Name: זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: למדו טכניקת זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים לחקר בקרה נוירו-אנדוקרינית של תפקוד רבייה והשפעת מתח על הורמונים. שיטה זו מאפשרת מסירה ממוקדת לחדר הצדדי ללא ציוד סטריאוטקטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר קלי ברין צ'רץ', למר מייקל קרייסמן ולגב' ג'סיקה ג'אנג על תרומתם לאיסוף הנתונים המוצגים בתוצאות המייצגות. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R00 HD104994 (R.B.M).

כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת מדינת קולורדו (#3960) ואוניברסיטת קליפורניה סן דייגו מוסדיים טיפול ושימוש בבעלי חיים, שם נאספו הנתונים המייצגים (S13235, PI Kellie Breen Church). נתונים מחמש נקבות בוגרות ושני עכברים זכרים בוגרים C57/BL6 (בני 9-16 שבועות) מתוארים בסעיף הנתונים המייצגים. נקבות עכברות עברו כריתת שחלות 3-4 שבועות לפני הזרקת ICV ואיסוף דם כמתואר לעיל7. לפני הניסויים, עכברים אלה שוכנו עם מחזור אור כהה של 12 שעות / 12 שעות והייתה להם גישה חופשית להאכלה ומים בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. ביצוע craniotomy
הערה: קרניוטומיה יכולה להתבצע יום אחד או יותר לפני ההזרקה בפועל, מה שהופך את תהליך ההזרקה למהיר יותר ביום הניסוי.
<ol><li>הכינו את החומרים לקרניוטומיה כמתואר להלן.<ol><li>הניחו משטח ספסל נקי או חומר וילונות על משטח העבודה. הדביקו את חרוט האף של מאדה איזופלורן למשטח העבודה (קרוב לנסיין, אך פונה אליו; ראו איור 1A).</li>
		<li>מניחים צינור סילסטי על קצה מחט סטרילית חדה 18 גרם כך ~ 1 מ"מ של קצה המחט בולט. מניחים צינור סילסטי על קצה מחט קהה סטרילית כך ~ 1 מ"מ של קצה המחט בולט. הערה: יש להשתמש במחטים ארוזות מראש נפרדות וסטריליות (חדות וקהות) עבור כל עכבר.</li>
		<li>אספו מכונת גילוח חשמלית, פילינג יוד, גזה סטרילית ופדים אלכוהוליים להכנת אתר ההזרקה.</li>
	</ol></li>
	<li>תרגול הזזת מחט 2 מ"מ לרוחב ו 1 מ"מ קאודלי כמתואר להלן.<ol><li>השתמשו בסרגל ובעט כדי לסמן דף נייר עם נקודת התחלה (זו תהיה ברגמה), סימן 2 מ"מ משמאל או מימין, וסימן נוסף 1 מ"מ מעל האחרון (זה יהיה אתר ההזרקה; ראו איור 1B).</li>
		<li>תרגלו הזזת המחט מנקודת ההתחלה לנקודה 1 לסימון נקודה 2 (ברגמה לאתר ההזרקה) עד שתהיו בטוחים שניתן לחזור על התנועה ללא קווי עזר. הערה: הקואורדינטות המתוארות כאן יעילות בעכברי C57/BL6 בוגרים, אך זנים אחרים או קבוצות גיל אחרות עשויים לדרוש הסתגלות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן את העכבר עבור craniotomy כמתואר להלן.<ol><li>הכניסו את העכבר לתא אינדוקציה והרדימו את העכבר עם איזופלורן 3%-4% בחמצן ברמה רפואית. עם תרגול והיכרות עם ההליך, להפחית את משך החשיפה הכולל isoflurane פחות מ 10 דקות עבור הליך craniotomy. אזהרה: חשיפה לאיזופלורן מסוכנת לבריאות האדם; יש להשתמש במכשיר אידוי איזופלורן מאושר ונבדק באזור מאוורר היטב עם אמצעים לסילוק גזי פסולת.</li>
		<li>ברגע שרפלקס הבוהן נעדר, יש לגלח את ראש החיה. יש למרוח חומר סיכה לעיניים.</li>
		<li>הניחו את העכבר על משטח העבודה כשהראש בתוך חרוט האף כדי לשמור על הרדמה.</li>
		<li>לנהל סוכן משכך כאבים, כגון buprenorphine (0.6-0.8 מ"ג / ק"ג משקל גוף עכבר, תת עורית), על פי הוראות הספק.</li>
		<li>נקו את מקום ההזרקה על ידי ניגוב הראש בגזה סטרילית טבולה בתמיסת יוד (בצעו שלושה קרצוף), ולאחר מכן נגבו עם כרית קרצוף אלכוהול (בצעו שלוש פעמים). הערה: יש להסיר את הפרווה ולנקות את העור סביב אתר ההזרקה ולהשתמש במכשירים ומחטים סטריליים, בהתאם להמלצת האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית למניעת זיהומים.</li>
	</ol></li>
	<li>החזק בחוזקה את ראש העכבר ביד הלא דומיננטית. מקמו את הראש שטוח ככל האפשר על משטח העבודה.</li>
	<li>אתר את מקום ההזרקה.<ol><li>השתמש מחט חדה מוכן 18 G כדי לזהות תחילה bregma; לשם כך, גרור את המחט על פני העור של הראש לאורך קו האמצע, נע במישור rostral-caudal. דמיינו משולש שווה צלעות שבו שני הקודקודים הם העיניים והקודקוד השלישי הוא המיקום המשוער של ברגמה (ראו איור 1C).</li>
		<li>מ bregma, להעביר את המחט 2 מ"מ לרוחב ו 1 מ"מ caudal לאתר ההזרקה.</li>
	</ol></li>
	<li>תוך כדי החזקת המחט אנכית, דוחפים בחוזקה את המחט דרך העור והעצם עד שהצינור סומק עם העור.</li>
	<li>משכו את המחט, סובבו את המחט ולחצו שוב דרך העור והעצם. חזור על התהליך עד שנוצר חור קטן בעצם.</li>
	<li>השתמש במחט הקהה כדי לבדוק שנוצר חור מספיק בעצם. המטרה היא ליצור פתח בעצם גדול מספיק כדי שהמחט הקהה תעבור דרכו.</li>
	<li>הסר את העכבר מחרוט האף, נקה כל דם מאתר ההזרקה עם גזה סטרילית, והנח את העכבר בכלוב על כלוב חם יותר עד ער. מכיוון שהפתח שנעשה על ידי הקרניוטומיה הוא קטן (מחט 18 גרם), אין צורך לסגור את האתר בתפר או קליפסים לפצע. הערה: הפתח המיוצר כאן הוא קטן (18 גרם), ולכן מוסדות רבים רואים הליך זה זריקה בניגוד לניתוח. יתר על כן, למרות שנוצר פתח דרך העור והעצם למוח, החזקת העור מתוח גורמת לכך שהחורים אינם מיושרים, מה שככל הנראה מסייע במניעת מגע של המוח עם פלורת העור או מצעי הכלוב.</li>
</ol>2. ביצוע הזריקה
<ol><li>הכינו את החומרים להזרקה כמתואר להלן.<ol><li>הניחו משטח ספסל נקי או חומר וילונות על משטח העבודה. הדביקו את חרוט האף של מאדה איזופלורן למשטח העבודה (קרוב לנסיין, אך פונה אליו; ראו איור 1A).</li>
		<li>חבר מחט 27 G באורך 10 מ"מ עם שיפוע 45° למזרק זכוכית 5 μL. מניחים צינור סילסטי על המחט כך 3.5 מ"מ של קצה המחט בולט; השתמשו בסרט מעבדה כדי להצמיד את הצינורית לגוף המזרק (ראו איור 1D).</li>
		<li>הכינו את אמצעי ההזרקה (תרופה, וירוס או נוזל אחר להזרקה) בצינור. לקבלת התוצאות המייצגות במחקר זה, הוזרק מי מלח איזוטוניים סטריליים. הערה: בחר צינור המאפשר גישה באמצעות מזרק הזכוכית ומחט, כגון צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל.</li>
		<li>ציירו 3 מיקרוליטר של אמצעי הזרקה לתוך מזרק הזכוכית. ראשית, לצייר יותר מהנפח הרצוי, ולהוציא עד 3 μL נשאר מזרק.</li>
		<li>אספו פילינג יוד, גזה סטרילית ורפידות אלכוהול להכנת אתר ההזרקה.</li>
		<li>הפעל טיימר מעבדה במצב ספירה לאחור ומקם את הטיימר כך שיהיה גלוי לנסיין בעת ביצוע הזרקות.</li>
		<li>תרגול הזזת מחט 2 מ"מ לרוחב ו 1 מ"מ קאודלי כפי שבוצע ביום הקודם.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן את העכבר להזרקה כמתואר להלן.<ol><li>מניחים את העכבר בתא האינדוקציה ומרדים את העכבר עם איזופלורן. ברגע שרפלקס הבוהן נעדר, מרחו חומר סיכה לעיניים, והניחו את העכבר על משטח העבודה כשהראש בקונוס האף.</li>
		<li>נקו את מקום ההזרקה עם שלושה מגבונים של יוד ואלכוהול כל אחד. זהה את אתר ההזרקה באמצעות מחט 18 גרם (או מחט קהה) כמתואר בשלב 1.8. החור שנוצר במהלך craniotomy צריך להיות לזיהוי. הערה: אם הקרניוטומיה לא בוצעה מראש, או אם החור בגולגולת אינו ניתן לזיהוי, ניתן לבצע את הקרניוטומיה כאן.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע את ההזרקה עם מזרק זכוכית כמתואר להלן.<ol><li>החזק בחוזקה את ראש העכבר ביד הלא דומיננטית. מקמו את הראש שטוח ככל האפשר על משטח העבודה.</li>
		<li>מניחים את המחט של מזרק הזכוכית דרך החור בגולגולת עד שהצינור המונח מעל המחט שהוכן בשלב 2.1.2 מונח על עור העכבר.</li>
		<li>החזק את המזרק אנכית ככל האפשר, תוך שימת לב הן למישור העטרה והן למישור הסגיטלי. הזריקו באיטיות את המדיה במשך דקה.</li>
		<li>החזיקו את המזרק והמחט במקומם למשך דקה נוספת לאחר סיום ההזרקה כדי למזער את הזרימה חזרה. לאט לאט למשוך את המחט מראשו של העכבר.</li>
		<li>הסר את העכבר מחרוט האף, נקה כל דם מאתר ההזרקה עם גזה סטרילית (אם יש קיים), והנח את העכבר בכלוב על כלוב חם יותר עד ער.</li>
	</ol></li>
</ol>3. אישור מיקום ההזרקה
<ol><li>מרדימים עמוק ומחוררים את העכבר במי מלח ו-4% פרפורמלדהיד במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כפי שתואר קודם לכן8. אחסנו את המוח ב-30% סוכרוז ב-PBS בטמפרטורה של 4°C עד שהמוח שוקע (בדרך כלל יומיים).</li>
	<li>חתכו 20-50 מיקרומטר קטעי קורונל על קריוסטט כפי שתואר קודם9. בזמן החיתוך, התבוננו בדרכי ההזרקה בבלוק הרקמות. רשום אם מערכת ההזרקה חותכת בבירור את החדר הצידי.</li>
</ol>

ביצוע הזרקה תוך-מוחית בעכברים בגישה של יד חופשית

<ol><li>Roseweir, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+potent+kisspeptin+antagonists+delineate+physiological+mechanisms+of+gonadotropin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation.</a> Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).</li>
<li>Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+intracerebroventricular+injection+of+CD4%28%2B%29+T+cells+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).</li>
<li>Russo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+the+female+reproductive+axis+through+gated+responsiveness+of+the+RFRP-3+system+to+VIP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling.</a> Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).</li>
<li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).</li>
<li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li>
<li>McCosh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+hypoglycaemia+suppresses+pulsatile+luteinising+hormone+secretion+and+arcuate+Kiss1+cell+activation+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Comba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+glioma+subregions+for+spatial+and+molecular+characterization+of+intratumoral+heterogeneity%2C+oncostreams%2C+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion.</a> Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).</li>
<li>Porteous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reformulation+of+PULSAR+for+analysis+of+pulsatile+LH+secretion+and+a+revised+model+of+estrogen-negative+feedback+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice.</a> Endocrinology. 162 (11), (2021).</li>
<li>Hohmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+melanocortins+in+mediating+leptin%27s+central+effects+on+feeding+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).</li>
<li>Gottsch, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+kisspeptins+in+the+regulation+of+gonadotropin+secretion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).</li>
<li>Krasnow, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+galanin-like+peptide+in+the+integration+of+feeding%2C+body+weight+regulation%2C+and+reproduction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse.</a> Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן מתואר אמצעי פשוט ויעיל לביצוע זריקות ICV בעכברים. מכיוון שטכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית, גישה זו להעברה מרכזית של תרופות וסוכני ניסוי נגישה לחוקרים נוספים. בנוסף, גישה זו היא תפוקה גבוהה יחסית שכן הליך ההכנה וההזרקה יכול להתבצע במהירות.
מכיוון שהליך זה דורש מניפולציה של מחטים ומזרק זכוכית ביד תוך שימוש במרחקים משוערים, מומלץ שהמתרגל החדש יקדיש זמן מה לתרגול התנועות לפני עבודה עם בעלי חיים חיים. בנוסף, גופות עכבר יכול להיות שימושי לתרגול זיהוי ברגמה עם המחט. ברגע שקצת ביטחון בתנועה נרכש, ניסיון עם חיות אימון חיות ייעודיות מועיל. במהלך מפגשי התרגול, הזרקת 3 μL של דיו הודו הופכת את ההערכה החזותית של מיקום ההזרקה לקלה יותר. זריקות הממוקמות כראוי יגרמו להכתמה שחורה בחדר הצדדי האיפסילטרלי ולעיתים קרובות בחדר השלישי ובחדר הלטרלי הנגדי. הזרקת דיו היא הליך סופני ואין לאפשר לעכברים להתאושש מהרדמה לאחר הזרקת דיו. אפילו מתרגלים מנוסים יכולים להפיק תועלת מחזרה על התנועה הצידית של 2 מ"מ והתנועה הקאודלית של 1 מ"מ מספר פעמים לפני ביצוע הזריקה. בנוסף, חשוב להחזיק את מזרק הזכוכית אנכי כאשר הוא ממוקם במוח. עם תרגול, >75% מהזריקות צפויות להיות ממוקמות בצורה נכונה. החזקת המחט במקומה למשך ~1 דקות לאחר הזרקת הנפח המלא יכולה לסייע במניעת זרימה חוזרת של הנוזל אל מחוץ למוח. במהלך תקופה זו, חיוני להחזיק את המחט במצב הנכון ללא תנועה. ביצוע מוצלח של הליך זה דורש ניסיון במניפולציה אמינה והחזקת המחט ומזרק הזכוכית.
אם חלק מהזריקות אינן ממוקמות כראוי, קיימות מספר אפשרויות לפתרון בעיות. ראשית, בדקו שמחט ההזרקה ישרה (לא כפופה) ושהמחט מקובעת היטב למזרק הזכוכית. לאחר מכן, אם הזריקות שהוחמצו משתנות במיקומן, יש צורך בתרגול נוסף של מניפולציה והחזקת מזרק הזכוכית. אדם נוסף שיזהה אם המזרק מוחזק אנכית במהלך ההזרקה יכול גם הוא לעזור. מציאת ברגמה על עור שלם עם המחט דורשת גם תרגול. מומלץ מאוד לקחת זמן לזהות בביטחון את ציון הדרך הזה לפני שממשיכים בזריקה. אם הזריקות ממוקמות באופן עקבי במיקום שגוי, יהיה צורך לשנות את קואורדינטות ההזרקה. הקואורדינטות המתוארות כאן (±2 מ"מ לרוחב, 1 מ"מ קאודלי לברגמה) יעילות בעכברי C57/BL6 בוגרים, אך ייתכן שיהיה צורך להתאים קואורדינטות אלה לזנים אחרים או לקבוצות גיל אחרות.
למרות שטכניקה זו יכולה להיות יעילה מאוד באספקה מהירה של סוכנים באופן מרכזי, ישנן כמה מגבלות. מכיוון שהבוכנה של המזרק מועברת ביד, קצב ההזרקה יכול להיות משתנה. מומלץ להזריק אותו לאט יחסית כדי למנוע השפעות פוטנציאליות מחוץ למטרה של לחץ במערכת החדרים. נפח הזרקה של 3 μL מומלץ בפרוטוקול זה; עם זאת, נפח הזרקה גדול יותר (5 μL) נוצל במעבדות אחרות11. בהתאם לתוצאה שנמדדה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את נפח ההזרקה ואת קצבה. לדוגמה, עכברים צעירים עשויים לסבול רק נפחי הזרקה קטנים יותר. לכן, מומלץ לבצע ניסויים מקדימים לבדיקת השפעות הרכב. מגבלה נוספת היא שאישור מיקום נכון של ההזרקה מוגבל להערכה סובייקטיבית משהו של דרכי ההזרקה לאחר איסוף הרקמה. דרכי ההזרקה נראות הן ברקמה טרייה קפואה והן ברקמה מחוררת פרפורמלדהיד שנאספה מספר שעות לאחר הזרקת ICV (ראו תמונות בתוצאות מייצגות). אם מתבצעות מספר זריקות, ייתכן שלא יהיה ברור מסימני דרכי העיכול אם כל זריקה בוצעה בהצלחה.
גישה חופשית זו לביצוע זריקות ICV דורשת הרדמה. עם תרגול, הזריקות יכולות להתבצע במהירות, וכתוצאה מכך חשיפה קצרה (3-5 דקות) להרדמה. על ידי גילוח ראש העכבר וביצוע הקרניוטומיה (ניקוב הגולגולת במחט חדה) לפני יום הניסוי, ניתן לקצר את זמן ההרדמה במהלך הניסוי. עכברים בדרך כלל מחלימים לחלוטין מחשיפה קצרה זו להרדמה תוך מספר דקות. איסוף דגימות דם בקצה הזנב מיד לאחר ההרדמה יכול להיות מאתגר, כך שניתן להשהות את הדגימה למשך ~ 30 דקות לאחר ההזרקה כדי למזער את הלחץ בעכברים, אם כי זה לא הכרחי לחלוטין. מעבדות אחרות מדדו בהצלחה גם שינויים בהפרשת LH (דגימות חד פעמיות) 30 דקות לאחר מתן תרופות באמצעות טכניקת ICV ביד חופשית זו 1,12. שינויים בהתנהגות המוטורית והבליעה במשך תקופה של 24 שעות התגלו גם לאחר זריקות ICV13, כך שניתן לבצע ניטור לטווח ארוך. מומלץ לבצע בדיקות מקדימות כדי לקבוע את קלות הדגימה ואת ההשפעות האפשריות של ההרדמה על התוצאות המעניינות.
לסיכום, טכניקת הזרקת ICV ביד חופשית המתוארת כאן היא שיטה פשוטה אך רבת עוצמה להעברת חומרים ניסיוניים למוח. היתרונות הספציפיים הם שהגישה מהירה ופשוטה מבחינה טכנית ומאפשרת שיעור גבוה של זריקות מוצלחות. יתר על כן, מכיוון שטכניקה זו דורשת חשיפה קצרה בלבד להרדמה, ניתן לשלב אותה עם מגוון טכניקות אחרות כגון דגימת דם תכופה, מניפולציה של מעגלים עצביים, או הקלטה in vivo כדי לחקור תהליכים נוירואנדוקריניים.

אספקת חומרים ניסיוניים, כגון תרופות1, וירוסים2 או תאים3, למוח נחוצה לעתים קרובות למחקר נוירואנדוקריני. אם הסוכן אינו חוצה בקלות את מחסום הדם-מוח או שמטרת הניסוי היא לבדוק באופן ספציפי את ההשפעות המרכזיות של הסוכן, חשוב שתהיה שיטה אמינה להעברת זריקות למוח. יתר על כן, הזרקה לחלל התוך-מוחי (ICV) מספקת הזדמנות להפיץ את החומר באופן נרחב במוח ומספקת אזור מטרה גדול, ובכך מגדילה את הסיכוי להזרקה מוצלחת2. 
שיטה נפוצה לביצוע זריקות ICV כוללת מיקום של צינורית מגורים קבועה. בגישה זו, יש צורך במסגרת סטריאוטקסית כדי למקם את הצינורית הזמינה מסחרית או בהתאמה אישית, שכן הצינורית מודבקת או מלטת במקומה. לעתים קרובות, עם ההתאוששות, מינון supraphysiological של אנגיוטנסין II מנוהל דרך הצינורית, ואם התנהגות השתייה נצפתה מיד, אז הצינורית נחשבת ממוקמת כראוי4. לגישה זו יתרונות רבים, ביניהם היכולת לבצע עירוי ארוך טווח והיכולת להזריק לאותו בעל חיים מספר פעמים; בנוסף, אם אנגיוטנסין II מועסק, מיקום נכון ניתן לאשר לפני הממשל של תרכובות ניסיוניות. עם זאת, ישנן כמה מגבלות להצבת צינורית קבועה, כולל הדרישה לציוד יקר (מסגרת סטריאוטקסית), האפשרות לנזק לצינורית לאחר הנחתה (למשל, עכברים יכולים ללעוס צינורית של חבר לכלוב), והאפשרות של זיהומים סביב הצינורית הקבועה. זריקות ICV בודדות יכולות להתבצע באמצעות מסגרת סטריאוטקסית3, אשר, למרות יעילותה, דורשת חשיפה משמעותית להרדמה, ולכן עשויה לטשטש כמה השפעות פיזיולוגיות והתנהגותיות חריפות של הטיפול. בנוסף, מיקום עכברים במסגרת סטריאוטקסית דורש אימון משמעותי להשגת מיקום יציב ומניעת קריעה של תעלות האוזן.
כאן מתוארת שיטה מבוססת לביצוע זריקות ביד חופשית בעכברים. שיטה זו מבוססת על דוחות קודמים 5,6. היתרונות של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, מהירה, ואינה דורשת ציוד מיוחד כגון מסגרת סטריאוטקסית. כפי שיתואר להלן, הליך זה כרוך מניפולציה מזרק זכוכית ביחס ציוני דרך על ראש העכבר כדי לבצע את הזריקות, אשר ניתן לעשות במהירות, ולכן, דורש רק כמה דקות של הרדמה גז ביום הניסוי.

<table><tbody><tr><td>מחטים קהות 18 מד</td><td>SAI עירוי</td><td>B18-150</td><td></td></tr><tr><td>מחטים 18 מד</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td>רפואי</tr><tr><td>רפידות אלכוהול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>כרית ספסל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-206-62AC22</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת בטדין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-892-5235</td><td>חומר מבוקר</td></tr><tr><td>Eyelube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>מזרק זכוכית</td><td>המילטון</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>מחט הזרקה</td><td>המילטון</td><td>7803-01</td><td>27 מד, מחט RN רכזת קטנה, סגנון נקודה: 4, אורך מחט: 10 ס"מ, זווית: 45</td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp; &nbsp;</td><td>Patterson Vet Supply</td><td>07-893-8441</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vaporizer Vet Equip</td><td>V-10</td><td></td></tr><tr><td>קלטת מעבדה</td><td>VWR</td><td>89098-128</td><td></td></tr><tr><td>חמצן בדרגה</td><td>רפואית Airgas</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Millipore-Sigma</td><td>8.18715.1000</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח פישר מדעי</td><td>J67802. K2</td><td></td></tr><tr><td>PulsaR Software</td><td>קוד פתוח, אוניברסיטת אוטגו</td><td></td><td>ראה אסמכתא 9</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-00-152</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סילסטיים (0.040 אינץ' ID)</td><td>DOW</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סילסטיים (0.078 אינץ' ID)</td><td>DOW</td><td>508-009</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח סטרילית</td><td>VWR</td><td>101320-574</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

חקירת מערכות נוירואנדוקריניות דורשת לעתים קרובות העברה של תרופות, וירוסים או חומרים ניסיוניים אחרים ישירות למוחם של עכברים. הזרקה תוך-מוחית (ICV) מאפשרת העברה נרחבת של חומר הניסוי ברחבי המוח (במיוחד במבנים הסמוכים לחדרים). כאן מתוארות שיטות לביצוע זריקות ICV ביד חופשית בעכברים בוגרים. על ידי שימוש בציוני דרך חזותיים ומישושיים על ראשי עכברים, זריקות לחדרים הרוחביים יכולות להתבצע במהירות ובאמינות. ההזרקות נעשות באמצעות מזרק זכוכית המוחזק בידו של הנסיין ומונח במרחקים משוערים מציוני הדרך. לפיכך, טכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית. יתר על כן, טכניקה זו דורשת רק הרדמה איזופלורנית קצרה, המאפשרת הערכה עוקבת של התנהגות עכבר ו / או פיזיולוגיה בעכברים ערים המתנהגים בחופשיות. הזרקת ICV ביד חופשית היא כלי רב עוצמה להעברה יעילה של חומרים ניסיוניים למוחם של עכברים חיים, וניתן לשלב אותה עם טכניקות אחרות כגון דגימת דם תכופה, מניפולציה של מעגלים עצביים או הקלטה in vivo כדי לחקור תהליכים נוירואנדוקריניים.

כאשר מבוצעת בהצלחה, טכניקה זו מאפשרת משלוח מהיר של סוכן ניסיוני לתוך מערכת החדרים. פרופיל דופק של הורמון מחלמן (LH) מעכבר שעבר כריתת שחלות שקיבל זריקת ICV של 3 μL של מי מלח איזוטוניים סטריליים, הכלי לתרכובות פרמקולוגיות רבות, מוצג באיור 2A. דוגמה זו מדגימה כי חשיפה קצרה להרדמת גזים והזרקת 3 מיקרוליטר נוזל למערכת החדרים בלבד לא שינו את הפרשת LH הפועמת. בשעה 3 שעות לאחר הזרקת ICV, החיה הומתה ורקמה עצבית טרייה קפואה נאספה ונחתכה בהקפאה; דרכי ההזרקה הצטלבו בבירור עם החדר הצידי. דרכי ההזרקה נראו גם ברקמה עצבית מעכברים מחוררים עם קיבוע (10 מ"ל של מי מלח הפריניזציה ואחריו 20 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד בחיץ פוספט). דוגמאות לזריקות שמוקמו נכון מוצגות באיור 2B. שתי דוגמאות לזריקות שמוקמו באופן שגוי מוצגות באיור 2C. דוגמאות להזרקות נכונות (משמאל) ושל הזרקות שגויות של דיו הודי מוצגות באיור 2D. הזרקת דיו הודו שימושית לתרגול טכניקה זו מכיוון שהיא מאפשרת הדמיה ברורה של מיקום ההזרקה. ניתן לראות את זרימת הצבע הן לחדרים הצדיים והן לחדר השלישי בזריקות הממוקמות נכון (איור 2D, משמאל).
<img alt="הגדרת עכבר להרדמת איזופלורן עם דיאגרמות אתר הזרקה ומכלול מזרק." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: תמונות המתארות את הכנת הציוד ואת קואורדינטות ההזרקה להזרקות ICV ביד חופשית. (A) תצורת תחנת העבודה להזרקות ICV ביד חופשית. (B) סכימה לתרגול התנועה הדרושה להנחת הזרקת ICV בעכברות C57/BL6 בנות 3-4 חודשים. (C) מיקום משוער של ברגמה בעכברים בוגרים. (D) מיקום הצינורית לחשיפת 3.5 מ"מ מקצה המחט להזרקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="גרף של רמות LH לאורך זמן לאחר הזרקת מי מלח ICV; תמונות של פרוסות מוח מראות תוצאות ניסיוניות." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65324/65324fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: נתוני הורמון מחלמן והיסטולוגיה מייצגים הקשורים לזריקות ICV ביד חופשית. (A) פרופיל דופק LH לפני ואחרי הזרקת ICV. נקודות הנתונים עם מילוי שחור מלא מייצגות פולסים כפי שנקבעו באמצעות ניסוח מחדש של PULSAR10 עם הפרמטרים המוצעים בהפניה זו עבור עכבר OVX ורמת זיהוי של 0.32 ng/mL. (B) צילומים של קטע קורונלי במוח עכבר עם הזרקת ICV הממוקמת כראוי. (C) צילומים של מקטע קורונלי במוח עכבר עם הזרקת ICV שבוצעה באופן שגוי: מערכת הזרקה צידית לחדר (משמאל), ומערכת הזרקה גבית לחדר (מימין). (D) תצלומים של קטע קורונלי במוח עכבר עם הזרקת ICV ממוקמת כראוי של דיו הודו (משמאל) והזרקת ICV של דיו הודו הממוקמת באופן שגוי (מימין). הערה: לוחות B ו-C מתארים מוחות מחוררים פרפורמלדהיד שנאספו 3 שעות לאחר הזרקת מי מלח; לוח D מתאר מוחות טריים שנאספו על קרח יבש 2 דקות לאחר הזרקת דיו הודו. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65324/65324fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן מתוארת גישה פשוטה ומהירה לביצוע הזרקות תוך-מוחיות בעכברים בגישה של יד חופשית (כלומר, ללא מכשיר סטריאוטקסי).

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

אנו מתעניינים בבקרה העצבית של תפקוד מערכת הרבייה, במיוחד באופן שבו המוח מווסת את שחרורם של הורמונים השולטים בגונדות, הן בתנאים בריאים והן בתגובה ללחץ. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית ומהירה. העברת תרופות לחדר הצידי היא דרך מצוינת להטיל רשת רחבה בבדיקת מסלול איתות לתמיכה בניסויי מעקב מפורטים יותר.יש עדיין הרבה מה ללמוד על הבקרה הנוירואנדוקרינית של רבייה, כולל המנגנונים המולקולריים ליצירת דופק הורמונלי luteinization, מנגנונים לוויסות תדירות הדופק במהלך מתח, ויצירת נחשול LH טרום ביוץ. בעתיד, אנו מעוניינים במיוחד לשלב ממצאים שונים במודלים.

free-hand-intracerebroventricular-injections-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הדם עצמיים הזרקה מודל של דימום intracerebral בעכברים המתואר פרוטוקול זה משתמש בטכניקת הזרקה כפולה כדי למזער את הסיכון של ריפלוקס הדם במעלה השביל מחט, אין תרופות נגד קרישת דם במערכת שאיבה, ומונע כל שטח מת צינורות להרחבה במערכת.

הזרקת דם עצמיים על דגם דימום intracerebral ספונטנית עכברים

מאמר זה מדגים שתי שיטות שונות של הזרקת מאוד: 1) לתוך המוח (intracerebroventricular) ו 2) מערכתית (תוך ורידי) כדי להציג את סוכני טיפולית לתוך מערכת העצבים המרכזית של עכברים הילוד.

מסירה של סוכני טיפולית באמצעות Intracerebroventricular (ICV) ו תוך ורידי (IV) הזרקה של עכברים

סרטון זה מדגים הזרקה תוך-מוחית בתיווך אומאיה במודל עכבר. השיטה מאפשרת אספקה מקומית של תרופות מועמדות פוטנציאליות וחומקת ממחסום הדם-מוח.

הזרקה תוך-מוחית בעכבר: שיטת ניהול תרופות ישירה בתיווך אומאיה להעברת תרופות לחדרי המוח במוח עכבר

מקור: Li, D., et al. הזרקה תוך-תקלית ישירה של נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו בעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הליך ההזרקה התוך-תקלית של נגיפים הקשורים לאדנו (AAV) לנוזל המוח (CSF) של עכבר ער, המכסה הכנת מזרק, יישור עמוד השדרה והחדרת מחט מדויקת. שיטה זו מאמתת העברת גנים ממוקדת, ותומכת בפוטנציאל שלה לטיפולים במערכת העצבים המרכזית.

העברה תוך-תקלית של וירוסים במודל עכבר לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

מודלים של בעלי חיים למחלות ילדים יכולים לחוות התפרצות מוקדמת והתקדמות מחלה אגרסיבית. מבחינה קלינית משלוח טיפול רלוונטי למודלים של עכברים צעירים יכול להיות קשה מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטת הזרקה תוך ורידית לא פולשנית לעכברים שזה עתה נולדו בתוך שני הימים לאחר הלידה הראשונה של חיים.

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה של הזרקה תוך חדרית ותוך וסקולרית של חלקיקים נגיפיים או מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים למוח העכבר היילוד. ניתן לזהות את דפוס הלוקליזציה של הנגיף והננו-חלקיקים על ידי הערכה מיקרוסקופית או על ידי הכלאה באתר.

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

נתאר כאן עבור microinjection במוח מכרסמים המשתמשת קוורץ מחטים פרוטוקול. מחטים אלה לא לייצר נזק לרקמות לזיהוי ולהבטיח משלוח אמין אפילו באזורים עמוקים. יתר על כן, הם יכולים להיות מותאם לצרכי מחקר מאת עיצובים מותאמים אישית, ניתן להשתמש מחדש.

מחטים מותאמים אישית עבור Microinjections במוח מכרסמים

למטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים יש השפעות רבות פנים המובילות להתנהגות מורכבת אצל בעלי חיים. אנו שואפים לספק שיטה שלב אחר שלב כדי להגדיר את ההשפעות של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים במוח באמצעות העברה תוך-חדרית באמצעות צינורית מנחה.

העברה תוך-מוחית של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים בעכברים הנעים בחופשיות

הפרוטוקול הנוכחי מתווה הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים לצורך עריכת גנים והעברת תרופות.

הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

אטקסיות של פוליגלוטמין ספינוצרבלריות נגרמות על ידי התפשטות CAG המייצרת חלבונים המועדים להצטברות. פרוטוקול זה מתאר ייצור וקטורים, מסירה סטריאוטקסית וניתוח הכללות ואובדן סמנים נוירונים, ומספק פלטפורמה מבוקרת לחקר מנגנונים ולהערכת טיפולים ממוקדים למחלות ניווניות עצביות.

פתולוגיה סטריאטלית שנגרמה על ידי לנטריאלי כמודל פרה-קליני של אטקסיות תפינוצרבלריות פוליגלוטמין

למדו טכניקת זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים לחקר בקרה נוירו-אנדוקרינית של תפקוד רבייה והשפעת מתח על הורמונים. שיטה זו מאפשרת מסירה ממוקדת לחדר הצדדי ללא ציוד סטריאוטקטי.

זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים

גלה סרטונים נוספים