זילוח מכונת כבד Normothermic Ex Vivo בעכבר

זילוח מכונת כבד Normothermic ex-Vivo בעכבר. זילוח כבד מחומצן נורממי הוא אסטרטגיה מבטיחה להצלת איברים שוליים ולאחרונה הוצג בפרקטיקה הקלינית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הבסיסיים אינם מובנים היטב.

יש צורך במודל עכברי כדי להמשיך לחקור את המסלולים המולקולריים, תוך ניצול בעלי חיים מהונדסים גנטית, כגון עכברים טרנסגניים, ולכן ממתינים להקמת מערכת זילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית עבור כבדי עכברים. הנה תוכנית של כל המערכת שלנו. ראשית, המערכת כולה נשלטת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על ידי בקר תרמוסטטי באמצעות זרימת מים.

הפרפוזט נשאב מהמאגר על ידי משאבה פריסטלטית לתוך מחמצן. יש זרימת גז רצופה של 95% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני במחמצן. לאחר מכן הפרבוסט עובר דרך מלכודת בועות.

הפרבוסט עם בועות האוויר נשאב חזרה למאגר בלחץ. הפרפוזט הנותר זורם לתא האיבר שבו הצינור מחובר לווריד הפורטל. הפרפוזט מנוקז מהכבד דרך הקאווה העל-כבדית לתוך תא האיברים.

זרימת הפרפוזט מתא האיברים מופנית חזרה למאגר על ידי המשאבה הפריסטלטית. צינור ניקוז מרה מחובר לתא האיברים כדי לאסוף מרה. זהו שולחן הניתוחים שלנו.

כל הניתוחים נעשים תחת מיקרוסקופ. אנו שומרים על תנאי ניתוח סטריליים למחצה לאורך כל ההליך הכירורגי. החזיקו את צינורית הצינור הצרפתית במלקחיים.

חודרים את דופן הצינורית עם מחט 30G במרחק של סנטימטר אחד מקצה הצינורית. דוחפים את המחט דרך הצינורית עד שקצה המחט הופך גלוי. הנה תמונת השוואה של קטטר 26G וצינורית מתוצרת עצמית; שניהם מתאימים לקנולציה של פורטל עכבר.

מכינים 25 מיליליטר של מלוחים heparinized עם ריכוז סופי של 2, 500 יחידות בינלאומיות למיליליטר, ומניחים מזרק באינקובטור להגדיר על 40 מעלות צלזיוס. להלן המרכיבים העיקריים של מערכת זילוח המכונה הנורמותרמית ex-vivo. הרכיבים כוללים בעיקר את תא האיבר, המכונה התרמוסטטית, משאבת הרולר, המחמצן והמאגר.

כאן, אתה יכול לראות הגדרה מפורטת של תא האיברים שלנו. בעיקרון, הוא מורכב מגוף תא איברים, חיישן לחץ, מחליף חום ומלכודת בועות. הקמנו מפרצון פרפוסט, שקע פרפוסט, ופתח ניקוז מרה.

זוהי מערכת ניטור ADI בה אנו משתמשים כדי לנטר את לחץ הווריד הפורטלי. מערכת ADI מורכבת מחיישן לחץ, בקר מרכזי וצגים. הפעל את תוכנית LabChart לניטור לחץ.

כיול ואפס נדרשים לפני כל שימוש בחיישן הלחץ. השתמש בכספית אפס מילימטר ובכספית 20 מ"מ כסימנים כדי לכייל את חיישן הלחץ עבור הכיול הדו-שלבי. בהתבסס על ניטור מתמיד של לחץ הפורטל, אנו יכולים להתאים את פלורן הפורטל בהתאם לשינויי לחץ.

בנפחים שווים של פרפוסטט למאגר ולתא האיברים כדי להנהיג את המערכת, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשמירה על סטריליות במהלך תהליך המילוי. חבר תא אינדוקציה עם שקע בקיר. הפוך חמצן ל 0.5 ליטר לדקה.

יש להפוך את האיזופלורן ל-3%מניחים את בעל החיים בתא עד לקבלת הרדמה עמוקה. השתמש מזרק מיקרו להחיל משקל הגוף מותאם מינון של שיכוך כאבים. הנה, שבעה מיקרוליטר של buprenorphine.

כעת, אנו מתחילים את ניתוח הניתוח. בצע חתך רוחבי באזור הבטן של העכבר. חתך העור משתרע על קו בית השחי של הבשר הדו-צדדי משני הצדדים.

בזהירות לבצע חתך אורכי לאורך linea alba. חותכים דרך שכבת שרירי הבטן עם electrocoagulation ומספריים. בזהירות מניחים חתיכת גזה רטובה כדי להגן על הכבד מפני electrocoagulation.

לחשוף באופן מלא את חלל הבטן של העכבר. בזהירות להעביר את המעי הדק מתוך חלל הבטן עם צמר גפן רטוב כדי לחשוף באופן מלא את הילום. מוצג כאן תרשים סכמטי של קנולציה של ורידים פורטליים וקנולציה של צינור המרה.

בעיקרון, אנו בוחרים את הצינורית המתאימה בהתאם לגודל העכבר, ואנו משתמשים בתפר משי 6-0 לקיבוע הצינורית. שחררו בזהירות את צינור המרה המשותף באמצעות מלקחיים מעוקלים עדינים ללא שיניים. צינור המרה המשותף ניזוק בקלות רבה ונשבר.

ברגע שהוא נשבר, אי אפשר לקנן אותו. בשל כיוון המיקום האנטומי, מלקחיים מעוקלים קלים יותר לתפעול. הניחו שתי לולאות תפר משי 6-0 מעל צינור המרה המשותף כהכנה לשלב הבא.

בזהירות לנקב את צינור המרה עם מחט 30G. השתמש במלקחיים מעוקלים מחודדים כדי להגדיל את החורים הקטנים, כך שהוא יוכל להזין את קנולציית צינור המרה. השתמש במלקחיים של כלי דם על פני צינורית צינורית צינור המרה ודחוף אותה לתוך צינור המרה. הערה.

ברגע הקנולציה, תרגישו את ההתנגדות שמביאה המרה. אם הכוח אינו נשלט היטב, הצינורית תידחף החוצה מדרכי המרה על ידי הלחץ של זרימת המרה. בזהירות להתאים את עומק הצינורית.

אם הוא עמוק מדי, הוא עלול לפגוע בצינור המרה, ואם הוא לא עמוק מספיק, הוא עלול להחליק החוצה. ניתן לראות זרימת מרה בצינורית לאחר קנולציה מוצלחת. מהדקים את וריד הפורטל במלקחיים שטוחים ומשחררים בזהירות את רקמת החיבור במלקחיים מעוקלים.

אל תמשוך חזק כאן, כדי לא לגרום לקריעה של וריד הפורטל. ברגע שווריד הפורטל ניזוק, קשה לשחזר את וריד הפורטל. מניחים שני תפרי משי 6-0 לולאה מעל וריד השער החופשי.

השתמש אטב עורקי כדי לסגור את הווריד הפורטלי הדיסטלי. בזהירות רבה לנקב את וריד הפורטל עם אחד הצינורית וריד הפורטל לעיל. זרימת הדם ניתן לראות בבירור בתוך הצינורית לאחר ניקוב מוצלח.

קח תמיסת מלח הפרין שחוממה מראש מאינקובטור. הסירו את כל בועות האוויר. תקן מזרק עם מלוחים heparinized שחומם מראש לתוך משאבת מזרק.

חבר את צינור ההרחבה של משאבת המזרק לצינורית של וריד הפורטל. התאם את המהירות לשני מיליליטר לדקה והתחל את שטיפת הכבד. להגדיל isoflurane ל 5% ו המתת חסד העכבר עם מנת יתר isoflurane אינהלציה.

שימו לב לצבע הכבד בסוף הליך השטיפה. הבלו על הכבד ברגע שהצבע הפך לצהוב הומוגני. בזהירות להעביר את הכבד לתוך חדר האיברים באמצעות צלחת פטרי.

שמור כמות קטנה של מלוחים בצלחת פטרי כדי למנוע כבד מלהיות מרוסק. הערה. ניתן בקלות לסובב את הווריד הפורטלי ואת צינור המרה במהלך הליך זה, מה שעלול להשפיע על זילוח הכבד ואיסוף המרה. להחדיר לאט מלח רגיל לתוך צינורית וריד הפורטל עם מזרק כדי לפנות את בועות האוויר בצינורית.

חבר את צינורית הווריד הפורטלי לצינור זרימת הפרפוזט בתא האיבר. צינורית צינורית צינור המרה של העכבר מונחית דרך שסתום של חדר האיברים, אשר סגור עם כובע גומי. לאחר מכן, צינור המרה מוכנס לתוך צינור מיקרו מוכן מראש 0.5 מיליליטר עם חור קטן להוביל.

לאחר שהכל מחובר, הפעל את המשאבה הפריסטלטית. בדוק את קריאת לחץ ורידי הפורטל כדי להתאים את קצב הזרימה. שמור על לחץ הווריד הפורטלי בין שבעה ל -10 מילימטר כספית על ידי התאמת קצב הזרימה. הערה.

קצב זרימה נומינלי יכול להשתנות מעט בהתאם לגיל ולמיקום הצינורות. זוהי הבחירה של מדיום פרפוסט, נפח פרבוסט ולחץ זילוח בהתבסס על מחקר ספרותי של מחקרי זילוח מכונת כבד של חולדה מחומצנת נורמותרמית. זהו ניסוי שלב אחר שלב כדי לבסס את מודל זילוח העכבר.

נדרשו כ-14 ניסויים כדי לבחור את הצנתרים המתאימים ביותר. בידינו, שימוש בשני צנתרי גומי צרפתיים לווריד הפורטלי, יחד עם קטטר גומי צרפתי אחד לצינור המרה, הוא השילוב הטוב ביותר להשגת זילוח הומוגני כאשר כל הצנתרים במקום. רמת החומציות ורמת האשלגן היו יציבות לאורך כל 12 שעות הזילוח.

רמת החומציות נעה בין 7.26 ל-7.71, ורמת האשלגן נעה בין 5.9 ל-6.8 מילימול לליטר. צביעת HE מראה כי לאחר 12 שעות זילוח, שלמות ההיסטולוגיה של כבד העכבר נשמרה טוב יחסית. יחד, הדגמנו כאן את הקמתה המוצלחת של מערכת זילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית עבור כבד העכבר.

זילוח של כבד עכבר במשך 12 שעות הביא לשימור טוב של המורפולוגיה של הכבד, אם כי לא לאורך כל האיבר. נדרש מאמץ נוסף כדי להשיג זילוח הומוגני מלא על פני תקופה ארוכה יותר של זמן. ברגע שזה מושג, ניתן לשקול שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטית, כגון השימוש בעכברי IL-2-knockout כדי לחקור את תפקיד הדלקת.