Name: ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: חקור שיטה חדשנית לביסוס תרביות תאי עצב וגליה ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים נגיפיים וחסינות מולדת. השיטה מאפשרת ניתוח מקיף באמצעות RT-qPCR, מיקרוסקופיה ו-FACS תוך הפחתת שימוש בבעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי מעבדות אדגר ולינינגטון, במיוחד לפרופ' כריס לינינגטון, ד"ר דיאנה ארסני וד"ר קטיה מוקליש, על עצותיהם, הערותיהם המועילות ועזרתם בהזנת התרבויות בזמן שהקמנו תרבויות אלה. תודה מיוחדת לד"ר Muecklisch על מתן נקודות ההתחלה עבור צינורות Cell Profiler. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה לטרשת נפוצה (מענק 122) וקרן יורי ולורנה צ'רניובסקי לפרלמנט; מימון אוניברסיטת גלזגו ל-JC ול-MP; ו-Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) ו-Medical Research Council (MRV0109721) ל-GJG.

כל הניסויים בבעלי חיים עמדו בחוקים ובהנחיות המקומיים לשימוש בבעלי חיים, ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המקומית באוניברסיטת גלזגו. בעלי החיים שוכנו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים בהתאם לחוק הנהלים המדעיים של בעלי החיים בבריטניה 1986, בחסות רישיון פרויקט משרד הפנים הבריטי. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J בוגרים שגודלו בבית. מומלץ להשתמש בנשים צעירות (8-12 שבועות) בשל שיעור ההצלחה הגבוה יותר של ההריון; ניתן לעשות שימוש חוזר בזכרים למספר סבבי רבייה. איור 1 מייצג סקירה סכמטית של השיטה המתוארת ליצירת תרביות נוירונים וגליה מעורבות.
1. הכנת חומרים מתכלים של תרבות הרקמה
<ol><li>הכינו את הצלחות ו/או הכלים המכילים כיסויי מיקרוסקופיה בתוך ארון בטיחות דרגה 2. לעקר את כל הריאגנטים או autoclave כדי להבטיח סטריליות במהלך תקופת התרבות.</li>
	<li>הוסף את הנפח המתאים של BA-PLL (13.2 מיקרוגרם/מ"ל פולי-L-ליזין-הידרוברומיד [PLL] במאגר חומצה בורית [BA] [50 מ"מ חומצה בורית, 12.5 מ"מ נתרן טטרבורט, pH 8.5]; ראה טבלת חומרים) לכל באר (1,000 מיקרוליטר/באר בצלחת בת 6 בארות, 100 מיקרוליטר/באר בצלחת של 96 בארות; הכרכים מסוכמים בטבלה 1). לכיסויי מיקרוסקופיה יש להוסיף 20 מ"ל BA-PLL לצלחת תרבית רקמה בקוטר 9 ס"מ המכילה 200 כיסויים סטריליים, ולהסתחרר לפיזור אחיד.</li>
	<li>יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1-2 שעות.</li>
	<li>הסר את תמיסת BA-PLL מכל באר או צלחת המכילה כיסויי מיקרוסקופיה, ושטוף על ידי הוספת 20 מ"ל מים סטריליים, ערבול החלקות הכיסוי, ולאחר מכן הסרת המים. חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים. עבור צלחת המכילה כיסויים, השאירו מים סטריליים בצלחת תרבית הרקמה בשטיפה הסופית כדי להסיר בקלות את הכיסויים.</li>
	<li>מוציאים כמה שיותר נוזלים עם פיפטה סטרילית ומניחים להתייבש לפחות שעתיים עד לילה.</li>
	<li>אחסנו את הצלחות המצופות בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים. הערה: חומצה בורית מוכנה עם תמיסת פולי-ל-ליזין (BA-PLL) ניתנת לשימוש חוזר עד שלוש פעמים, הוספת PLL חדש בכל פעם. אחסן את BA-PLL ב 4 ° C. מנות מטופלות עם BA-PLL, כמו PLL מאפשר לתאים להישאר למטה ולגדול. ללא טיפול זה, התאים יתרוממו לאחר כשבוע של תרבית ולא יוכלו עוד להתמיין.</li>
</ol>2. דיסקציה של המוח העוברי E17
<ol><li>בית משותף של עכבר נקבה אחת או יותר עם עכבר זכר. בדוק את הנקבות מדי יום עבור פקק ריר, המציין הזדווגות התרחשה. הערה: כל נקבת עכברה "מחוברת" צריכה להיות מופרדת מהזכר כדי להבטיח את תאריך ההתחלה הנכון של ההריון. ניתן לשקול עכברים כדי לאשר הריון או לפקח חזותית.</li>
	<li>יש לכלוא את העכבר ההרה ב-E17 בשיטות מתאימות בהתאם להנחיות ולחוקים המקומיים לרווחת בעלי חיים, לדוגמה, על ידי העלאת ריכוז הפחמן הדו-חמצני (CO2), מנת יתר קטלנית של חומר הרדמה או נקע של הצוואר. הערה: אסור שהשיטה שנבחרה תשבש את העוברים. במחקר זה, חשיפה לריכוז עולה של גז פחמן דו חמצני ואחריו אישור מוות על ידי קטיעת עורק הירך שימשה כדי לרפות סכרים בהריון.</li>
	<li>הניחו את העכבר ההרה על גבו על לוח נתיחה; אמנם אין צורך להצמיד אותו, אך הוא עשוי להקל על חוקרים חסרי ניסיון. צבטו את קו האמצע של הבטן באמצעות מלקחיים. באמצעות מספריים חדים, לחתוך לפתוח את הבטן דרך העור ואת הצפק מעל קו האמצע מן איבר המין לכלוב הצלעות, נזהר לא לנקב את הרחם.<ol><li>לרחם העכבר יש שתי קרניים, שכל אחת מהן מכילה בדרך כלל עובר אחד עד חמישה עוברים. הסר את הרחם המכיל את העוברים מן האם ומיד להניח אותו על קרח.</li>
	</ol></li>
	<li>חותכים דרך שק החלמון בצד השליה, נזהרים שלא לפגוע בעוברים, ומוציאים את העוברים משק החלמון שלהם.</li>
	<li>ערפו מיד את ראשיהם של העוברים. הוסיפו את הראשים הערופים לצלחת עם תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) ללא סידן (Ca 2+) ומגנזיום (Mg2+) (HBSS-/-) על קרח. הערה: אם נדרש גנוטיפ, ניתן להסיר את הזנב בשלב זה לצורך ניתוח גנטי. כאשר צפויים גנוטיפים מרובים, יש לשמור את הראשים של כל עובר בנפרד לצורך תרבית.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים זוויתיים מקמו את הראש על צדו כשהוא פונה שמאלה.</li>
	<li>חורר את העין עם קצה אחד של המלקחיים, מחזיק בחוזקה את הסנטר עם השני.</li>
	<li>מתחילים מהעורף, קורעים בעדינות את עור הקרקפת לאורך קו האמצע לכיוון קצה החוטם.</li>
	<li>נכנסים דרך חוט השדרה, בולט כמו אליפסה לבנה, להשתמש מלקחיים זוויתיים כדי לפצח את הגולגולת לאורך קו האמצע, לחשוף את המוח.</li>
	<li>מקלפים בעדינות את הגולגולת בצד הפונה כלפי מעלה, וחושפים את המוח.</li>
	<li>הרימו את המוח אל מחוץ לגולגולת, והשליכו את הגולגולת לאחר שהמוח הוסר לחלוטין.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, להסיר את קרומי המוח, אשר בולטים כמו קרום דק עם כלי דם צפופים.</li>
	<li>הכניסו את המוח לביז'ו (ראו טבלת חומרים) המכיל 2 מ"ל HBSS-/- על קרח.</li>
	<li>חזרו על שלבים 2.6 עד 2.13 עם המוחות הנותרים, והוסיפו עד ארבעה מוחות לכל ביז'ו.</li>
	<li>הוסף 250 μL של טריפסין 10x bijou ו triturate המוח על ידי ניעור bijou. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C. הערה: כל השלבים מנקודה זו ואילך צריכים להתבצע בתרבית רקמה סטרילית.</li>
	<li>הפשרה 2 מ"ל של מעכב טריפסין סויה (SD) (Leibovitz L-15, 0.52 מ"ג/מ"ל מעכב טריפסין מפולי סויה, 40 מיקרוגרם/מ"ל DNase I, 3 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר [BSA] חלק V; ראו טבלת חומרים) מ-20°C - על ידי הצבתו בטמפרטורה של 37°C.</li>
	<li>הוסיפו 2 מ"ל של מעכב SD לכל ביז'ו המכיל מוח (לכל ביז'ו המכיל עד ארבעה מוחות), ונענעו שוב את הביז'ו כדי לפזר אותו באופן שווה. הערה: מעכב SD מפחית את פעילות הטריפסין כדי למנוע עיכול מיותר של הדגימות ולשמר את יכולת הקיום של התא.</li>
	<li>ללא צנטריפוגה, מוציאים 2 מ"ל של הסופרנאטנט מכל ביז'ו ומעבירים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, נזהרים שלא להעביר גושי תאים.</li>
	<li>Triturate את התאים הנותרים bijou עם מחט 19 G מחובר מזרק 5 מ"ל על ידי שאיפה את המתלה פעמיים. זה ייצור תערובת סמיכה דמוית ריר.<ol><li>חזור על הפעולה פעמיים נוספות באמצעות מחט 21 גרם. אם נותרו גושים, יש לשלש שוב עם מחט 21 גרם.</li>
	</ol></li>
	<li>העבר את התאים מהביז'ו לאותה צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל (משלב 2.18) באמצעות מחט 23 גרם.</li>
	<li>צנטריפוגה במהירות 200 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.</li>
	<li>מוציאים את כל הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל ומעבירים אותו לצינור צנטריפוגה נוסף של 15 מ"ל, נזהרים שלא להפריע לגלולה הרופפת בתחתית המכילה את התאים הדרושים.</li>
	<li>צנטריפוגה את הסופרנאטנט שוב ב 200 x גרם ב RT במשך 5 דקות. הערה: שלב זה אינו חיוני, אך אם אדם זקוק לתאים רבים או שיש לו מעט עוברים, ניתן לבצע שלב זה כדי לשחזר תאים רבים ככל האפשר מהסופרנטנט.</li>
	<li>שימוש ב-10 מ"ל של חומרי ציפוי (PM) (49% מדיום עיט מעובד של Dulbecco [DMEM], 1% פניצילין/סטרפטומיצין [Pen/Strep], 25% סרום סוס, 25% HBSS עם Ca 2+ ו-Mg2 + [HBSS+ /+]; ראו טבלת חומרים), שלבו והשעו מחדש את שתי הכדוריות יחד ליצירת תרחיף תא שלם.</li>
	<li>ספרו את התאים באמצעות טריפאן כחול והמוציטומטר או מונה תאים דיגיטלי, ודללו את תרחיף התא עם PM לריכוז של 1.8 x 106 תאים / מ"ל.</li>
</ol>3. ציפוי התאים
<ol><li>הוסף את הנפח הנדרש של מתלה התא לתבנית הנדרשת כמפורט בטבלה 1: 1,000 μL לבאר בפורמט 6 בארות, 50 μL לבאר בפורמט 96 באר, או 100 μL לכל כיסוי.</li>
	<li>יש לדגור במשך 2-4 שעות בטמפרטורה של 37°C עם 5%-7% CO2. בדקו שהתאים נצמדו באמצעות מיקרוסקופ הפוך.</li>
	<li>הסר את המדיה וטען באמצעי בידול חדש (DM+: DM- כולל אינסולין של 10 מיקרוגרם/מ"ל. DM-: DMEM, 1% עט/Strep, הידרוקורטיזון 50 ננומטר, ביוטין 10 נ"ג/מ"ל, תוסף מדיה 2.5 מ"ל 100x N1; ראו טבלת חומרים). הכרכים מפורטים בטבלה 1. לחצו כלפי מטה על כל הכיסויים הצפים בעזרת קצה פיפטה סטרילי.</li>
</ol>4. שמירה על התרבויות
הערה: תרבויות אלה דורשות האכלה שלוש פעמים בשבוע כדי לתמוך בגדילה ובהתמיינות אופטימליות. התרביות יגיעו לבריאות ובשלות אופטימליות לניסויים ב-DIV (ימים במבחנה) 21. תאים יכולים להישמר בתרבית עד 28 ימים, ולאחר מכן התרביות מתנוונות במהירות.
<ol><li>שלוש פעמים בשבוע עד DIV12, להחליף חלק של supernatant עם DM+ טרי על ידי הסרת 500 μL לכל באר בפורמט 6 באר, 50 μL לכל באר בפורמט 96 באר, או 500 μL לכל צלחת המכילה שלושה כיסויים, והוספת 600 μL לכל באר בפורמט 6 באר, 60 μL לכל באר בפורמט 96 באר, או 600 מיקרוליטר לכל צלחת כיסוי (טבלה 1).</li>
	<li>שלוש פעמים בשבוע מ-DIV13 ואילך, החליפו חלק מהסופרנאטנט ב-DM טרי על ידי הסרת 500 μL לבאר בפורמט 6 בארות, 50 μL לבאר בפורמט 96 באר, או 500 μL לצלחת המכילה שלוש כיסויים, והוספת 600 μL לבאר בפורמט 6 בארות, 60 μL לבאר בפורמט 96 באר, או 600 מיקרוליטר לכל צלחת כיסוי (טבלה 1).</li>
</ol>

מוח עכבר עוברי מעורב תרביות תאים כדי לחקור זיהום וחסינות מולדת

<ol><li>Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKovacs%2C+GG+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22">Handbook of Clinical Neurology</a>. 145, Elsevier. 13-23 (2018).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Techniques%22">The Principles of Humane Experimental Techniques</a>. 1, Methuen. (1959).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Thomson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((synapsing+cultures+of+murine+spinal+cord-validation+as+an+in+vitro+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system.</a> The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).</li>
<li>Bijland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+studying+CNS+white+matter%3A+Functional+properties+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches.</a> F1000Research. 8, 117(2019).</li>
<li>Fragkoudis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+and+oligodendrocytes+in+the+mouse+brain+differ+in+their+ability+to+replicate+Semliki+Forest+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurovirology%22%5BJournal%5D)">Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus.</a> Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).</li>
<li>Hayden, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-specific+IgMs+induce+antiviral+responses+in+the+CNS%3A+Implications+for+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135(2020).</li>
<li>Kantzer, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-ACSA-2+defines+a+novel+monoclonal+antibody+for+prospective+isolation+of+living+neonatal+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes.</a> Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).</li>
<li>Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+and+macrophages+in+CNS+homeostasis%2C+autoimmunity%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer.</a> Journal of Immunology Research. 2017, (2017).</li>
<li>Gee, J. R., Keller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+Regulation+of+brain+homeostasis+via+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).</li>
<li>Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+myelination%3A+possible+roles+of+the+immune+proteasome+in+oligodendroglial+homeostasis+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 867357(2022).</li>
<li>Keller, D., Erö, C., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+densities+in+the+mouse+brain%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cell densities in the mouse brain: A systematic review.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83(2018).</li>
<li>Wang, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygenglucose+deprivation+enhancement+of+cell+death%2Fapoptosis+in+PC12+cells+and+hippocampal+neurons+correlates+with+changes+in+neuronal+excitatory+amino+acid+neurotransmitter+signaling+and+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents.</a> Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Chen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+atlas+of+the+developing+prenatal+and+postnatal+mouse+central+nervous+system%2C+with+emphasis+on+prenatal+days+E7.5+to+E18.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5.</a> Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).</li>
<li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+overview+of+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li>
<li>Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+decades+of+new+drug+development+for+central+nervous+system+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Two decades of new drug development for central nervous system disorders.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).</li>
<li>Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+new+approaches+in+CNS+drug+discovery%3A+Why+drugs+have+failed%2C+and+what+can+be+done+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes.</a> Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+%28polydendrocytes%29+in+brain+physiology+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 133(2014).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+Promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59(2017).</li>
<li>Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+and+actin-containing+filaments+of+normal%2C+preneoplastic%2C+and+neoplastic+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells.</a> Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).</li>
<li>Koch, K. S., Leffertt, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+of+differentiated+adult+rat+hepatocytes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).</li>
<li>Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+the+infiltrating+immune+cells+in+the+brain+of+healthy+individuals%3A+effect+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity+and+Ageing%22%5BJournal%5D)">Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging.</a> Immunity and Ageing. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מערכת העצבים המרכזית היא רשת מורכבת המשתרעת מהמוח ועד חוט השדרה ומורכבת מסוגי תאים רבים, בעיקר נוירונים, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ומיקרוגליה1. מכיוון שלכל תא יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס וביצירת תגובות מתאימות לאתגרים במערכת העצבים המרכזית 9,10,11, מערכת תרבית המכילה את כל סוגי התאים הללו היא כלי שימושי ורב-תכליתי לחקור כיצד המוח עשוי להגיב לגירוי. היכולת לחקור תאים אלה, ואת יחסי הגומלין ביניהם...

שיפור ההבנה שלנו של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא קריטי לשיפור האפשרויות הטיפוליות עבור מחלות נוירו-דלקתיות וניווניות רבות. מערכת העצבים המרכזית, רשת מורכבת של תאים המחוברים זה לזה במוח, בעמוד השדרה ובעצבי הראייה, כוללת נוירונים, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ותאי מערכת החיסון המולדת שלהם, מיקרוגליה1. גישה חוץ-גופית יכולה לעתים קרובות להפחית באופן דרסטי את מספר העכברים הדרושים לביצוע מחקר משמעותי; עם זאת, האופי המורכב של מערכת העצבים המרכזית אינו מאפשר לשחזר את המצב in vivo באמצעות קווי תאים. תרביות תאים עצביים מעורבים מספקות כלי מחקר בעל ערך רב לחקר שאלות נוירו(אימונו)לוגיות במודל רלוונטי, בהתאם לעקרונות החלפה, הפחתה ועידון (3Rs) 2,3.
תומסון ועמיתיו תיארו שיטת תרבית תאים המשתמשת בתאי חוט שדרה טרום לידתי המתמיינים לכל סוגי תאי CNS העיקריים שהוזכרו לעיל4. למערכת זו יש גם היווצרות סינפסות, אקסונים מיאלינטים וצמתים של Ranvier. המגבלה העיקרית של שיטת תרבית זו היא שבהיותו חוט השדרה, הוא אינו מודל שימושי של המוח, והתא מניב מיום עוברי 13 (E13) חוטי השדרה מתכווצים. לפיכך, זה מגביל את מספר תנאי הניסוי שניתן לחקור. לכן, מחקר זה נועד לפתח מערכת תרבית תאים חדשה המשחזרת את מאפייני המוח עם תפוקת תאים מוגברת כדי להפחית את הדרישות לבעלי חיים.
באמצעות תומסון ועמיתיו כנקודת מוצא, פיתחנו מודל של תרבית תאים שנגזר אך ורק ממוחות של עכברים לפני הלידה. לתרביות אלה יש את אותן אוכלוסיות תאים, קישוריות ואפשרויות טיפול כמו תרביות חוט השדרה, אלא שיש פחות מיאלינציה בהשוואה. עם זאת, מודל CNS in vitro עם תפוקת תאים גבוהה פי שלושה בקירוב הוא יעיל יותר, דורש פחות עכברים ופחות זמן עיבוד עוברים. ביצענו אופטימיזציה של מערכת תרביות ייחודית זו עבור יישומים ומאזניים מרובים במורד הזרם, כולל שימוש בכיסויי זכוכית לניתוח מיקרוסקופיה ובגדלים שונים של לוחות בארות פלסטיק, כולל לוחות 96 בארות למחקר בתפוקה גבוהה.

<table><tbody><tr><td>10x טריפסין</td><td>סיגמא</td><td>T4549-100 מ"ל</td><td>לעיכול רקמות</td></tr><tr><td>140 מ"מ TC Dish</td><td>Fisher</td><td>11339283</td><td>לשים 8 צלחות 35 מ"מ לכל צלחת 1 140 מ"מ</td></tr><tr><td>15 מ"ל Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td>לאיסוף תאים לגלולה להשעיה מחדש באמצעי ציפוי</td></tr><tr><td>18 G מחט</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710012040</td><td>לטריטורציה של דגימה</td></tr><tr><td>21 גרם מחט</td><td>BD</td><td>304432</td><td>לטריטורציה של דגימה</td></tr><tr><td>23 גרם מחט</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>לטריטורציה של דגימה</td></tr><tr><td>35 מ"מ</td><td>TC Dish Corning</td><td>430165</td><td>צלחת החוצה 3 כיסויים מצופים PLL לכל צלחת 1 35 מ"מ</td></tr><tr><td>מזרק 5 מ"ל</td><td>פישר</td><td>15869152</td><td>לטריטורציה של</td></tr><tr><td>מדגם 6 צלחת</td><td>באר Corning</td><td>3516</td><td>לצלחת תאים עבור RT-qPCR, וזרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>7 מ"ל Bijoux</td><td>Fisher</td><td>DIS080010R</td><td>לשים מוחות</td></tr><tr><td>intp 96 צלחת</td><td>באר קורנינג</td><td>3596</td><td>לצלחת תאים לבדיקת תפוקה גבוהה</td></tr><tr><td>נוגדן ACSA-2, נגד עכברים, PE</td><td>Miltenyi</td><td>130-123-284</td><td>לצביעה ציטומטרית זרימה של אסטרוציטים</td></tr><tr><td>מלקחיים זוויתיים</td><td>Dumont</td><td>0108-5/45-PO</td><td>לדיסקציה</td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא</td><td>B4501</td><td>עבור DM+/-</td></tr> <tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא</td><td>B6768-500G</td><td>עבור חומצה בורית חומצה</td></tr><tr><td>מבריקה סגול 421 נגד עכבר CD24 נוגדן, שיבוט M1-69</td><td>Biolegend</td><td>101825</td><td>לצביעה ציטומטרית זרימה של נוירונים ואסטרוציטים</td></tr><tr><td>סגול מבריק 605 נגד עכבר CD45 נוגדן, שיבוט 30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103139</td><td>לצביעה ציטומטרית זרימה של מיקרוגליה</td></tr><tr><td>סגול מבריק 785 נגד עכברים/אנושי CD11b נוגדן, שיבוט M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101243</td><td>לצביעה ציטומטרית זרימה של מיקרוגליה</td></tr><tr><td>BSA Fraction V</td><td>Sigma</td><td>A3059-10G</td><td>עבור מעכב SD</td></tr><tr><td>CNP</td><td>Abcam</td><td>AB6319</td><td>אוליגודנדרוציטים בוגרים</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR</td><td>631-0149</td><td>לצלחת תאים למיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>דיסקציה מספריים</td><td>סיגמא</td><td>S3146-1EA</td><td>לדיסקציה</td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה, נתרן פירובט, L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td>עבור DM+/-, ולציפוי</td></tr><tr><td>מדיה DNase I</td><td>Thermofisher</td><td>18047019</td><td>למעכב SD, יכול להשתמש ב-DNA זה או אחר מ-sigma</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>עבור מעכב SD, יכול להשתמש ב-DNA זה או אחר מ-thermofisher</td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td><td>Thermofisher</td><td>65-0865-14</td><td>מלקחיים עדינים כתם חי / מת</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>0102-SS135-PO</td><td>לדיסקציה</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>אסטרוציטים</td></tr><tr><td>HBSS w Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9269-500ML</td><td>לציפוי מדיה</td></tr><tr><td>HBSS w/o Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9394-500ML</td><td>להוספת מוחות</td></tr><tr><td>לסרום</td> <td>סוסיםGibco</td><td>26050-070</td><td>לציפוי מדיה</td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H0396</td><td>עבור DM+/-</td></tr><tr><td>Iba1</td><td>Alpha-Laboratories</td><td>019-1971</td><td>אינסולין מיקרוגליה</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא</td><td>I1882</td><td>עבור DM+</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>GIbco</td><td>11415-049</td><td>עבור מעכב SD</td></tr><tr><td>MBP</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA409S</td><td>מיאלין</td></tr><tr><td>עכבר CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit</td><td>BioTechne</td><td>DY478-05</td><td>ELISA Kit לכימות ריכוז CCL5 בסופרנטנטים של 96 באר צלחת</td></tr><tr><td>N1 תוסף מדיה</td><td>Sigma</td><td>N6530-5ML</td><td>עבור DM+/-</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Merck</td><td>MAB353</td><td>תאי גזע/אב עצביים</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Thermofisher</td><td>PA578499</td><td>גוף תא עצבי</td></tr><tr><td>NG2</td><td>Sigma</td><td>AB5320</td><td>אוליגודנדרוציטים לא בשלים</td></tr><tr><td>נוגדן O4, אנטי אנושי/עכבר/חולדה, APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-119-155</td><td>לצביעה ציטומטרית זרימה של אוליגודנדרוציטים</td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוק</td><td>סיגמא</td><td>P0781-100ML</td><td>עבור DM+/-, ולציפוי חומרי</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinehydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>עבור תמיסת חומצה בורית / פולי-L-ליזין לציפוי כיסויים</td></tr><tr><td>SMI31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>אקסונים</td></tr><tr><td>נתרן טטרבוראט</td><td>סיגמא</td><td>221732-100G</td><td>עבור חומצה בורית מאגר</td></tr><tr><td>טריזול</td><td>תרמופישר</td><td>15596026</td><td>עבור תאים ליזינג עבור מעכב RT-qPCR</td></tr><tr><td>טריפסין מפולי סויה</td><td>סיגמא</td><td>T9003-100MG</td><td>עבור מעכב SD</td></tr></tbody></table>

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

מודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) חייבים לשחזר את הרשת המורכבת של תאים מחוברים הנמצאים in vivo. מערכת העצבים המרכזית מורכבת בעיקר מנוירונים, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ותאי מיקרוגליה. בשל המאמצים הגוברים להחליף ולהפחית את השימוש בבעלי חיים, פותחו מגוון מערכות תרבית תאים במבחנה כדי לחקור תכונות תאים מולדות, המאפשרות פיתוח טיפולים לזיהומים ופתולוגיות במערכת העצבים המרכזית. בעוד ששאלות מחקר מסוימות יכולות להיות מטופלות על ידי מערכות תרבית תאים מבוססות אדם, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים (מושרים), לעבודה עם תאים אנושיים יש מגבלות משלה לגבי זמינות, עלויות ואתיקה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול ייחודי לבידוד וטיפוח תאים ממוחות עכברים עובריים. תרביות התאים העצביות המעורבות המתקבלות מחקות מספר אוכלוסיות תאים ואינטראקציות הנמצאות במוח in vivo. בהשוואה לשיטות המקבילות כיום, פרוטוקול זה מחקה באופן הדוק יותר את מאפייני המוח וגם מגייס יותר תאים, ובכך מאפשר לחקור יותר תנאי ניסוי מעכבר הרה אחת. יתר על כן, הפרוטוקול קל יחסית וניתן לשחזור מאוד. תרביות אלה עברו אופטימיזציה לשימוש בקני מידה שונים, כולל מסכי תפוקה גבוהה מבוססי 96 בארות, ניתוח מיקרוסקופיה של 24 בארות ותרביות 6 בארות לניתוח ציטומטריית זרימה ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-qPCR). שיטת תרבית זו היא כלי רב עוצמה לחקור זיהום וחסינות בהקשר של חלק מהמורכבות של מערכת העצבים המרכזית עם הנוחות של שיטות חוץ גופיות .

מיקרוסקופ תרביות הגדלות על כיסויי זכוכית אידיאליות לניתוח במיקרוסקופיה. כדי להמחיש את התפתחות התרביות, הכיסויים נקבעו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) במספר נקודות זמן מ-DIV0 (לאחר חיבור התאים) ועד DIV28. התרביות הוכתמו לצורך דימות אימונופלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן5 באמצעות שלושה שילובי צביעה שונים: NG2 (אוליגודנדרוציטים לא בוגרים) ונסטין (תאי גזע/תאי אב) כסמנים התפתחותיים, SMI31 (אקסונים), MBP (מיאלין) ו-NeuN (גוף תא עצב) כסמנים עצביים, או CNP (אוליגודנדרוציטים), GFAP (אסטרוציטים) ו-...

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

שאלת המחקר האולטימטיבית של הפרויקט שלי היא להבין כיצד אנו יכולים לתמרן את התגובה החיסונית המולדת של מערכת העצבים המרכזית כדי להגן מפני זיהומים נגיפיים. כיום, אנו חוקרים את התגובה שלהם לחלבון האנטי-ויראלי אינטרפרון בטא. אתגר ניסיוני הוא לייצר מספיק תאים כדי לאפשר חקירה מפורטת.כל תוצאה צריכה להיות מאומתת באמצעות טכניקות מרובות וזה יכול, למרבה הצער, לגרום לבעלי חיים רבים להיות מגודלים. בשל מספר התאים הגדול שנוצר על ידי טכניקת תרבית חדשנית זו, ניתן לחקור תנאי ניסוי רבים ושונים מעכבר הרה אחד. בנוסף, שימוש בתחליפי מבחנה, במידת האפשר, גם מפחית מאוד את סבלם של בעלי החיים.שיטה זו מפחיתה ומעדנת את השימוש בבעלי חיים, תוך שמירה הדוקה על העקרונות של שלושת Rs.שיטת תרבית זו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות מחקר רבות ושונות באמצעות מגוון רחב של שיטות קריאה כגון ELISA, qPCR, מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. טכניקה זו יכולה לסייע לחוקרים אחרים להפחית ולשכלל את השימוש שלהם בבעלי חיים. אנו מקווים לשפר את הבנתנו את התגובה האנטי-ויראלית המולדת, ולאפנן אותה כדי להגן מפני וירוסים אופורטוניסטיים כגון נגיף פוליומה אנושי 2, או וירוס ג'ון קנינגהם, כפי שהוא ידוע בדרך כלל, הסוכן העיקרי של PML אשר יכול להיות תופעת לוואי חמורה של תרופות לדיכוי המערכת החיסונית המשמשות לטיפול בטרשת נפוצה ובמחלות אחרות.

establishing-mixed-neuronal-glial-cell-cultures-from-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר שיטות להפיק אוכלוסיות מועשר Murine של תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) בתרבות העיקרי, אשר להבדיל לייצר oligodendrocytes בוגרת (OLS). בנוסף, דו"ח זה מתאר את טכניקות כדי לייצר Murine myelinating שיתוף תרבויות על ידי זריעת OPCs העכבר על המיטה neurite של הגב עכבר שורש עצב הגנגליון (DRGNs).

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

אנו מספקים פרוטוקול תרבות מטוהרים מאוד נוירונים בהיפוקמפוס של המוח עכבר טרום לידתי ללא שימוש שכבת תא גלייה מזין.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

הסרטון הדגים את השיטה של בידוד וטיפוח תאים ממוחו של עכבר בילוד. היא כללה דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של המוח, ואחריה תרבית במצע גדילה חסר גורם גדילה עצבי כדי להשיג אוכלוסיית גלייה מעורבת.

השגת תרבית תאי גליה מעורבת ממוח עכבר יילוד

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גלייה מעורבים ראשוניים מרקמת חוט השדרה של עכבר בוגר. הפרוטוקול כולל עיכול אנזימטי של הרקמה, ואחריו הסרת קרומי תאים שבורים ופסולת מיאלין כדי להשיג אוכלוסייה של תא יחיד. לאחר מכן התאים מתורבתים במדיה המותאמת לגידול תאי גלייה מעורבים.

הקמת תרביות תאי גליה מעורבים ראשוניים מחוט השדרה של עכבר

אנו מדגימים פרוטוקול תרבית תאים למחקר הישיר של רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים enteric. נוירון / תרבות מעורבת גליה על coverslips מוכן ממקלעת myenteric של עכבר בוגר מתן היכולת לבחון נוירון בודד ופונקציה על ידי גליה electrophysiology,...

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכבר שדרה.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.

יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים

חקור שיטה חדשנית לביסוס תרביות תאי עצב וגליה ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים נגיפיים וחסינות מולדת. השיטה מאפשרת ניתוח מקיף באמצעות RT-qPCR, מיקרוסקופיה ו-FACS תוך הפחתת שימוש בבעלי חיים.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

גלה סרטונים נוספים