td><td>AW050</td><td></td></tr><tr><td>Scopettes Jr.&nbsp; 8 אינץ 'Swabs</td><td>Birchwood Laboratories</td><td>34-7021-12P</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוהה</td><td>Foredom</td><td>1474w/o1464</td><td></td></tr><tr><td>Stoelting' s ערכת מכשירים סטריאוטקסיים</td><td>Stoelting</td><td>פריט: 52189</td><td></td></tr><tr><td>Xylan 2%</td> <td>Chanelle Pharmaceuticals</td><td>13764/03/19-5-2004</td><td>Xylazine, 25 מ"ל</td></tr><tr><td><חזק>טיפול ברקמות ותאים וצביעה חיסונית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 בארות מתאימות למיקרוסקופיה</td><td>גריינר</td> <td>#655866</td> תוסף <td></td></tr><tr><td></td><td>מיקרופלייט כוכב מסך B27ThermoFisher Scientific</td><td>A1486701</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Merck</td><td>P06-1391100</td><td>Fraction V, הלם חום</td></tr><tr><td>ציטראט</td><td>Merck</td><td>71497</td><td>נתרן ציטראט מונו-בסיסי</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1510S-DAPI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck, Calbiochem</td><td>28718-90-3</td><td>צביעה גרעינית, דילול: 1/1,000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher מדעי</td><td>11995065</td><td>גלוקוז גבוה, פירובט</td></tr><tr><td>חמור נגד עזים</td><td>ביוטיום</td><td>20016 או 20106 או 20048</td><td>דילול: 1/1,000</td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר</td><td>ביוטיום</td><td>20014 או 20105 או 20046</td><td>דילול: 1/1,000</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב</td><td>ביוטיום</td><td>20015 או 20098 או 20047</td><td>דילול: 1/1,000</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2 (או bFGF)</td> <td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי-GFAP</td><td>Abcam</td><td>ab53554</td><td>דילול: 1/500</td></tr><tr><td>עז אנטי-SOX2</td><td>סנטה קרוז ביוטכניולוגיה</td><td>sc-17320</td><td>דילול: 1/200</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-ID3</td><td>סנטה קרוז ביוטכניולוגיה</td><td>sc-56712</td><td>דילול: 1/200</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-S100&beta;</td><td>דילול Sigma</td><td>S2532</td><td>: 1/200</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Merck, Calbiochem</td><td>475904</td> תוסף <td>N2 בינוני הרכבה</td></tr><tr><td>ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmadehyde</td><td>Merck</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Merck, תמיסת Millipore</td><td>A-003-E</td><td>, 1.0 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-דאבל קורטין (DCX)</td> <td>Abcam</td><td>ab18723</td><td>דילול: 1/500</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-PDGFR&אלפא;</td><td>Abcam</td><td>ab51875</td><td>דילול: 1/200</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-&בטא;- catenin</td><td>Abcam</td><td>ab16051</td><td>דילול: 1/500</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה וניתוח תמונה </חזק></td>מיקרוסקופ קונפוקלי Leica SP6 ו-SP8 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניתוח תמונה</td><td>NIH, ארה"ב</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח תמונה</td><td>Leica</td><td>LasX</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

תאי גזע עצביים ספציפיים לרקמות (NSCs) נשארים פעילים במוח של יונקים לאחר הלידה. הם מתגוררים בנישות מיוחדות, שם הם מייצרים נוירונים חדשים וגלריה. נישה אחת כזו היא האזור התת-אפנדימלי (SEZ; נקרא גם האזור החדרי-תת-חדרי), הממוקם מעבר לדפנות הצידיות של החדרים הרוחביים, בסמוך לשכבת התא האפנדימלי. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) מופצים בשפע ברחבי מערכת העצבים המרכזית, ומהווים מאגר של תאי אב מתרבים שיכולים לייצר אוליגודנדרוציטים.
הן NSCs והן OPCs מציגים פוטנציאל התחדשות עצמית ומחזורי שקט/הפעלה. בשל מיקומם, הבידוד והחקירה הניסויית של תאים אלה מבוצעת לאחר המוות. כאן, אנו מתארים בפירוט "חליבת מוח", שיטה לבידוד של תאי גזע גזעיים ו- OPC, בין תאים אחרים, מבעלי חיים חיים. זהו פרוטוקול דו-שלבי המיועד לשימוש במכרסמים ונבדק בחולדות. ראשית, תאים "משתחררים" מהרקמה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית תוך-מוחית (i.c.v.) של "קוקטייל שחרור". המרכיבים העיקריים הם neuraminidase, אשר מכוון תאים אפנדימליים וגורם denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט-2. בשלב "איסוף" שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי מבוצעות מגנה cisterna, בחולדות מורדמות ללא צורך בחתך.
התוצאות המוצגות כאן מראות כי תאים מבודדים שומרים על הפרופיל האנדוגני שלהם וכי NSCs של SEZ שומרים על שלוותם. הדנודציה של שכבת האפנדימל מוגבלת לרמה האנטומית של ההזרקה והפרוטוקול (שחרור ואיסוף) נסבל היטב על ידי בעלי החיים. גישה חדשנית זו סוללת את הדרך לביצוע מחקרי אורך של נוירוגנזה אנדוגנית וגליוגנזה בחיות ניסוי.

שחרור ואיסוף של NSCs NSCs של SEZ מופרדים מן CSF רק על ידי monolayer של תאים ependymal, אם כי הם נשארים בקשר ישיר עם התוכן החדר באמצעות intercalating mono-ciliated תהליכים 8,9. Neuraminidase פועל באופן ספציפי על תאים ependymal באמצעות מחשוף של שאריות חומצה sialic והוא יכול לגרום denudation של דופן החדר. זה מוביל אשכולות neuroblast על פני החדר10,11. יתר על כן, זרימה של נוירובלסטים נצפתה ב- CSF לאחר הזרקת i.c.v של נוגדן חוסם אינטגרין β1, כנראה עקב התרופפות של צמתי התאים הבין-אפנדימליים12. תצפיות אלו הובילו לפיתוח פרוטוקול המאפשר בידוד תאי גזע ותאי אב במוח באמצעות פגיעה מבוקרת בשלמות דפנות החדר הצידי. בשלב ראשון, השחרור מהפרנכימה והזרימה שלאחר מכן של NSCs או OPCs בתוך CSF מושרים באמצעות הזרקת i.c.v של קוקטייל השחרור. הקוקטייל מוזרק באופן סטריאוטקסי בקצב של 1 μL/min, דו-צדדי (2 μL לכל הזרקה) בחדרים הצדיים (קואורדינטות המכוונות ל-SEZ NSCs: AP = 0.3 מ"מ, L = ± 1.2 מ"מ, D = 3.5 מ"מ; קואורדינטות המכוונות ל-CC OPCs: AP = 1.5 מ"מ, L = ± 2 מ"מ, D = 3.5 מ"מ). השלב השני ("איסוף") כרוך בביצוע ביופסיות נוזליות CSF ממגנה cisterna. החולדות צריכות להיות מורדמות ואת הביופסיה ניתן לעשות עם מזרקים 1 מ"ל. השימוש במכשיר הסטריאוטקסי מאפשר הצלחה כמעט מוחלטת בשליפת כ-100 מיקרוליטר CSF, ללא צורך בחתכים. הביופסיה הנוזלית מתווספת למדיום תרבית קרה ונשמרת בטמפרטורה של 4°C עד לציפוי במשך &lt;3 שעות (מדיום תרבית NSC מכיל את מדיום הנשר המעובד של דולבקו [DMEM], תוסף B27 [2%], תוסף N2 [1%], FGF2 [20 ננוגרם/מ"ל], וגורם גדילה אפידרמלי [EGF; 20 ננוגרם/מ"ל]).
הערכה היסטולוגית של האזור הפריוונטריקולרי לאחר הזרקת קוקטייל השחרור קבוצת ניסויים ראשונה גילתה שכאשר מזריקים יותר מ-3 מיקרוליטר נוזל, החדרים עלולים להינזק כתוצאה מפגיעה מכנית לא ספציפית (איור 2B,C). הזרקה איטית של 2 μL של קוקטייל שחרור הובילה להופעתם של אשכולות של נוירובלסטים אימונופוזיטיבים Dcx על פני החדר. הצבירים האלה נשארו גלויים אפילו 8 חודשים לאחר ההזרקה (איור 2D). מכיוון שהשיטה נועדה למחקרי אורך, שמטרתם מעקב ארוך טווח אחר בעלי החיים, הוערך הנזק לרקמות שנגרם על ידי קוקטייל השחרור. Immunostaining בוצע על קטעי מוח cryostat בעובי 14 מיקרומטר עבור סמנים תאים אפנדימליים, כגון S100β ו- β-catenin13, והשלמות הכוללת של שכבת אפנדימל הוערכה. אתרים של דנודציה של השכבה האפנדימלית היו קיימים רק קרוב לרמה הרוסטרוקאודלית של הזריקות, עם ירידה הדרגתית בהפרעות בשכבת אפנדימל שהתגלו באזורים אחוריים וקדמיים יותר של SEZ (איור 2E,F) ונעדרו לאחר מרחק של ±2 מ"מ ממקום ההזרקה. התוצאות הנ"ל מראות כי הדנודציה החלקית של שכבת האפנדימל הנגרמת על ידי הזרקת i.c.v של קוקטייל השחרור היא מוקדית, מרוסנת בקרבת אתר ההזרקה, ומשאירה את שאר שכבת האפנדימל הפריוונטריקולרית ללא פגע.
פרופיל סמן והתנהגות חוץ גופית של תאים שנאספו לאחר מכן הוערכו התנהגות החוץ גופית ופרופיל הסמן של התאים שבודדו באמצעות פרוטוקול החליבה. תפוקת התאים הממוצעת של כל ביופסיה נוזלית היא כ-300 ±-45 תאים (לכל ביופסיה של 100 מיקרוליטר)7. ביופסיות חליבה הניבו תרביות NSC עם פוטנציאל מעבר ממוצע של 3.17 ± 0.45. תאים שבודדו מחולדות שהוזרקו במי מלח יכלו לעבור בממוצע 1.92 ± 0.76 פעמים; לעומת זאת, אלה שבודדו באמצעות חליבה הגיעו אפילו לתשעה מעברים (P = 0.038, מבחן T) (איור 3A)7. יכולת המעבר הממוצעת של תרביות נוירוספריות סטנדרטיות לאחר המוות, שמקורן ב-SEZ, גבוהה מ-12 מעברים בידינו. מכיוון שפוטנציאל ההתפשטות in vivo של NSCs SEZ, כפי שנחשף בניסויי מיפוי גורל תאי in vivo 14, הוכח כמוגבל, חליבה מייצרת תאים עם התנהגות שונה באופן משמעותי במבחנה מזו של תאים בתרביות סטנדרטיות, אם כי הרבה יותר קרובה להתנהגות של NSCs אנדוגניים. התאים שנאספו צופו על בארות מצופות פולי-D-ליזין, שם הם גדלו גם כחד-שכבות דבקות וגם לעתים רחוקות יותר כנוירוספרות (איור 3B). תאים מבודדים טריים (שנאספו 3 ימים לאחר ההזרקה ותוקנו 24 שעות לאחר הציפוי) שהיו חיוביים לסמן האסטרוגליאלי GFAP היו גם הם חיוביים ל-ID3, סמן של שקט, והיו בעלי מאפיין למורפולוגיה דו-קוטבית של NSC (איור 3C). יתר על כן, כפי שדווח קודם לכן7, השוואה אימונוציטוכימית מפורטת יותר של תאים שמקורם בביופסיה ושל תאים שמקורם לאחר המוות מאותן חיות, 3 ימים לאחר ההזרקה (חיפוש אחר אסטרוציטים GFAP+, נוירובלסטים Dcx+, אבות אוליגודנדרוציטים PDGFRa+ ותאי SOX2+ של השושלת העצבית) הראתה שהפרופיל של תאים שנאספו היה דומה לזה של תאי SEZ אנדוגניים (איור 3D). יש לציין כי כאשר הושוו תאים שמקורם בביופסיה וברקמות בתנאים שונים (למשל, הזרקת קוקטייל שחרור עם ובלי FGF2), נמצא כי גורם הגדילה הביא לעלייה מקבילה ומשמעותית בנוכחות תאי SOX2+, כמו גם לירידה משמעותית בנוכחות נוירובלסטים Dcx+ בשתי הדגימות (איור 3D). נתונים אלה אישרו כי כל שינוי המופיע בפרופיל של אוכלוסיות אנדוגניות של NSCs משתקף בדגימות תאים שנוצרו על ידי חליבה.
<img alt="תרשים של הידבקות נוירונים וחסימת נוגדנים β1-אינטגרין במערך ניסוי ביופסיה נוזלית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: סיכום גרפי של החליבה. חתך קורונלי של חצי כדור מוח אחד עם ציוני הדרך האנטומיים העיקריים (החדר הצידי, כפיס המוח שמעליו, והקומיסורה הקדמית למטה [חומר לבן באפור], והאזור התת-אפנדימלי בדפנות הצידיות [בכחול]). קוקטייל השחרור מוזרק לחדר הצידי, מה שמוביל לפגיעה בשלמות הרקמה ולשחרור תאי גזע עצביים במוח לאחר הלידה בנוזל השדרה, ממנו ניתן לאסוף אותם באמצעות ביופסיות נוזליות. קיצורים: SEZ = אזור subependymal; LV = חדר לרוחב; CSF = נוזל מוחי שדרתי; pbNSCs = תאי גזע עצביים במוח לאחר הלידה; β1-int = אינטגרין בטא1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של התחדשות רקמות עצביות עם ניתוח סמני DCX, Sox2 ו-β-catenin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: הערכה היסטולוגית של ההשפעות של זריקות i.c.v. (A-D) תמונות בהגדלה נמוכה של המחצית הגבית של החדר הצידי לאחר צביעה חיסונית עבור Dcx (באדום, כדי לסמן נוירובלסטים). (A) החדרת i.c.v פשוטה של מזרק המילטון אינה מפריעה לארכיטקטורה הציטו-ארכיטקטואלית של ה-SEZ, בעוד שהזרקת i.c.v של 10 מ"ל (קצב עירוי של 1 מ"ל/דקה) מובילה לנזק חמור של דופן החדר ללא קשר לתכולתו. (B) מלוחים ו-(C) קוקטייל שחרור. (D) הזרקה של 2 μL של קוקטייל השחרור מובילה לפשרה מבוקרת של דופן החדר, שנצפתה גם לאחר 8 חודשים לאחר הניתוח. פרטים בהגדלה גבוהה יותר של דופן ה-SEZ לאחר 7 ו-14 ימים לאחר ההזרקה מוצגים ב-(E) וב-(F), בהתאמה. ישנו מבנה לא מאורגן, כאשר נוירובלסטים Dcx+ (בירוק) נחים על פני השטח של הקיר והתאים האחרים של הגומחה (Sox2+, בלבן) נחים עמוק יותר. הרקמה הפריוונטריקולרית נפגעת ברמה הרוסטרוקאודלית של הזריקה בנקודת הזמן של חודשיים (ב-G), בעוד הרקמה שלמה ברמה קאודלית יותר (ב-H) באותה חיה. דופן החדר מוערכת על ידי immunostaining עבור סמנים אפנדימליים S100β ו β-catenin. פירוט הארכיטקטורה הטיפוסית של הקיר מוצג ב-(I). צביעה גרעינית מבוצעת באמצעות DAPI (מוצג בכחול). פסי קנה מידה = 300 מיקרומטר (A-C,G,H, כניסה), 150 מיקרומטר (D), 30 מיקרומטר (E,F) ו-50 מיקרומטר (I). נתון זה שונה מ McClenahan et al.13. קיצורים: SEZ = אזור subependymal; i.c.v = intracerebroventricular; Dcx = doublecortin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="ניתוח התמיינות תאים; גרף עמודות, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תמונות היסטולוגיות, נתונים סטטיסטיים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: הערכת התאים שבודדו באמצעות חליבה. (A) גרף המציג את מספר המעברים המרבי המתקבל לכל דגימת ביופסיה נוזלית מבעלי חיים המוזרקים במי מלח (פסים אפורים, סה"כ 12 דגימות), או לאחר חליבה (פסים שחורים, סה"כ 29 דגימות, קוקטייל שחרור עם נוירמינידז ונוגדן חוסם אינטגרין β1). (B) תמונה במיקרוסקופ קונפוקלי מייצג של תאים ראשוניים המתקבלת באמצעות חליבה, לאחר 3 ימים לאחר ההזרקה, מוכתמים חיסון כנגד GFAP ו-ID3. (ג,ד) תמונות ברייטפילד של תאים שבודדו 3 ימים לאחר ההזרקה, מצופות על בארות מצופות פולי-D-ליזין והורשו לגדול בתווך התפשטות NSC במשך 7 ימים. (E) גרף המציג את פרופיל סוג התא של תאים שבודדו באמצעות חליבה של SEZ ושל האוכלוסייה האנדוגנית של NSCs SEZ מאותן חיות ניסוי. שברי SOX2+ ו-Dcx+ גדלו וירדו באופן משמעותי, בהתאמה, לאחר הזרקה משותפת של FGF2. (ניתוח ANOVA חד-כיווני לסמן, ואחריו ניתוח פוסט-הוק; n = 4-6 בעלי חיים לכל קבוצת ניסוי.) פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (C,D) ו- 10 מיקרומטר (B). נתון זה שונה מ McClenahan et al.13. קיצורים: SEZ = אזור subependymal; DPI = ימים לאחר ההזרקה; NSC = תאי גזע עצביים; Dcx = doublecortin; GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...

אנו עובדים עם תאי גזע עצביים במוח, תאים דלילים מאוד שמתקבצים בתוך מיקרו-סביבות מיוחדות שנקראות נישות. למרות שהם תורמים לחוש הריח, לזיכרון וללמידה, הם מאוד לא יעילים בהנעת רגנרציה. לכן, אנו חוקרים את המאפיינים שלהם ואת הדרכים לתפעל אותם כדי להגדיל את הריפוי של רקמת העצבים.הראינו כי תרומתם של תאי גזע עצביים במוח להתחדשות מוגבלת על ידי גורמים אנדוגניים ואנדוגניים, כגון פוטנציאל ההתמיינות המוגבל שלהם, והתלות שלהם בגורמים מיקרו-סביבתיים. באותה מידה, זיהינו תכונות מפתח שניתן להשתמש בהן כדי לתכנן אסטרטגיות כדי לווסת את היכולת שלהם. פרוטוקול החליבה מאפשר איסוף תאי אב של גזע עצבי במוח ואוליגודנדרוציטים מחיות ניסוי חיות.לפיכך, הוא מאפשר ניתוח רצוף יותר של המאפיינים שלהם ואת הביצועים של מחקרים אורך. נכון לעכשיו, אין טכניקות חלופיות לבידוד תאי גזע ותאי אב של המוח מחיות ניסוי חיות. סטנדרט ההשוואה הנוכחי הוא בידוד לאחר המוות של תאים כאלה, אשר מציג אי ודאויות ניסוייות שונות והטיה ביולוגית.כעת אנו חוקרים כיצד תאי גזע עצביים במוח מופעלים על-ידי שקט קיים. אנו גם משווים את המאפיינים של אוכלוסיות אבות שונות במוח. לדוגמה, נוירוגניים לעומת אוליגודנדרוגניים, על מנת להגדיר את תכונותיהם הדיפרנציאליות ואת התאמתם למיקרו-סביבה מגוונת.

the-brain-milking-method-for-isolation-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים פרוטוקול מפורט לבידוד דפנות החדר הצידי ממוחו של עכבר בוגר וביצוע דיסוציאציה אנזימטית של רקמות להשגת תאים בודדים. תאים אלה נתונים לאחר מכן לתנאי תרבית ספציפיים המשפרים באופן סלקטיבי את התפשטות תאי גזע עצביים ומקדמים את התמיינותם לתרביות משותפות של אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים.

השגת תרבית אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים מעורבת מתאי גזע עצביים של עכברים בוגרים

סרטון זה מדגים את תהליך בידוד כלי הדם במוח מחולדות שעברו המתת חסד. הוא כולל דיסקציה של המוח, ניקוי הרקמה, ועיכול מכני, ואחריו צנטריפוגה חוזרת ונשנית כדי לבודד את החלק הטהור של microvessels.

שיטה לבידוד יחידות נוירו-וסקולריות ממוח חולדה

סרטון זה מציג שיטה לבידוד תאי גזע/אב עצביים מרקמה פרי-חדרית של חוט השדרה בחולדות בוגרות. הטכניקה כוללת דגירה של מקטעי הרקמה בתמיסה המכילה אנזימים מפרקי חלבון כדי לשבש את המטריצה החוץ תאית ולשחרר את התאים. לאחר מכן, התאים המשוחררים מצופים בתווך המכיל גורמי גדילה ספציפיים המגבירים את התרבות הגזע העצבי / האב ומקדמים צבירה לנוירוספרות תלת ממדיות.

בידוד תאי אב עצביים מאזור חוט השדרה הפריוונטריקולרי של חולדה בוגרת

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי אוליגודנדרוציטים ראשוניים מתרחיף תא עצבי המתקבל מגור עכבר באמצעות הפרדה מגנטית. הטכניקה עושה שימוש בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים ספציפיים לאנטיגנים אוליגודנדרוציטים, המאפשרים בידוד סלקטיבי של תאים אלה.

בידוד אוליגודנדרוציטים ראשוניים באמצעות חרוזים אימונומגנטיים

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

חוט השדרה של יונקים בוגרים מכיל תאי גזע/אב עצביים (NSPCs) שניתן לבודד ולהרחיב בתרבית. פרוטוקול זה מתאר את הקציר, הבידוד, התרבית והמעבר של NSPCs שנוצרו מהאזור הפרי-חדרי של חוט השדרה הבוגר מהחולדה ומתורמי השתלת איברים אנושיים.

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

אוליגודנדרוציטים הם תאי המיאלין של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ותרבית של קודמיהם, תאי אב אוליגודנדרוציטים, מקליפת חולדות, כמו גם שיטה כמותית מהירה ואמינה להערכת אוליגודנדרוגנזה במבחנה בתגובה לגורמים ניסיוניים.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות...

מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

אנו מתארים את הייצור של תרבויות מעורבות של אסטרוציטים ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים הנגזרים מתאי גזע עצביים עובריים או בוגרים המתבדלים לאוליגודנדרוציטים בוגרים, ומודלים במבחנה של גירויים מזיקים. הצימוד עם טכניקת סינון תוכן גבוהה מבוססת תא בונה מערכת סינון סמים אמינה וחזקה.

בידול וניתוח התבגרות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים שמקורם בתאי גזע עצביים

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

למד שיטת חליבת מוח לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות. שיטה זו מאפשרת איסוף תאים חוזר ללא פגיעה ברווחת בעלי החיים ומסייעת בחקר מנגנוני זיכרון ולמידה.

שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

גלה סרטונים נוספים