Name: Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למד שיטת שינוי גנטי באמצעות Agrobacterium tumefaciens להשתלת גנים בגנום הגרעיני של המיקרו-אצה Chlorella vulgaris. פרוטוקול זה מאפשר ייצור טרנספורמנטים יציבים למחקר פונקציונלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לפרופ' פול הויקאס על שסיפק באדיבותו את וקטור pCAMBIA1302 ואת Agrobacterium tumefaciens AGL1 מהמכון לביולוגיה בליידן, אוניברסיטת ליידן, הולנד. המחברים רוצים גם להודות לאווה קוליק על עזרתה בגידול טרנספורמטורים פלואורסצנטיים. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה ותוכנית Mitacs Accelerate.

כל המדיה והפתרונות חייבים להיות אוטומטיים לפני השימוש, אלא אם צוין אחרת. כל צינורות הצנטריפוגות, קצוות פיפטה וכו ', צריכים להיות סטריליים או autoclaved לפני השימוש. לעיון קל, מתכוני המדיה המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1.
1. הכנת תאים אלקטרוכשירים של A. tumefaciens 
<ol><li>יש לחסן את אגרובקטריום (AGL-1) לתוך בקבוק שייקר סטרילי בנפח 25 מ"ל של חומר LB (בתוספת ריפמפיצין, 20 מ"ג/L-1) ממלאי גליצרול קפוא ולגדול בן לילה ב-28-30 מעלות צלזיוס וב-150 סל"ד. הערה: זן אגרובקטריום AGL-1 עמיד (ראה טבלת חומרים) בפני ריפמפיצין, אמפיצילין, כלוראמפניקול וסטרפטומיצין וניתן להשיג אותו ממספר ספקים.</li>
	<li>למחרת, לדלל את התרבית פי 1,00,000 על ידי הוספת 0.5 μL של תרבית הלילה ל 50 מ"ל מים טהורים במיוחד autoclaved ולהפיץ 10 μL של תרבית מדוללת זו על צלחת LB, ולאחר מכן לדגור ב 28-30 ° C במשך 1-3 ימים.</li>
	<li>בחר מושבה והתחל תרבית לילה של 20 מ"ל ב- LB עם ריפמפיצין ב 28-30 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>למחרת, לחסן 500 מ"ל LB מדיה (ללא אנטיביוטיקה) בבקבוק שייקר עם 9 מ"ל של תרבית לילה ולגדול ב 28-30 ° C עד OD600 מגיע 0.5.</li>
	<li>מחלקים את התרבית באופן שווה לעשרה צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל וצוננים על קרח במשך 30 דקות. מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4°C.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 4 ° C ו 4000 x גרם במשך 15 דקות. לאחר מכן, להסיר כמה supernatant ככל האפשר באמצעות פיפטה להשעות מחדש את הגלולה בכל צינור ב 50 מ"ל של מים קרים כקרח.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 4 ° C ו 4000 x גרם במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 25 מ"ל של מים קרים כקרח בכל צינור.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 4 ° C ו 4000 x גרם במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של קר כקרח 10% (w/v) גליצרול בכל צינור.</li>
	<li>שלב את כל הצינורות לתוך צינור אחד 50 מ"ל וצנטריפוגה את התאים ב 4 ° C ו 4000 x g במשך 15 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 400 μL קר כקרח 10% (w/v) גליצרול. ריכוז התא צריך להיות בערך 1-3 x10 10 תאים / מ"ל.</li>
	<li>להפיץ את התאים כמו 50 μL aliquots ב microtubes precooled סטרילי. יש להקפיא בחנקן נוזלי ולאחסן במקפיא בטמפרטורה של -80°C.</li>
</ol>2. אלקטרופורציה של A. tumefaciens
<ol><li>הוסף 50 μL של תאים אלקטרוכשירים AGL-1 A. tumefaciens לקובט 0.1 מ"מ מקורר מראש והוסף 2 μL של pCAMBIA1302 או פלסמיד דומה (conc 15 ng/μL) (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>אלקטרופורטים ב 2400 V באמצעות אלקטרופורטור (200 Ω, מאריך קיבוליות 250 μFD, קיבוליות 25 μFD, דעיכה מעריכית, ראה טבלת חומרים). קבוע הזמן צריך להיות >4.5 אלפיות השנייה עבור אלקטרופורציה מוצלחת עם דעיכה מעריכית.</li>
	<li>מיד להוסיף 1 מ"ל של מדיה LB לקובט ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב. להעביר את 1 מ"ל של תאים מרחפים לתוך microtube 1.5 מ"ל לדגור אותו ב 28-30 ° C לפחות 1 שעה כדי להתאושש.</li>
	<li>צלחת את התאים על אגר LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (כלומר, 50 מ"ג / ליטר של kanamycin עבור pCAMBIA1302 עבור בחירה פרוקריוטית).</li>
	<li>לדגור ב 28-30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.</li>
	<li>בחר מושבה אחת, גדל לילה ב- LB עם הבחירה המתאימה (50 מ"ג / ליטר קנמיצין עבור pCAMBIA1302), ושמור בהקפאה את הזן המכיל פלסמיד באמצעות 50% גליצרול ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.</li>
</ol>3. AMT של C. vulgaris
הערה: הכינו תרביות C. vulgaris (UTEX 395, ראו טבלת חומרים) ו-A. tumefaciens במקביל לטיפוח משותף. C. vulgaris cultures יש להתחיל 3 ימים לפני הכנת תרביות A. tumefaciens. הפרוטוקול שונה בהתבסס על זה שפורסם על ידי Kumar et al.7.
<ol><li>הכנת תרבות C. vulgaris <ol><li>C. vulgaris מאוחסן באופן מסורתי על סלנטים או נשמר בתרביות לוג-פאזה בתנאים מוארים. מתרבית שלב יומן ב- OD600 = 1.0, יש למרוח 0.5 מ"ל על לוחות אגר Tris-אצטט-פוספט (TAP, ראה טבלה 1) ( 1.2% w / v אגר A) ולגדול במשך 5 ימים ב 25 ° C עם תאורה (50 μE / m2שניות). זה יניב בערך 5 x 106 תאים.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תרבית A. tumefaciens <ol><li>יש לגדל את זן A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 בבקבוק שייקר על ידי חיסון 10 מ"ל של חומר LB בתוספת גלוקוז של 15 mM, 20 mg/L rifampicin ו-50 mg/L kanamycin (ראה טבלת חומרים) באמצעות מלאי גליצרול. יש לדגור ב-28-30 מעלות צלזיוס וב-250 סל"ד למשך הלילה.</li>
		<li>יש לחסן 1 מ"ל של תרבית לילה לתוך 50 מ"ל של LB עם 15 מ"מ גלוקוז, 20 מ"ג / ליטר ריפמפיצין, ו 50 מ"ג / ליטר קנמיצין ולדגור ב 28-30 ° C ו 250 סל"ד עד OD600 מגיע 1.0.</li>
	</ol></li>
	<li>Coלטפח C. vulgaris ו A. tumefaciens
	<ol><li>כדי להכין את תרבית A. tumefaciens לגידול משותף, להעביר את התרבות הגדלה לצינור 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ושוטפים את התאים פעמיים עם מדיום האינדוקציה. הערה: מדיית האינדוקציה המשמשת היא מדיית TAP המותאמת ל- pH 5.5 ומשלימה מתכות קורט בינוניות F/2 וויטמינים עם אצטוסירינגון של 200 מיקרומטר (AS, ראה טבלת חומרים). השעה מחדש את התאים במדיית אינדוקציה כך ש- OD600 = 0.5.</li>
		<li>כדי להכין את תרבית C. vulgaris לגידול משותף, הוסף 25 מ"ל של מדיה אינדוקציה לצלחת C. vulgaris המכילה ~ 5 x 106 תאים. מעבירים לצינור 50 מ"ל. צנטריפוגו את התאים ב 4000 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.</li>
		<li>מערבבים את גלולת תא האצות עם 200 μL של תרחיף החיידקים (OD600: 0.5) ודגרים אותם בשייקר סיבובי ב 21-25 ° C ב 150 סל"ד במשך 1 שעה.</li>
		<li>יש לפזר את התרבית המעורבת (200 μL) על צלחות מדיה אינדוקציה בתוספת גלוקוז של 15 מ"מ ולדגור בטמפרטורה של 21-25 מעלות צלזיוס בחושך למשך 3 ימים.</li>
		<li>לאחר 3 ימים, יש להשתמש ב-10 מ"ל של מדיית TAP בתוספת 400 מ"ג/ליטר cefotaxime או 20 מ"ג/ליטר טטרציקלין (ראה טבלת חומרים) כדי לאסוף את המיקרו-אצות ולדגור בחושך בטמפרטורה של 21-25 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי לסלק את A. tumefaciens מהתרבית.</li>
		<li>צלחת 500 μL של התרבית על מדיה סלקטיבית, למשל, מדיה TAP בתוספת 20-70 מ"ג / ליטר של Hygromycin B (בעת שימוש pCAMBIA1302) ו 400 מ"ג / L-1 cefotaxime או 20 מ"ג / ליטר של טטרציקלין. לדגור 21-25 מעלות צלזיוס בחושך במשך 2 ימים לפני הצבתם בתא מואר. הערה: מושבות עמידות יופיעו 5-7 ימים לאחר החשיפה לאור.</li>
		<li>בחר מושבות בודדות מצלחת הטרנספורמציה ופזר אותן מחדש על צלחות אגר TAP בתוספת 400 מ"ג / ליטר של cefotaxime או 20 מ"ג / ליטר של טטרציקלין ו 20-70 מ"ג / ליטר של היגרומיצין B.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PCR מושבה (cPCR) כדי לאשר שילוב גנים טרנספורמנטים C. vulgaris 
<ol><li>חילוץ DNA גנומי מטרנספורמנט C. vulgaris לאחר תרבית משנה לפחות פעמיים ממושבה אחת באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומי של צמחים (ראה טבלת חומרים). באמצעות זה כתבנית עבור PCR, לעצב פריימרים עבור אזור mgfp5 של T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', ו M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').<ol><li>באמצעות ערכת תערובת מאסטר Q5 של DNA פולימראז באיכות גבוהה (ראה טבלת חומרים), בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לאמת אינטגרציה טרנסגנית. הערה: התנאים הבאים שימשו במחקר הנוכחי: 98 ° C למשך 3 דקות; 35 מחזורים (98°C למשך 10 שניות, 57°C למשך 30 שניות, 72°C למשך דקה אחת); 72°C למשך 5 דקות. השתמש ב- pCAMBIA1302 כבקרה חיובית וב- DNA גנומי מסוג פראי C. vulgaris כבקרה שלילית.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי לאשר כי אין pCAMBIA1302 נוכח במדגם עקב זיהום שיורי על ידי A. tumefaciens, להשתמש PCR מושבה. הוסיפו כמות קטנה של תאי טרנספורמציה ל-10 מיקרוליטר מים סטריליים והרתיחו ב-98°C למשך 15 דקות. השתמש באפשרות זו כתבנית עבור PCR.<ol><li>עיצוב פריימרים לאזור מחוץ ל-T-DNA ב-pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTT 3' ו-B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTTTC 3'). הערה: התנאים הבאים שימשו במחקר הנוכחי: 94 ° C במשך 3 דקות; 30 מחזורים (94°C למשך 30 שניות, 48°C למשך 30 שניות, 68°C למשך 5 דקות); 68°C למשך 7 דקות. השתמש במושבה מבושלת של A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) כבקרה חיובית ומושבה מבושלת של בר מסוג C. vulgaris כבקרה שלילית.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי לאשר כי אין זיהום A. tumerfaciens נוכח המדגם, להשתמש PCR מושבה. הוסיפו כמות קטנה של תאי טרנספורמציה ל-10 מיקרוליטר מים סטריליים והרתיחו ב-98°C למשך 15 דקות. השתמש באפשרות זו כתבנית עבור PCR.<ol><li>תכנון פריימרים לגן virE2 הכלול בפלסמיד האלים AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' ו-virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3'). הערה: התנאים הבאים שימשו במחקר הנוכחי: 94 ° C במשך 3 דקות; 30 מחזורים (94°C למשך 30 שניות, 53°C למשך 30 שניות, 68°C למשך 3 דקות); 68°C למשך 7 דקות. השתמש במושבה מבושלת של A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) כבקרה חיובית ומושבה מבושלת של בר מסוג C. vulgaris כבקרה שלילית.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעל דגימות PCR על ג'ל אגרוז DNA יחד עם סולם (סולם DNA 1 Kbp, ראה רשימת חומרים) כדי לאשר את גודל המקטעים המתקבלים16.</li>
</ol>5. מדידת הפלואורסצנטיות של טרנספורמציות
<ol><li>חסן כל טרנספורמטור מתרבית תחזוקה בשלב היומן או שיפוע אגר TAP ל- 50 מ"ל של TAP בתוספת 200 מ"ג / L-1 cefotaxime ו- 25 מ"ג / L-1 היגרומיצין B כך שה- ODההתחלתי 600 = 0.1. חסן תרבית אחת עם סוג פראי C. vulgaris ורק 200 מ"ג / L-1 cefotaxime כמו הביקורת השלילית. דגירה ב-25°C ב-150 סל"ד עם 150 μmol/m2שניות של אור פעיל פוטוסינתטי (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>כל 24 שעות, לקחת דגימה של 300 מיקרוליטר ולמדוד את הספיגה והפלואורסצנטיות (עירור 488 ננומטר, פליטה 526 ננומטר) בקורא לוחות 96 בארות או ספקטרומטר UV/Vis ופלואורומטר (ראה טבלת חומרים). השתמש בלוח שחור עם תחתית שקופה למדידות בו-זמנית.</li>
</ol>6. מיצוי חלבון גולמי, טיהור חלבונים ואלקטרופורזה SDS-PAGE
<ol><li>חסן טרנספורמנט (#50) מתרבית תחזוקה בשלב היומן לתוך 300 מ"ל של TAP בתוספת 200 מ"ג / L-1 cefotaxime ו 25 מ"ג / L-1 Hygromycin B כדי להגיע OD680 = 0.1. חסן תרבית אחת עם סוג פראי C. vulgaris ורק 200 מ"ג / L-1 cefotaxime כמו הביקורת השלילית. דגירה ב-25°C ב-150 סל"ד עם 150 μmol/m,2שניות של אור פעיל פוטוסינתטי.</li>
	<li>חלצו את דגימת החלבון הגולמי מזני הטרנספורמנט (#50) והפרא באמצעות חיץ ליזה של 5 מ"ל (ראו טבלה 1), ולאחר מכן סוניקציה למשך 4 דקות.</li>
	<li>יש לטהר דגימת חלבון גולמי עם שרף Ni-NTA דרך עמודי פוליפרופילן בנפח 5 מ"ל (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>Lyophilize דגימות חלבון מטוהר 15 מ"ל להשעות אותם מחדש 1 מ"ל חיץ ליזה עבור ניתוח SDS-PAGE17.</li>
</ol>

שילוב גנים יציב בכלורלה וולגריס באמצעות Agrobacterium tumefaciens

<ol><li>Smith, E. F., Townsend, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+tumor+of+bacterial+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A plant tumor of bacterial origin.</a> Science. 25 (643), 671-673 (1907).</li>
<li>Chilton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+incorporation+of+plasmid+DNA+into+higher+plant+cells%3A+The+molecular+basis+of+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis.</a> Cell. 11 (2), 263-271 (1977).</li>
<li>De Cleene, M., De Ley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+range+of+crown+gall%5BTitle%5D)+AND+%22The+Botanical+Review%22%5BJournal%5D)">The host range of crown gall.</a> The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).</li>
<li>Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+and+plant+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium and plant genetic engineering.</a> Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).</li>
<li>Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+T-DNA+transfer+from+Agrobacterium+tumefaciens+to+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Molecular+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae.</a> The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).</li>
<li>Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacteriumtumefaciens-mediated+transformation+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).</li>
<li>Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+the+green+alga-Chlamydomonas+reinhardtii+by+Agrobacteriumtumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).</li>
<li>de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacteriumtumefaciens-mediated+transformation+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).</li>
<li>Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small%2C+versatile+pPZP+family+of+Agrobacterium+binary+vectors+for+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).</li>
<li>Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+new+generation+of+expression+toolkits+for+engineering+of+green+microalgae%3B+robust+production+of+human+interleukin-2%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2.</a> BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).</li>
<li>Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+production+of+a+functional+SARS-CoV-2+spike+receptor+binding+domain+in+the+green+algae+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii.</a> PLoS One. 16, e0257089(2021).</li>
<li>Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+anti-lipopolysaccharide+factor+isoform+3+in+Chlamydomonas+reinhardtii+showing+high+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity.</a> Marine Drugs. 19 (5), 239(2021).</li>
<li>Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydomonas+reinhardtii-expressed+multimer+of+ToAMP4+inhibits+the+growth+of+bacteria+of+both+Gram-positive+and+Gram-negative%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative.</a> Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).</li>
<li>Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promising+future+of+microalgae%3A+current+status%2C+challenges%2C+and+optimization+of+a+sustainable+and+renewable+industry+for+biofuels%2C+feed%2C+and+other+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products.</a> Microbial Cell Factories. 17, 36(2018).</li>
<li>Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+factors+affecting+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+the+unicellular+green+alga%2C+Chlorella+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+Guide+to+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+and+Detection.+Bulletin+6040%2C+Rev+C%22">A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C</a>. , Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed March (2023).</li>
<li>NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. , New England Biolabs Inc. Accessed March
 <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol">https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol</a> (2023).</li>
<li>Ward, V. C. A., Rehmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+media+optimization+for+mixotrophic+cultivation+of+Chlorella+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris.</a> Scientific Reports. 9, 19262(2019).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorton%2C+ER+%22Current+Protocols+in+Microbiology.+Chapter+1%3A+Unit+3D.1%22">Current Protocols in Microbiology. Chapter 1: Unit 3D.1</a>. , (2012).</li>
<li>Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+of+strawberry+cv.+Camarosa+by+a+dual+plasmid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system.</a> Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).</li>
<li>Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+use+and+abuse%3A+a+threat+to+mitochondria+and+chloroplasts+with+impact+on+research%2C+health%2C+and+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment.</a> Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+DNA+repair+and+Agrobacterium+T-DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458(2021).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

יעילות הטרנספורמציה קשורה למספר פרמטרים שונים. הבחירה בזני A. tumefaciens המשמשים ל- AMT היא קריטית. AGL-1 הוא אחד הזנים הפולשים ביותר שהתגלו, ומסיבה זו נעשה בו שימוש שגרתי ב-AMT צמחי. תוספת של גלוקוז (15-20 מילימול) חשובה גם היא ליעילות AMT. בהתחשב בכך ש-C. vulgaris יכול לגדול הן בתנאים פוטוטרופיים והן בתנאים הטרוטרופיים, גלוקוז או מקורות פחמן אחרים מושמטים לעתים קרובות ממדיה מיקרו-אצות כדי למנוע זיהום. לדוגמה, המדיום הבסיסי של בולד (BBM) הוא המדיה הנפוצה ביותר לטיפוח פוטוטרופי של C. vulgaris<...

Agrobacterium tumefaciens, חיידק גראם-שלילי הנישא בקרקע, הוא בעל יכולת העברת גנים בין-מלכותית ייחודית, מה שזיכה אותו בתואר "מהנדס גנטי טבעי"1. חיידק זה יכול להעביר DNA (T-DNA) מפלסמיד הגורם לגידול (Ti-Plasmid) לתאים מארחים באמצעות מערכת הפרשת סוג IV, וכתוצאה מכך אינטגרציה וביטוי של T-DNA בתוך הגנום המארח 1,2,3,4. בסביבה הטבעית, תהליך זה מוביל להיווצרות גידולים בצמחים, הידוע בכינויו מחלת כיס המרה. עם זאת, אגרובקטריום יכול גם להעביר T-DNA לאורגניזמים שונים אחרים, כולל שמרים, פטריות, אצות, עוברים של קיפודי ים, ואפילו תאים אנושיים בתנאי מעבדה 5,6,7,8.
תוך ניצול מערכת טבעית זו, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) מאפשר שילוב אקראי של גנים מעניינים לתוך הגנום הגרעיני של התא המארח על ידי שינוי אזור T-DNA של Ti-plasmid. למטרה זו, וקטור ביטוי צמח AMT בשימוש נרחב הוא pCAMBIA13029. חוקרים יכולים להשתמש בתהליכי שיבוט פשוטים ב- E. coli לפני העברת הווקטור הרצוי ל- A. tumefaciens לצורך העברה לאחר מכן למארח העניין.
מיקרו-אצות ירוקות הן איקריוטים שחולקים קווי דמיון רבים עם צמחי יבשה, אך הם עקשנים מאוד לשינוי גנטי. עם זאת, טרנספורמציה גנטית ממלאת תפקיד מכריע במחקר בסיסי וביוטכנולוגי של מיקרו-אצות. בכמה מיני מיקרו-אצות, במיוחד Chlamydomonas reinhardtii, טרנספורמציה גנטית באמצעות AMT החדירה בהצלחה טרנסגנים כגון אינטרלוקין-2 אנושי (hIL-2), תחום קשירת קולטן קורונה 2 (SARS-CoV-2 RBD), ושני פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs)10,11,12,13. בין אלה, Chlorella vulgaris, מין אצות ירוקות פחות קפדני וגדל במהירות, טומן בחובו פוטנציאל משמעותי לייצור בר-קיימא של פחמימות, חלבונים, חומרים מזינים, פיגמנטים ותרכובות אחרות בעלות ערך גבוה14. עם זאת, היעדר כלים אמינים ליצירת זנים טרנסגניים של C. vulgaris מעכב את התקדמותה המסחרית. מאחר שפורסמו רק מספר מוגבל של עבודות המשתמשות ב-AMT ב-C. vulgaris15, ובהתחשב בהבדלים הניכרים בין גידול צמחים למיקרו-אצות, אופטימיזציה של פרוטוקול AMT הופכת חיונית.
במחקר זה, החוקרים הכניסו חלבון פלואורסצנטי ירוק (mGFP5) במורד הזרם של מקדם וירוס פסיפס הכרובית (CamV) 35S והוסיפו תג היסטידין כדי להשתמש בו כגן כתב לביטוי חלבונים. טרנספורמטורים נבחרו באמצעות היגרומיצין B, ולאחר תרבית משנה במשך למעלה מעשרים דורות, השינוי נשאר יציב. פלסמיד pCAMBIA1302 המשמש בעבודה זו יכול להיות מותאם בקלות להכיל כל גן מעניין. יתר על כן, ניתן להתאים את השיטה והחומרים המוצגים למיני אצות ירוקות אחרות עם מקדם CamV35S פעיל, מכיוון שמקדם זה משמש לבחירת היגרומיצין.

<table><tbody><tr><td>סולם DNA 1 Kb Plus</td><td>FroggaBio</td><td>DM015</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Fisher Scientific</td><td>D26665G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens</td><td>Gold</td><td>Biotechnologies Strain: AGL-1; מתנה מפרופ' פול הויקאס</td><td>גנוטיפ: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA</td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>אנזו מדעי החיים</td><td>89151-400</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>VWR</td><td>BDH9224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime</td><td>AK Scientific</td><td>J90010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorella vulgaris</td><td>אוניברסיטת טקסס באוסטין אוסף תרבות של זן אצות</td><td>: UTEX 395</td><td>זן Wildtype</td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C8661-25G</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>EMD Millipore</td><td>CX2185-1</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O</td><td>VWR</td><td>BDH9234-500G</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>1652662 יחידה ראשית המצוידת במודול PC.</td></tr><tr><td>ערכת טיהור גנום צמחי GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0791</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>VWR</td><td>CABDH3093-2.2P</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>BioBasic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>מאגר HEPES</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6068103</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gold Biotechnologies</td><td>K-250-25</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>JT Baker</td><td>BAKR2540-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>VWR</td><td>BDH7971-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA&middot; 2H2O</td><td>JT Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>JT Baker</td><td>BAKR3764-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>BDH7257-7</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>CA80058-650</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3&nbsp; </td><td>VWR</td><td>BDH4574-500G</td><td></td></tr><tr><td>NEBExpress Ni Resin</td><td>NewEngland BioLabs</td><td>NEB #S1427</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>VWR</td><td>BDH9208-500G</td><td></td></tr><tr><td>pCAMBIA1302</td><td>מתנת אוניברסיטת ליידן</td><td>מפרופ' פול הויקאס</td><td>pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, מקדם CaMV 35S/mgpf5-6xhis/NOS טרמינטור)</td></tr><tr><td>עמודות פוליפרופילן (5 מ"ל)</td><td>QIAGEN</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>תקני חלבון לא מוכתם דיוק פלוס, רקומביננט מתויג סטרפטוקוק, 1 מ"ל</td><td>Bio-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Millipore Sigma</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>SunBlaster רצועת LED אור 48 אינץ'&nbsp;</td><td>ספקטרומטר SunBlaster</td><td>210000000906</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 4 Microplate UV/Vis&nbsp;</td><td>BioTEK</td><td>S4MLFPTA</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>CAAAJ61714-14</td><td></td></tr><tr><td>TGX ערכת אקרילאמיד ללא כתמים, 12%</td> <td>Bio-Rad</td><td>1610185</td><td></td></tr><tr><td>תיאמין</td><td>TCI America</td><td>T0181-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>BioBasic</td><td>TG217 (G211)</td><td></td></tr><tr><td>ויטמין B12 (ציאנוקובלמין)</td> <td>Enzo Life Sciences</td><td>89151-436</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7 ש'<תת>2</תת>O</td><td>ג'יי טי בייקר</td><td>4382-01</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) משמש ככלי נפוץ למניפולציה של גנומים צמחיים. עם זאת, A. tumefaciens מפגינים יכולת העברת גנים למגוון רחב של מינים. למיני מיקרו-אצות רבים חסרות שיטות מבוססות היטב לשילוב אמין של גנים מעניינים בגנום הגרעיני שלהם. כדי לרתום את היתרונות הפוטנציאליים של ביוטכנולוגיה מיקרו-אצות, כלים פשוטים ויעילים למניפולציה גנומית הם חיוניים. כאן, פרוטוקול AMT ממוטב מוצג עבור מיני מיקרו-אצות תעשייתיות Chlorella vulgaris, תוך שימוש בחלבון הפלואורסצנטי הירוק (mGFP5) ובסמן העמידות לאנטיביוטיקה עבור Hygromycin B. מוטנטים נבחרים באמצעות ציפוי על מדיה Tris-אצטט-פוספט (TAP) המכילה Hygromycin B ו cefotaxime. ביטוי של mGFP5 מכומת באמצעות פלואורסצנטיות לאחר יותר מעשרה דורות של תת-תרבית, מה שמצביע על השינוי היציב של קלטת T-DNA. פרוטוקול זה מאפשר ייצור אמין של מושבות C. vulgaris טרנסגניות מרובות תוך פחות משבועיים, תוך שימוש בווקטור ביטוי הצמחים pCAMBIA1302 הזמין מסחרית.

כדי להראות טרנספורמציה מוצלחת באמצעות השיטה לעיל, C. vulgaris עבר תרבית משותפת עם AGL-1 שהכיל את הפלסמיד pCAMBIA1302 או ללא הפלסמיד (מסוג פראי ומצופה על אגר TAP בתוספת Hygromycin B ו-cefotaxime (איור 1A). הלוח השמאלי ביותר מראה את המושבות שעברו טרנספורמציה המסוגלות לצמוח על לוחות היגרומיצין B/cefotaxime, והלוח האמצעי מראה כי AGL-1 מסוג פרא אינו יכול לגדול על לוחות Hygromycin B/cefotaxime. הצלחת הימנית ביותר מראה כי כאשר לא נעשה שימוש בסלקציה (cefotaxime בלבד), C. vulgaris t...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

היקף המחקר התמקד בפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול לשינוי כלורלה וולגריס. מטרתנו הייתה ליצור זנים טרנסגניים יציבים של כלורלה וולגריס באמצעות אגרובקטריום טומפצינס ופלסמיד ספציפי, pCAMBIA1302, שאיפשר להם להחדיר גן מעניין ופוטנציאל ליישומים ביוטכנולוגיים. הנדסה מטבולית וביולוגיה סינתטית, מיקרוסקופיה והדמיה, עריכת גנים CRISPR-Cas9, ביואינפורמטיקה, מודלים חישוביים, חישה מרחוק והדמיית לוויינים, ננוטכנולוגיה, עיבוד ביולוגי ועיבוד במורד הזרם.מחקר זה מציג פרוטוקול טרנספורמציית מדיה אופטימלי של אגרובקטריום tumefaciens עבור מיקרו-אצות כלורלה וולגריס באמצעות פלסמיד וסמן ספציפיים. הוא מניח את היסודות לשיפור מיקרו-אצות באמצעות טכנולוגיה, תוך התגברות על מגבלות קודמות בכלי טרנספורמציה אמינים עבור C.vulgaris.

agrobacterium-tumefaciens-mediated-genetic-engineering-green

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מאמר זה מתאר את השינוי הגנטי של unicellular אצה...

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

בסרטון זה אנו מדגימים יצירה של צמחי ארבידופסיס טרנסגניים המבטאים טרנסגן יציב באמצעות טרנספורמציה גנטית בינארית בינארית מבוססת כרומוזומים מלאכותיים בתיווך אגרובקטריום.

טרנספורמציה גנטית בינארית חיידקית מבוססת וקטור כרומוזום מלאכותי בצמחי Arabidopsis: טכניקה ליצירת צמחים טרנסגניים עם החדרת עותק יחיד

בסרטון זה אנו מדגימים טרנספורמציה גנטית של גנום האורז באמצעות וקטור בינארי Agrobacterium tumefaciens. חיידק זה מאפשר העברה של פלסמיד DNA זר באמצעות חלבוני אלימות אגרובקטריום.

טרנספורמציה גנטית בתיווך אגרובקטריום: שיטה לשינוי גנטי של גנום האורז באמצעות גידולי אגרובקטריום מהונדסים גנטית

שינוי בתיווך Agrobacterium באמצעות שיטת פרחוני-מח ש יכול להיות מועסק בהצלחה כדי ליצור שורות הטרנסגניים יציב של המודל extremophyte Schrenkiella parvula. אנו מציגים פרוטוקול שונה מזו עבור תודרנית לבנה, בהתחשב גידול שונים והרגלי הפיזיולוגיות של extremophyte.

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבנות מעבדה-סולם בועה עמודה photobioreactors ולהשתמש בהן כדי microalgae תרבות. הוא מספק גם שיטה לקביעת שיעור הצמיחה תרבות ותוכן השומנים נייטרלי.

טיפוח של ירוק Microalgae בועה עמודה Photobioreactors ואת וזמינותו עבור ליפידים נייטרלי

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים להפוך את תפוחי האדמה צמחים. הטרנספורמציה Agrobacterium tumefaciens מוביל צמח מהונדס מלאה בעוד Agrobacterium rhizogenes מייצרת הטרנסגניים שורשים שעירים יורה פראי סוג זה יכול להיות עצמי שעבר בירושה. אנחנו מכן לזהות יזם פעילות על-ידי גאס צביעת שורשים טרנספורמציה.

Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes-מתווכת טרנספורמציה של תפוחי אדמה, יזם פעילות של גן Suberin על ידי גאס Staining

גנים מורפולגניים הצמח יכול לשמש כדי לשפר את הטרנספורמציה גנטית של גנוטיפים הסרבן. המתואר כאן הוא Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית (quickcorn) פרוטוקול עבור שלושה חשובים הציבור תירס שורות.

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

בגלל היישום הרב-תכליתי שלו כמין מודל בתחומי מחקר שונים, יש צורך בארגז כלים לשינוי גנטי בפלנטיין צר עלים (Plantago lanceolata).  כאן, באמצעות טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium tumefaciens, מוצג פרוטוקול שמביא לקווים טרנסגניים יציבים עם יעילות טרנספורמציה של 20%.

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל וניתן לשכפול לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora, שמתאים גם ל-P. capsici.

שיטה מפושטת לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora

למד שיטת שינוי גנטי באמצעות Agrobacterium tumefaciens להשתלת גנים בגנום הגרעיני של המיקרו-אצה Chlorella vulgaris. פרוטוקול זה מאפשר ייצור טרנספורמנטים יציבים למחקר פונקציונלי.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

גלה סרטונים נוספים