Name: זילוח מכונת כבד Normothermic Ex Vivo בעכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: למדו את שיטת זילוח מכונת כבד נורמותרמי אקס ויו בעכברים לחקר מסלולים מולקולריים וזיהוי תוספי פרפוזט חדשניים. מערכת זו מאפשרת שימור איברים שוליים ומחקר מנגנוני ביולוגיה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

לאורך כתיבת מאמר זה קיבלתי תמיכה וסיוע רבים. אני רוצה להודות במיוחד לחבר הצוות שלי XinPei Chen על שיתוף הפעולה הנפלא שלו ותמיכתו במטופלים במהלך הניתוח שלי.

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות הגרמניות הנוכחיות ולהנחיות לרווחת בעלי חיים ולהנחיות ARRIVE לדיווח על מחקר בבעלי חיים. פרוטוקול הניסויים בבעלי חיים אושר על ידי Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, תורינגיה, גרמניה (מספר אישור: UKJ - 17 - 106).
הערה: עכברי C57BL/6J זכרים במשקל 34 ± 4 גרם (שגיאת תקן ± ממוצעת של הממוצע [SEM]) שימשו כתורמי כבד. הם נשמרו בתנאים סביבתיים מבוקרים (50% לחות ו 18 - 23 מעלות צלזיוס) עם גישה חופשית לצ'או עכבר סטנדרטי ומים. במהלך ההליך הכירורגי נשמר קצב נשימה העולה על 60 נשימות לדקה, וטמפרטורת הגוף נשמרה מעל 34 מעלות צלזיוס.
1. הכנה
<ol><li>הגדרת שולחן הניתוחים
	<ol><li>Autoclave כל כלי ניתוח מתכלים למטרות עיקור.</li>
		<li>הפעל את כל הציוד, כולל לוח החימום ואלקטרוקואגולציה.</li>
		<li>מניחים מזרק אחד של 50 מ"ל עם מי מלח בנפח 25 מ"ל (2,500 U/L) באינקובטור חם (37°C).</li>
		<li>הניחו את כלי הניתוח, תפר משי 6 - 0, מוליך כותנה קטן סטרילי, מלח וטרינרי (500 מ"ל) וספוגי גזה לא ארוגים (10 ס"מ x 10 ס"מ) על שולחן הניתוחים כראוי.</li>
		<li>מניחים מחט 26 G על שולחן הניתוחים כדי ליצור חור קטן במכסה של צינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מ"ל כדי לקבל את צינור המרה לאיסוף מרה.</li>
		<li>מניחים על שולחן הניתוחים את הצינורית (צינורית פוליאוריתן 1 Fr או UT - 03 צינורית פוליאתילן) וצינור מיקרוצנטריפוגה מעוקר בנפח 0.5 מ"ל לאיסוף מרה.</li>
	</ol></li>
	<li>צינורית ורידים פורטלית מתוצרת עצמית
	<ol><li>החזיקו את צינורית 2 Fr במלקחיים ונקבו את הדופן עם מחט 30 G במרחק של 1 ס"מ מקצה הצינורית. דוחפים את המחט דרך הצינורית עד שקצה המחט הופך גלוי.</li>
		<li>חותכים את קצה הצינורית ויוצרים משולש חד.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מלוחים heparinized
	<ol><li>להכין 25 מ"ל של מלוחים heparinized עם ריכוז סופי של 2,500 IU / mL.</li>
		<li>מוציאים את כל בועות האוויר ומניחים את המזרק באינקובטור של 40 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>הדגמה של מערכת הזילוח
	<ol><li>ראו איור 1 עבור המרכיבים העיקריים של מערכת זילוח המכונה.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדרת תא העוגב
	<ol><li>ראו איור 2 לפריסת תא העוגב.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדרת מערכת הזילוח
	<ol><li>הפעל את תוכנית תרשימי המעבדה לניטור לחץ.</li>
		<li>חבר את כיול הלחץ ואת חיישן הלחץ ברמת תא האיבר.</li>
		<li>התאם את כיול הלחץ לקריאת 0 מ"מ כספית ובדוק את הערך המתאים בתוכנת בקרת הלחץ.</li>
		<li>התאם את כיול הלחץ לקריאת 20 מ"מ כספית ושוב בדוק את הערך המתאים בתוכנת בקרת הלחץ.</li>
		<li>הפעל את אמבט המים, ולחמם מראש את תא האיברים ל 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>שטפו את כל מערכת האינסטלציה פעמיים במים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה למשך 30 דקות כל אחד, כדי להבטיח הסרה מלאה של תמיסת החיטוי.</li>
		<li>התחל את זרימת תמיסת החיטוי בכל המערכת למשך 20 דקות כדי להבטיח חיטוי יסודי.</li>
		<li>הפעל את תערובת הגזים (95% חמצן (O 2) ו 5% פחמן דו חמצני (CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>מילוי פרפוזט
	<ol><li>תוסף 250 מ"ל של מדיום E של ויליאמס עם 50 מ"ל של סרום בקר עוברי, 3 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין (1 מ"ג/מ"ל), 0.17 מ"ל אינסולין (100 IE/מ"ל), 0.34 מ"ל הפרין (5000 U/mL), ו-0.07 מ"ל הידרוקורטיזון (100 מ"ג/2 מ"ל) להכנת מדיום E השלם של ויליאמס.</li>
		<li>הוסף נפחים שווים (150 מ"ל) של פרפוזט למאגר ולתא האיברים כדי להנהיג את המערכת. הערה: יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשמירה על סטריליות במהלך תהליך המילוי. הפרפוזט נשאב ללא הרף דרך שני מרכיבי מפתח אלה של זילוח מכונת המחזור הסגור.</li>
		<li>הפעל את המשאבה הפריסטלטית במהירות בינונית (15 מ"ל/דקה) כדי להפעיל את מערכת הזילוח עם התווך המחומצן.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מטע כבד
<ol><li>הכנה לפני ניתוח
	<ol><li>לשקול את החיה. הכן את משכך כאבים buprenorphine (0.3 מ"ג / מ"ל) (0.05 מ"ג / ק"ג משקל הגוף).</li>
		<li>חבר את תא האינדוקציה לשקע בקיר. הפוך חמצן ל 0.5 ליטר / דקה. הפוך isoflurane ל 3%.</li>
		<li>הניחו את בעל החיים בחדר עד שמגיעים להרדמה עמוקה (רפלקס ימין חיובי).</li>
		<li>השתמש מזרק מיקרו כדי להחיל מינון מותאם משקל הגוף של שיכוך כאבים תת עורית.</li>
		<li>השתמשו במכונת גילוח חשמלית כדי לקצץ את הפרווה על עור הבטן.</li>
		<li>העבירו את העכבר לשולחן הניתוחים והפעילו את מכשיר האידוי איזופלורן ל-2.5% כדי לשמור על הרדמה. אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הבוהן הבין-דיגיטלי.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת בטן העכבר
	<ol><li>הנח את העכבר במצב שכיבה.</li>
		<li>בדוק רפלקס בין-דיגיטלי כדי לאשר פעמיים את עומק ההרדמה המתאים. תקן את כל ארבעת הגפיים בנייר דבק.</li>
		<li>יש לחטא את שני צידי הבטן עד לקו אמצע בית השחי באמצעות שלושה סבבים רצופים של יוד-אלכוהול. השתמש בגזה מעוקרת לא ארוגה כדי לכסות את האזור סביב שדה הניתוח.</li>
		<li>בצע חתך רוחבי של 3 ס"מ 1 ס"מ מתחת לקסיפואיד באזור הבטן של העכבר באמצעות מספריים לתינוקות מצנבאום ומלקחיים כירורגיים.</li>
		<li>יש להרחיב את החתך בעור באופן דו צדדי לקו אמצע בית השחי משני הצדדים.</li>
		<li>בזהירות לבצע חתך אורכי 2 ס"מ לאורך linea alba באמצעות מספריים קפיץ.</li>
		<li>חותכים דרך שכבת שרירי הבטן עם אלקטרוקואגולציה ומספריים קפיציים Vannas.</li>
		<li>בזהירות מניחים חתיכת גזה רטובה כדי להגן על הכבד מפני electrocoagulation.</li>
		<li>השתמש בתפר משי 6 - 0 עם המחט העגולה כדי למשוך את תהליך הקסיפואיד לחשיפה טובה יותר של הרצועה הכלילית.</li>
		<li>השתמש בשני צלעות retractors כדי לחשוף באופן מלא את חלל הבטן של העכבר.</li>
		<li>בזהירות להעביר את המעי הדק מתוך חלל הבטן עם צמר גפן רטוב כדי לחשוף באופן מלא את הילום.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת צינור המרה הנפוצה
	<ol><li>חצו את הרצועות הפלציפורמיות, הפרניות והגסטרוהפטיות בעזרת מספריים חדים.</li>
		<li>שחררו בזהירות את צינור המרה המשותף באמצעות מלקחיים מעוקלים עדינים ללא שיניים. הערה: צינור המרה הנפוץ ניזוק בקלות רבה ונשבר. ברגע שהוא נשבר, אי אפשר לקנן אותו. בשל כיוון המיקום האנטומי, עדיף להשתמש במלקחיים מעוקלים.</li>
		<li>הניחו שתי לולאות תפר משי 6 - 0 מעל צינור המרה המשותף כהכנה לשלב הבא.</li>
	</ol></li>
	<li>קנולציה נפוצה של צינור המרה
	<ol><li>בזהירות לנקב את צינור המרה עם מחט 30 גרם. השתמש במלקחיים מעוקלים מחודדים כדי להגדיל את החור הקטן כך שיתאים לקנולציה של צינור המרה.</li>
		<li>השתמש במלקחיים של כלי דם כדי לתפוס את צינורית צינורית צינור המרה ולדחוף אותה לתוך צינור המרה.</li>
		<li>אבטחו פעמיים את הצינורית עם לולאות התפרים הקבועות מראש 6 - 0. הערה: במהלך הקנולציה מורגשת התנגדות על ידי מרה. אם הכוח אינו נשלט היטב, הצינורית תידחף החוצה מדרכי המרה על ידי הלחץ של זרימת המרה. בזהירות להתאים את עומק הצינורית. אם הוא עמוק מדי, הוא עלול לפגוע בצינור המרה, ואם הוא לא עמוק מספיק, הוא עלול להחליק החוצה.</li>
		<li>שימו לב לזרימת המרה בצינורית לאחר קנולציה מוצלחת.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת וריד הפורטל
	<ol><li>מהדקים את וריד הפורטל במלקחיים שטוחים ומשחררים בזהירות את רקמת החיבור במלקחיים מעוקלים. אין למשוך חזק כדי למנוע קרע של וריד הפורטל. ברגע שווריד הפורטל ניזוק, קשה לקנטר מחדש את וריד הפורטל.</li>
		<li>נתחו את ה-PV בדיוק מעל הביפורקציה והניחו את לולאת התפר הראשונה באמצעות תפר משי 6 - 0 על PV קרוב למפגש לשימוש מאוחר יותר.</li>
		<li>מקם את לולאת התפר השנייה לקיבוע מאוחר יותר של PV קרוב ככל האפשר להילום הכבד.</li>
	</ol></li>
	<li>קנולציה של ורידים פורטליים
	<ol><li>השתמש אטב עורקי כדי לסגור את הווריד הפורטלי הדיסטלי.</li>
		<li>בזהירות רבה, לנקב את וריד הפורטל עם אחת צינוריות ורידי הפורטל לעיל. זרימת הדם ניתן לראות בבירור בתוך הצינורית לאחר ניקוב מוצלח.</li>
		<li>אבטח את צינורית ה- PV באמצעות לולאת התפרים 6 - 0 שהונחה מראש.</li>
	</ol></li>
	<li>שטיפת כבד
	<ol><li>להגדיל isoflurane ל 5% ולהרדים את העכבר עם מנת יתר של שאיפת isoflurane.</li>
		<li>קח תמיסת מלח הפרין שחוממה מראש מהאינקובטור. הסר את כל בועות האוויר שנוצרו בתוך מלוחים heparinized.</li>
		<li>תקן את המזרק עם מלוחים heparinized שחומם מראש לתוך משאבת מזרק.</li>
		<li>חבר את הצינורית המאריכה של משאבת המזרק לצינורית של וריד הפורטל, כוונן את המהירות ל -2 מ"ל / דקה, והתחל את שטיפת הכבד.</li>
		<li>שימו לב לצבע הכבד בסוף הליך השטיפה. הבלו על הכבד ברגע שהצבע הופך לצהוב הומוגני.</li>
		<li>טרנסקט את הסרעפת, הווריד הנבוב התחתון העל-הכבדי, הווריד האינפרא-כבד הנבוב, עורק הכבד, וריד הפורטל הדיסטלי וכל רקמת חיבור שנותרה.</li>
		<li>הכניסו את הכבד לצלחת הפטרי.</li>
	</ol></li>
</ol>3. חיבור כבד ותא
<ol><li>העברת כבד
	<ol><li>בזהירות להעביר את הכבד לתוך חדר האיברים באמצעות צלחת פטרי.</li>
		<li>שמרו כמות קטנה של מלח בצלחת הפטרי כדי למנוע מהכבד להתייבש. הערה: ניתן בקלות לסובב את הווריד הפורטלי ואת צינור המרה במהלך הליך זה, מה שעלול להשפיע על זילוח הכבד ואיסוף המרה.</li>
	</ol></li>
	<li>חיבור צינורית ורידים פורטל
	<ol><li>להחדיר לאט מלח רגיל לתוך צינורית וריד הפורטל עם מזרק כדי לפנות את בועות האוויר בצינורית.</li>
		<li>חבר את צינורית הווריד הפורטלי לצינור זרימת הפרפוזט בתא האיבר.</li>
	</ol></li>
	<li>חיבור צינורית צינורית צינור המרה
	<ol><li>יש להנחות את צינורית צינורית צינור המרה של העכבר דרך שסתום של כובע גומי המחובר לתא האיברים.</li>
		<li>הכנס את צינורית צינור המרה לתוך microtube מוכן מראש 0.5 מ"ל עם חור קטן במכסה.</li>
		<li>הניחו את המיקרו-צינור על חימר מחוץ לתא האיברים.</li>
	</ol></li>
</ol>4. התאמת קצב הזרימה בהתאם ללחץ PV
<ol><li>הפעל את המשאבה הפריסטלטית מ 1 מ"ל / דקה.</li>
	<li>בדוק את קריאת לחץ ורידי הפורטל כדי להתאים את קצב הזרימה.</li>
	<li>שמור על לחץ הווריד הפורטלי בטווח הפיזיולוגי בין 7 - 10 מ"מ כספית על ידי התאמת קצב הזרימה. הערה: קצב זרימה נומינלי עשוי להשתנות מעט בהתאם לשימוש ולמיקום הצינורות.</li>
</ol>5. איסוף דוגמאות
<ol><li>קבל דגימות פרפוזט כניסה מצינור זרימת הווריד הפורטלי ודגימות פרפוזט מוצא מתא האיבר במרווחים של 3 שעות.</li>
	<li>לאסוף דגימות מכל אונות הכבד לניתוח היסטולוגי בסוף תקופת זילוח של 12 שעות.</li>
</ol>

אין ניגודי עניינים כספיים לחשוף.

שלבים קריטיים בפרוטוקול שני השלבים המכריעים בכריתת הכבד הם קנולציה של הווריד הפורטלי (PV) והקנולציה הבאה של צינור המרה (BD). צעדים אלה הם בעלי חשיבות עליונה בהבטחת שאיבת איברים מוצלחת והליכי זילוח או השתלה לאחר מכן.
אתגרים ופתרונות קנולציית PV מציבה שלושה אתגרים: פגיעה בדופן כלי הדם, תזוזה של הצנתר ומעשיות תהליך ההחדרה. האופי העדין של דופן כלי ה- PV הופך אותו לרגיש לנקב ודימום לאחר מכן אם לא מטפלים בו בזהירות במהלך הקנולציה. יתר על כן, כל איבוד דם מה- PV...

השתלת כבד מייצגת את תקן הזהב לטיפול באנשים עם מחלת כבד סופנית. למרבה הצער, הביקוש לתרומת איברים עולה על ההיצע הזמין, מה שמוביל למחסור משמעותי. בשנת 2021 היו ברשימת ההמתנה להשתלת כבד כ-24,936 חולים, בעוד שרק 9,234 השתלות בוצעו בהצלחה1. הפער המשמעותי בין ההיצע והביקוש של שתלי כבד מדגיש את הצורך הדחוף לחקור אסטרטגיות חלופיות להרחבת מאגר התורמים ולשיפור הנגישות של שתלי כבד. אחת הדרכים להרחיב את מאגר התורמים היא להשתמש בתורמים שוליים2. תורמים שוליים כוללים אלה עם גיל מתקדם, סטאטוזיס בינוני או חמור. למרות שהשתלת איברים שוליים עשויה להניב תוצאות חיוביות, התוצאות הכלליות נותרות לא אופטימליות. כתוצאה מכך, פיתוח אסטרטגיות טיפוליות שמטרתן לשפר את תפקודם של תורמים שוליים נמצא כיום בעיצומו 3,4.
אחת האסטרטגיות היא להשתמש בזילוח מכונה, במיוחד זילוח מכונה מחומצן נורמתרמי, כדי לשפר את תפקודם של איברים שוליים אלה5. עם זאת, עדיין קיימת הבנה מוגבלת של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההשפעות המועילות של זילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית (NEVLP). עכברים, עם הזמינות השופעת שלהם של זנים מהונדסים גנטית, משמשים מודלים רבי ערך לחקר מסלולים מולקולריים. לדוגמה, המשמעות של מסלולי אוטופגיה בהקלה על פגיעה באיסכמיה בכבד הוכרה יותר ויותר 6,7. מסלול מולקולרי חשוב אחד בפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה בכבד הוא מסלול miR-20b-5p/ATG78. נכון לעכשיו, קיימים מספר זני עכבר מסוג ATG knockout ו-knock-out מותנה, אך אין זני חולדות מתאימים9.
בהתבסס על רקע זה, המטרה הייתה ליצור פלטפורמת NEVLP ממוזערת עבור שתלי כבד עכבר. פלטפורמה זו תקל על חקירה והערכה של אסטרטגיות פוטנציאליות מהונדסות-גנטית שמטרתן לשפר את הפונקציונליות של הכבד של התורם. בנוסף, היה חיוני שהמערכת תתאים לזילוח לטווח ארוך, ותאפשר טיפול ex vivo בכבד, המכונה בדרך כלל "תיקון איברים".
בהתחשב בזמינות המוגבלת של נתונים רלוונטיים במבחנה על זילוח כבד עכברים, סקירת הספרות התמקדה במחקרים שנערכו בחולדות. חיפוש שיטתי בספרות שנמשכה בין השנים 2010 ל-2022 בוצע באמצעות מילות מפתח כגון "זילוח כבד נורמתרמי", "ex vivo or in vitro" ו"חולדות". חיפוש זה נועד לזהות תנאים אופטימליים במכרסמים, ולאפשר לנו לקבוע את הגישה המתאימה ביותר.
מערכת הזילוח מורכבת ממאגר חיץ זכוכית אטום עם מעטפת מים, משאבת גלילים פריסטלטית, מחמצן, מלכודת בועות, מחליף חום, תא איבר ומערכת צינורות אופניים סגורה (איור 1). המערכת מבטיחה תחזוקה מדויקת של טמפרטורת זילוח קבועה של 37°C באמצעות מכונה תרמו-סטטית ייעודית. משאבת הגלילה הפריסטלטית מניעה את זרימת הפרפוסטה לאורך המעגל. מעגל הזילוח מתחיל במאגר המים המבודד. לאחר מכן, הפרפוזט מופנה דרך המחמצן, אשר מקבל תערובת גז של 95% חמצן ו -5% פחמן דו חמצני מבקבוק גז ייעודי. לאחר החמצון, הפרפוזט עובר דרך מלכודת הבועות, שבה כל הבועות הכלואות מנותבות חזרה למאגר על ידי המשאבה הפריסטלטית. הפרבוסט הנותר זורם דרך מחליף החום ונכנס לתא האיברים, משם הוא חוזר למאגר.
כאן, אנו מדווחים על ניסיוננו בהקמת NEVLP עבור כבדי עכברים וחולקים את התוצאות המבטיחות של ניסוי פיילוט שבוצע באמצעות התווך המחומצן ללא נשאי חמצן.

<table><tbody><tr><td>0.5 מ"ל מיקרו צינור PP</td><td>Sarstedt</td><td>72699</td><td></td></tr><tr><td>1 Fr צינורית גומי</td><td>Vygon</td><td>מדגם צינורית</td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L מיקרו מזרק</td><td>המילטון</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>2 Fr צינורית גומי</td><td>Vygon</td><td>מדגם צינורית</td><td></td></tr><tr><td>24 גרם צינורית פרפר</td><td>Terumo</td><td>SR+OF2419</td><td></td></tr><tr><td>26 גרם צינורית פרפר</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2619WX</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם מחט היפודרמית</td><td>Sterican</td><td>100246</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל משאבת מזרק</td><td>בראון</td><td>110356</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Seide</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>קליפ עורקי</td><td>בראון</td><td>BH014R</td><td></td></tr><tr><td>תא לח הניתן לחיטוי</td><td>הוגו סאקס אלקטרוניק</td><td>73-4733</td><td></td></tr><tr><td>מוליך כותנה גדול&nbsp;</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974018</td><td></td></tr><tr><td>מלכודת בועות</td><td>Hugo-Sachs-Elektronik</td><td>V83163</td><td></td></tr><tr><td>Buprenovet (0.3 מ"ג / מ"ל)</td> <td>תמיסת Elanco</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>CIDEX OPA (2 ליטר)</td> <td>Cilag GmbH</td><td>20391</td><td></td></tr><tr><td>יחידה אלקטרוכירורגית לחיתוך חד קוטבי VIO&reg; 50 C</td><td>ERBE</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (500 מ"ל)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F7524-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>תערובת גז (95% חמצן & 5% פחמן דו חמצני)</td> <td>אספקה</td> ביתית <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>חימום אמבטיות במחזור</td><td>הרווארד - מכשיר</td><td>75-0310</td><td></td></tr><tr><td>הפרין 5000 (כלומר / 5 מ"ל)</td> <td>בראון</td><td>1708.00.00</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון (100 מ"ג / 2 מ"ל)</td> <td>פייזר</td><td>15427276</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין (100 IE / מ"ל)</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לאיריס&nbsp;</td><td>מכשירי מדע עדינים</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן (250 מ"ל)</td><td>Cp-Pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>מחמצן ממברנה</td><td>הוגו זקס אלקטרוניק</td><td>T18728</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מיקרוכירורגיה&nbsp;</td>סט מפסק עכבר <td>Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Carfil איכות</td><td>180000056</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT</td><td></td> <td>ספוגים</td><td></td></tr> <tr><td>לא ארוגים&nbsp;</td><td>Kompressen</td><td>866110</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין (1 מ"ג / מ"ל)&nbsp;</td><td>C.C.Pro</td><td>Z-13-M</td><td></td></tr><tr><td>צינור הארכת זלוף (30 ס"מ)</td><td>בראון</td><td>4256000</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>P-70</td><td></td></tr><tr><td>פטרי Dishc 100x15 מ"מ</td><td>VWR&reg;</td><td>391-0578</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (תרסיס וטרינר-ספט)</td><td>Livisto</td><td>799-416</td><td></td></tr><tr><td>סימולטור מתמר לחץ</td><td>UTAH מוצרים רפואיים</td><td>650-950</td><td></td></tr><tr><td>מתמרי לחץ דם לשימוש חוזר</td><td>מכשירי AD</td><td>MLT-0380/D</td><td></td></tr><tr><td>S & מלקחיים קנולציה של כלי T</td><td>מכשירי מדע עדינים</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>מוליך כותנה קטן</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים ישרים 10 ס"מ&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לקשירת תפרים</td><td>מכשירי מדע עדינים</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 50 מ"ל פרפוסור מקורי</td><td>בראון</td><td>8728810F-06</td><td></td></tr><tr><td>UT - 03 צינורית</td><td>ייחודית רפואית, יפן</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיצים</td><td>מכשירי מדע עדינים</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח וטרינריים (500 מ"ל)</td><td>WDT</td><td>18X1807</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מעטפת מים&nbsp; 2 ליטר</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>73-3441</td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium (500 מ"ל)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

זילוח מכונת כבד normothermic ex vivo בעכבר

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

פרוטוקול זה מציג מערכת NEVLP אופטימלית ללא אריתרוציטים באמצעות כבדי עכבר. שימור Ex vivo של כבדי עכברים הושג על ידי שימוש בצינוריות וטכניקות מותאמות מציוד זילוח מסחרי קונבנציונלי. המערכת שימשה להערכת תוצאות השימור לאחר 12 שעות של זילוח. עכברי C57BL/6J שימשו כתורמי כבד, והכבדים הושתלו על ידי קנולציה של וריד הפורטל (PV) וצינור המרה (BD), ולאחר מכן שטיפת האיבר במי מלח חמים (37 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, הכבדים שהושתלו הועברו לתא הזילוח והיו נתונים לזילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית (NEVLP). דגימות פרפוזט כניסה ויציאה נאספו במרווחים של 3 שעות לצורך ניתוח פרפוזאט. עם השלמת הזלוף, דגימות כבד התקבלו לניתוח היסטולוגי, עם שלמות מורפולוגית שהוערכה באמצעות Suzuki-Score שונה באמצעות צביעת Hematoxylin-Eosin (HE). ניסויי האופטימיזציה הניבו את הממצאים הבאים: (1) עכברים במשקל של מעל 30 גרם נחשבו מתאימים יותר לניסוי בשל גודלו הגדול יותר של צינור המרה שלהם (BD). (2) צינורית פוליאוריתן 2 Fr (קוטר חיצוני = 0.66 מ"מ) התאימה יותר לקנולציה של הווריד הפורטלי (PV) בהשוואה לצינורית פוליפרופילן. זה יוחס לאחיזה המשופרת של חומר הפוליאוריתן, וכתוצאה מכך החלקת קטטר מופחתת במהלך המעבר מהגוף לתא האיבר. (3) עבור קנולציה של צינור המרה (BD), צינורית פוליאוריתן 1 Fr (קוטר חיצוני = 0.33 מ"מ) נמצאה יעילה יותר בהשוואה לצינורית פוליפרופילן UT - 03 (קוטר חיצוני = 0.30 מ"מ). בעזרת פרוטוקול אופטימלי זה, כבדי עכברים נשמרו בהצלחה למשך 12 שעות ללא השפעה משמעותית על המבנה ההיסטולוגי. צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) חשפה ארכיטקטורה מורפולוגית שמורה היטב של הכבד, המאופיינת בעיקר hepatocytes קיימא עם גרעינים גלויים בבירור התרחבות קלה של סינוסיואידים בכבד.

הקמת הליך כירורגי בסך הכל נוצלו 17 בעלי חיים לניסוי זה: 14 עכברים הועסקו לייעול תהליך רכישת האיברים, כולל קנולציה של הווריד הפורטלי (PV) וצינור המרה (BD), ואילו 3 עכברים שימשו לאימות ההליך (טבלה 1). התוצאות ההיסטולוגיות (איור 3) הושוו כדי להקל על זיהוי מצב הזלוף האופטימלי.
בחירת פרפוסטה מדיום תרבית הפטוציטים שהיה בשימוש בעבר נבחר למחקר זה10,11. מדיום...

מערכת זילוח כבד נורמותרמית ex vivo (NEVLP) נוצרה עבור כבדי עכברים. מערכת זו דורשת ניסיון במיקרו-כירורגיה אך מאפשרת תוצאות זילוח הניתנות לשחזור. היכולת להשתמש בכבדים של עכברים מאפשרת לחקור מסלולים מולקולריים לזיהוי תוספי פרבוסט חדשים ומאפשרת ביצוע ניסויים המתמקדים בתיקון איברים.

זילוח מכונת כבד Normothermic Ex Vivo בעכבר

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

זילוח מכונת כבד Normothermic ex-Vivo בעכבר. זילוח כבד מחומצן נורממי הוא אסטרטגיה מבטיחה להצלת איברים שוליים ולאחרונה הוצג בפרקטיקה הקלינית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הבסיסיים אינם מובנים היטב.יש צורך במודל עכברי כדי להמשיך לחקור את המסלולים המולקולריים, תוך ניצול בעלי חיים מהונדסים גנטית, כגון עכברים טרנסגניים, ולכן ממתינים להקמת מערכת זילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית עבור כבדי עכברים. הנה תוכנית של כל המערכת שלנו. ראשית, המערכת כולה נשלטת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על ידי בקר תרמוסטטי באמצעות זרימת מים.הפרפוזט נשאב מהמאגר על ידי משאבה פריסטלטית לתוך מחמצן. יש זרימת גז רצופה של 95% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני במחמצן. לאחר מכן הפרבוסט עובר דרך מלכודת בועות.הפרבוסט עם בועות האוויר נשאב חזרה למאגר בלחץ. הפרפוזט הנותר זורם לתא האיבר שבו הצינור מחובר לווריד הפורטל. הפרפוזט מנוקז מהכבד דרך הקאווה העל-כבדית לתוך תא האיברים.זרימת הפרפוזט מתא האיברים מופנית חזרה למאגר על ידי המשאבה הפריסטלטית. צינור ניקוז מרה מחובר לתא האיברים כדי לאסוף מרה. זהו שולחן הניתוחים שלנו.כל הניתוחים נעשים תחת מיקרוסקופ. אנו שומרים על תנאי ניתוח סטריליים למחצה לאורך כל ההליך הכירורגי. החזיקו את צינורית הצינור הצרפתית במלקחיים.חודרים את דופן הצינורית עם מחט 30G במרחק של סנטימטר אחד מקצה הצינורית. דוחפים את המחט דרך הצינורית עד שקצה המחט הופך גלוי. הנה תמונת השוואה של קטטר 26G וצינורית מתוצרת עצמית; שניהם מתאימים לקנולציה של פורטל עכבר.מכינים 25 מיליליטר של מלוחים heparinized עם ריכוז סופי של 2, 500 יחידות בינלאומיות למיליליטר, ומניחים מזרק באינקובטור להגדיר על 40 מעלות צלזיוס. להלן המרכיבים העיקריים של מערכת זילוח המכונה הנורמותרמית ex-vivo. הרכיבים כוללים בעיקר את תא האיבר, המכונה התרמוסטטית, משאבת הרולר, המחמצן והמאגר.כאן, אתה יכול לראות הגדרה מפורטת של תא האיברים שלנו. בעיקרון, הוא מורכב מגוף תא איברים, חיישן לחץ, מחליף חום ומלכודת בועות. הקמנו מפרצון פרפוסט, שקע פרפוסט, ופתח ניקוז מרה.זוהי מערכת ניטור ADI בה אנו משתמשים כדי לנטר את לחץ הווריד הפורטלי. מערכת ADI מורכבת מחיישן לחץ, בקר מרכזי וצגים. הפעל את תוכנית LabChart לניטור לחץ.כיול ואפס נדרשים לפני כל שימוש בחיישן הלחץ. השתמש בכספית אפס מילימטר ובכספית 20 מ"מ כסימנים כדי לכייל את חיישן הלחץ עבור הכיול הדו-שלבי. בהתבסס על ניטור מתמיד של לחץ הפורטל, אנו יכולים להתאים את פלורן הפורטל בהתאם לשינויי לחץ.בנפחים שווים של פרפוסטט למאגר ולתא האיברים כדי להנהיג את המערכת, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשמירה על סטריליות במהלך תהליך המילוי. חבר תא אינדוקציה עם שקע בקיר. הפוך חמצן ל 0.5 ליטר לדקה.יש להפוך את האיזופלורן ל-3%מניחים את בעל החיים בתא עד לקבלת הרדמה עמוקה. השתמש מזרק מיקרו להחיל משקל הגוף מותאם מינון של שיכוך כאבים. הנה, שבעה מיקרוליטר של buprenorphine.כעת, אנו מתחילים את ניתוח הניתוח. בצע חתך רוחבי באזור הבטן של העכבר. חתך העור משתרע על קו בית השחי של הבשר הדו-צדדי משני הצדדים.בזהירות לבצע חתך אורכי לאורך linea alba. חותכים דרך שכבת שרירי הבטן עם electrocoagulation ומספריים. בזהירות מניחים חתיכת גזה רטובה כדי להגן על הכבד מפני electrocoagulation.לחשוף באופן מלא את חלל הבטן של העכבר. בזהירות להעביר את המעי הדק מתוך חלל הבטן עם צמר גפן רטוב כדי לחשוף באופן מלא את הילום. מוצג כאן תרשים סכמטי של קנולציה של ורידים פורטליים וקנולציה של צינור המרה.בעיקרון, אנו בוחרים את הצינורית המתאימה בהתאם לגודל העכבר, ואנו משתמשים בתפר משי 6-0 לקיבוע הצינורית. שחררו בזהירות את צינור המרה המשותף באמצעות מלקחיים מעוקלים עדינים ללא שיניים. צינור המרה המשותף ניזוק בקלות רבה ונשבר.ברגע שהוא נשבר, אי אפשר לקנן אותו. בשל כיוון המיקום האנטומי, מלקחיים מעוקלים קלים יותר לתפעול. הניחו שתי לולאות תפר משי 6-0 מעל צינור המרה המשותף כהכנה לשלב הבא.בזהירות לנקב את צינור המרה עם מחט 30G. השתמש במלקחיים מעוקלים מחודדים כדי להגדיל את החורים הקטנים, כך שהוא יוכל להזין את קנולציית צינור המרה. השתמש במלקחיים של כלי דם על פני צינורית צינורית צינור המרה ודחוף אותה לתוך צינור המרה. הערה.ברגע הקנולציה, תרגישו את ההתנגדות שמביאה המרה. אם הכוח אינו נשלט היטב, הצינורית תידחף החוצה מדרכי המרה על ידי הלחץ של זרימת המרה. בזהירות להתאים את עומק הצינורית.אם הוא עמוק מדי, הוא עלול לפגוע בצינור המרה, ואם הוא לא עמוק מספיק, הוא עלול להחליק החוצה. ניתן לראות זרימת מרה בצינורית לאחר קנולציה מוצלחת. מהדקים את וריד הפורטל במלקחיים שטוחים ומשחררים בזהירות את רקמת החיבור במלקחיים מעוקלים.אל תמשוך חזק כאן, כדי לא לגרום לקריעה של וריד הפורטל. ברגע שווריד הפורטל ניזוק, קשה לשחזר את וריד הפורטל. מניחים שני תפרי משי 6-0 לולאה מעל וריד השער החופשי.השתמש אטב עורקי כדי לסגור את הווריד הפורטלי הדיסטלי. בזהירות רבה לנקב את וריד הפורטל עם אחד הצינורית וריד הפורטל לעיל. זרימת הדם ניתן לראות בבירור בתוך הצינורית לאחר ניקוב מוצלח.קח תמיסת מלח הפרין שחוממה מראש מאינקובטור. הסירו את כל בועות האוויר. תקן מזרק עם מלוחים heparinized שחומם מראש לתוך משאבת מזרק.חבר את צינור ההרחבה של משאבת המזרק לצינורית של וריד הפורטל. התאם את המהירות לשני מיליליטר לדקה והתחל את שטיפת הכבד. להגדיל isoflurane ל 5% ו המתת חסד העכבר עם מנת יתר isoflurane אינהלציה.שימו לב לצבע הכבד בסוף הליך השטיפה. הבלו על הכבד ברגע שהצבע הפך לצהוב הומוגני. בזהירות להעביר את הכבד לתוך חדר האיברים באמצעות צלחת פטרי.שמור כמות קטנה של מלוחים בצלחת פטרי כדי למנוע כבד מלהיות מרוסק. הערה. ניתן בקלות לסובב את הווריד הפורטלי ואת צינור המרה במהלך הליך זה, מה שעלול להשפיע על זילוח הכבד ואיסוף המרה. להחדיר לאט מלח רגיל לתוך צינורית וריד הפורטל עם מזרק כדי לפנות את בועות האוויר בצינורית.חבר את צינורית הווריד הפורטלי לצינור זרימת הפרפוזט בתא האיבר. צינורית צינורית צינור המרה של העכבר מונחית דרך שסתום של חדר האיברים, אשר סגור עם כובע גומי. לאחר מכן, צינור המרה מוכנס לתוך צינור מיקרו מוכן מראש 0.5 מיליליטר עם חור קטן להוביל.לאחר שהכל מחובר, הפעל את המשאבה הפריסטלטית. בדוק את קריאת לחץ ורידי הפורטל כדי להתאים את קצב הזרימה. שמור על לחץ הווריד הפורטלי בין שבעה ל -10 מילימטר כספית על ידי התאמת קצב הזרימה. הערה.קצב זרימה נומינלי יכול להשתנות מעט בהתאם לגיל ולמיקום הצינורות. זוהי הבחירה של מדיום פרפוסט, נפח פרבוסט ולחץ זילוח בהתבסס על מחקר ספרותי של מחקרי זילוח מכונת כבד של חולדה מחומצנת נורמותרמית. זהו ניסוי שלב אחר שלב כדי לבסס את מודל זילוח העכבר.נדרשו כ-14 ניסויים כדי לבחור את הצנתרים המתאימים ביותר. בידינו, שימוש בשני צנתרי גומי צרפתיים לווריד הפורטלי, יחד עם קטטר גומי צרפתי אחד לצינור המרה, הוא השילוב הטוב ביותר להשגת זילוח הומוגני כאשר כל הצנתרים במקום. רמת החומציות ורמת האשלגן היו יציבות לאורך כל 12 שעות הזילוח.רמת החומציות נעה בין 7.26 ל-7.71, ורמת האשלגן נעה בין 5.9 ל-6.8 מילימול לליטר. צביעת HE מראה כי לאחר 12 שעות זילוח, שלמות ההיסטולוגיה של כבד העכבר נשמרה טוב יחסית. יחד, הדגמנו כאן את הקמתה המוצלחת של מערכת זילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית עבור כבד העכבר.זילוח של כבד עכבר במשך 12 שעות הביא לשימור טוב של המורפולוגיה של הכבד, אם כי לא לאורך כל האיבר. נדרש מאמץ נוסף כדי להשיג זילוח הומוגני מלא על פני תקופה ארוכה יותר של זמן. ברגע שזה מושג, ניתן לשקול שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטית, כגון השימוש בעכברי IL-2-knockout כדי לחקור את תפקיד הדלקת.

normothermic-ex-vivo-liver-machine-perfusion-in-mouse

Research

JoVE Journal

Engineering

הנדסה

שתלי שוליים, כגון כבד שומני, שתלי מתורמים מבוגרים, או כבדים הוחזרו לאחר מוות לבבי (DCD) לסבול אחסון קונבנציונלי, קר סטטי רק בצורה גרועה. פיתחנו מודל חדשני של vivo לשעבר זלוף כבד subnormothermic לשימור, הערכה, ותיקון של שתלי כבד שוליים לפני ההשתלה.

טכניקה של Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הכבד זלוף לאחסון, ההערכה, ותיקון שתלי כבד שולי

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר זלוף מחומצן במכונה מחוץ למקום של שתלי כבד מתורם. מאמר זה מכיל פרוטוקול שלב אחר שלב לרכישה והכנת שתל הכבד לזלוף מכונה, הכנת נוזל הזלוף, הפעלת מכונת הזלוף וביצוע זלוף מכונה נורמותרמית מחומצנת של שתל הכבד.

באתרו לשעבר Normothermic מכונת זלוף של כבדים תורמים

אנו מתארים שיטה של זלוף המכונה vivo לשעבר של שתלי כבד אנושיים בטמפרטורת subnormothermic (21 מעלות צלזיוס).

אדם תפקודי כבד שימור ושחזור על ידי אמצעי Subnormothermic מכונת זלוף

שיש מחסור משמעותי לתורם כבד, הקריטריונים עבור התורמים הכבד שהורחבו. Normothermic ex-vivo הכבד זלוף (NEVLP) פותחה כדי להעריך ולשנות את תפקוד האיבר. מחקר זה מדגים מודל עכברוש של NEVLP, בדיקות היכולת של pegylated-קטלאז, להקל על פגיעה בכבד שימור.

מודל בעלי חיים קטנים של זלוף הכבד Normothermic Vivo לשעבר

זלוף הלב באתרו לשעבר normothermic (ESHP), שומר על הלב במצב הכאה, הפיזיולוגיות למחצה. כאשר מבוצעת במצב עבודה, ESHP מספק ההזדמנות כדי לבצע הערכות מתוחכמות של התורם הכדאיות איברים ותפקוד הלב. כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו עבור הערכת ביצועים שריר הלב במהלך ESHP.

Normothermic לשעבר זלוף באתרו הלב בעבודה מצב: הערכה של תפקוד הלב ואת חילוף החומרים

פרוטוקול מתואר על הפרזיה באתרו של גוף העכבר התחתון, כולל שלפוחית השתן, הערמונית, איברי מין, עצם, שרירים ועור כף הרגל.

הקמת מעגל באתרו של איברי הבטן התחתונה וגפיים האחוריות בעכברים

הפרוטוקול מתאר שיטה פשוטה לכריתת כבד עכבר שלם למחקרים מטבוליים באמצעות זלוף ורידים פורטלי.

אקס ויוו זלוף כבד דרך וריד הפורטל בעכבר

המודל החזירי של זלוף מכונה נורמותרמית בכבד (NMP), המתואר כאן, יכול לשמש בהצלחה לחקר NMP כאסטרטגיית שימור, כלי להערכת כדאיות ופלטפורמה לתיקון איברים. הוא בעל ערך תרגומי גבוה, אולם הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש עבודה רבה.

חזיר נורמתרמי מבודד כבד פרפוזיה

כאן, אנו מציגים שיטה חזקה עבור זילוח באתרו של כבד העכבר כדי ללמוד את הרגולציה החריפה והישירה של חילוף החומרים בכבד מבלי להפריע לארכיטקטורה הכבדית אלא בהיעדר גורמים מחוץ לכבד.

ייצור גלוקוז בכבד, אורגנזה וליפוליזה מכומתים באמצעות מודל הכבד של עכבר מחורר

פינוי אינסולין בכבד הוא קריטי לוויסות הומאוסטזיס של גלוקוז. מאמר זה מתאר הליך זלוף כבד ידידותי למשתמש להערכה ישירה של קצב פינוי האינסולין בכבד באתרו בעכברים.

הערכת פינוי אינסולין בעכברים באמצעות זלוף כבד באתרו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת זלוף נורמותרמית ex vivo בקוד פתוח הניתנת לשינוי שנועדה להתגבר על העלות הגבוהה והגמישות המוגבלת של פלטפורמות קיימות, ולאפשר שימוש נגיש יותר, חסכוני ואיטרטיבי במחקר ביו-רפואי פרה-קליני.

מערכת זילוף נורמתרמית בקוד פתוח המיועדת למדעני מחקר

למדו את שיטת זילוח מכונת כבד נורמותרמי אקס ויו בעכברים לחקר מסלולים מולקולריים וזיהוי תוספי פרפוזט חדשניים. מערכת זו מאפשרת שימור איברים שוליים ומחקר מנגנוני ביולוגיה מולקולרית.

זילוח מכונת כבד Normothermic Ex Vivo בעכבר

גלה סרטונים נוספים